Name: Électrophorèse sur gel dénaturant Urée polyacrylamide (PAGE urée) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-29T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Apprenez l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide à l'urée dénaturante pour séparer l'ADN ou l'ARN monocaténaire selon leur masse moléculaire. Cette méthode essentielle en biologie moléculaire permet d'analyser les oligonucléotides synthétisés.

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Ce travail a été soutenu par le conseil de Singapour académique de recherche (ARC) [numéro de la subvention 90/07]. Nous remercions pour le soutien radiodurans.

Le protocole de texte complet et détaillé de cette procédure expérimentale est disponible dans Current Protocols in Molecular Biology. Détaillées étape par étape les instructions pour l&#39;assemblage du sandwich de gel et pour les appareils de gel peut être trouvé sur le site BioRad 3. Équipement requis: Les plaques de verre (intérieur et extérieur) 10 cm de cellules: 10,1 x 7,3 cm (plaque interne), 10,1 x 8,2 cm (plaque extérieure), BioRad 20 cellules cm: 20 x 20 cm (plaque interne), 20 x 22,3 cm (plaque extérieure), BioRad De 0,5 à 1,5 mm de gel de peigne et entretoises Se jetant Gel Gel appareil avec le couvercle et les câbles Alimentation haute tension Bloc de chauffage ou l&#39;eau du bain Pipettes sérologiques et l&#39;aide de pipette Pipette et pointes de pipette Sèche-Gel ou un scanner Réactifs et solutions: Urée (ultra-pure) Solution de polyacrylamide 40% (29:1) 10 x TBE solution (Tris-Borate, EDTA) Déminéralisée, eau distillée TEMED 30% (p / v) solution de persulfate d&#39;ammonium 0,5 x TBE solution Formamide EDTA Cyanol Xylène Bleu de bromophénol Méthanol Éthanol <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Volume </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 50 ml </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 60 ml </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 10 ml </td></tr><tr><td> Concentration de l&#39;acrylamide </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td></tr><tr><td> g d&#39;urée </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 28,8 </td><td> 28,8 </td><td> 28,8 </td><td> 4.8 </td><td> 4.8 </td><td> 4.8 </td></tr><tr><td> ml à 40% Acryl (29:1) </td><td> 12,5 </td><td> 15.625 </td><td> 18,75 </td><td> 15 </td><td> 18,75 </td><td> 22,5 </td><td> 2.5 </td><td> 3,125 </td><td> 3,75 </td></tr><tr><td> APS ul 30% </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 199,2 </td><td> 199,2 </td><td> 199,2 </td><td> 33 </td><td> 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> ul TEMED </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 10 x TBE </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="10"> Remplissez le volume avec déminéralisée, eau distillée </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Réactifs et solutions nécessaires pour les diverses concentrations d&#39;acrylamide et les volumes pour résoudre seule oligonucléotides bloqués Assemblage en sandwich de gel et gel préparation <ol><li> Assemblez le gel selon la description des fabricants et de fixer le gel dans la chambre de coulée de gel 3. Utiliser 0,5-1,5 mm d&#39;épaisseur des entretoises. </li><li> Préparer la solution de polyacrylamide appropriée, conformément aux protocoles actuels de la biologie moléculaire ou en tant que figurant dans le tableau 1. Pour un gel d&#39;acrylamide dénaturant de 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml de solution de gel et d&#39;une 10,1 x 8,2 cm x 1 mm de gel de 5 ml solution de gel est suffisante. Agrandir les gels sont utilisés lorsque les produits attendus / bandes sont dans la fourchette de quelques bases, puis un gel de plus permettra de résoudre les bandes avec une différence d&#39;un seul nucléotide. Si les bandes attendus diffèrent dans plus de 10 nucléotides, les petits gels seront adaptés pour résoudre les fragments. Choisissez le pourcentage de polyacrylamide qui convient à vos besoins de séparation, une concentration plus élevée de polyacrylamide résoudra bas poids moléculaire des fragments. Utilisez l&#39;urée ultrapure et mélanger avec la quantité désirée de l&#39;acrylamide. Ajouter tampon TBE au mélange de gel pour obtenir une concentration finale de 0,5-1 x TBE et de remplir le volume avec déminéralisée, eau distillée. Chauffer la solution pendant 20 secondes au micro-ondes et mélangez délicatement. Pour les volumes de gel plus répéter cette étape jusqu&#39;à ce que la solution est la main chaude. </li><li> Verser le gel immédiatement à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique et une aide pipette automatique entre les deux plaques de verre. Évitez d&#39;introduire des bulles d&#39;air. Insérer le peigne et laisser le gel polymériser pendant 30-60 minutes. </li></ol> Mettre en place l&#39;appareil d&#39;électrophorèse et le gel prerun <ol><li> Démonter le gel de la chambre de coulée et l&#39;assemblage de l&#39;appareil gel selon les instructions du fabricant 3. </li><li> Remplir le tampon inférieure chambre tampon d&#39;esprit de fonctionnement (0,5-1 x TBE) que les plaques de verre seront sousfusionnées 2-3 cm avec le tampon. Remplir la chambre tampon supérieure au sommet du gel avec courir tampon. </li><li> Retirer délicatement le peigne et rincer les puits avec du tampon fonctionne, en utilisant une pipette et un gel des conseils de chargement. </li><li> Fixez le couvercle du système de gel et de brancher les câbles à une alimentation haute tension. Avant que vous pouvez charger vos échantillons, vous devez prerun le gel pendant au moins 30 minutes pour chauffer le gel et pour éliminer l&#39;urée reste du gel. La température optimale doit être comprise entre 45-55 ° C. Évitez les températures supérieures à 60 ° C comme les bandes pouvaient frottis ou les plaques de verre pourrait se fissurer. Choisissez watts constante pour la prerun (15-25 W par gel). </li></ol> La préparation des échantillons <ol><li> En attendant de préparer vos échantillons. Par conséquent, ajouter la quantité appropriée de 2 mix x chargement de gel à votre échantillon. Le mélange de chargement contient généralement formamide 90%, 0,5% d&#39;EDTA, 0,1% cyanol xylène et 0,1% bleu de bromophénol. </li><li> Avant les échantillons peuvent être chargés sur le gel, les échantillons doivent être dénaturée par la chaleur en chauffant les échantillons entre 70-90 ° C pendant quelques minutes. </li></ol> Charger et exécuter le gel <ol><li> Lorsque le prerun est terminée, retirez le couvercle et rincez soigneusement les poches, comme décrit précédemment que l&#39;urée est lessivé dans les puits. </li><li> Appliquer les échantillons soigneusement au fond de la poche. Évitez d&#39;introduire des bulles d&#39;air. Chargement du tampon doit être appliquée aux poches vides pour maintenir des conditions d&#39;égalité pendant la course. </li><li> Assemblez le couvercle et lancez le gel à watts constants pour maintenir une température de gel de 55 ° C similaire à la prerun. Observez la migration des colorants marqueur jusqu&#39;à ce que le front a atteint l&#39;extrémité inférieure du gel. La durée d&#39;exécution dépend du pourcentage d&#39;acrylamide utilisé, la force ionique du tampon et de l&#39;épaisseur du gel. Une course peut durer entre 2-4 heures. Vérifiez la température du gel. Un thermomètre de gel peut aider à surveiller la bonne température pendant la course. </li></ol> Traiter le gel de <ol><li> Lorsque le front de teinture a atteint la fin du gel placer le gel de la chambre inférieure du tampon. Retirer le gel de la chambre et desserrer les pinces. Retirez les entretoises et soigneusement dissimuler les plaques de verre. Si nécessaire couper les puits supérieur contenant une partie du gel. </li><li> Soigneusement transférer le gel dans un plat avec une solution de fixation du gel (même concentration de méthanol TBE, plus de 5-10% et éthanol). Laisser le gel dans la solution pendant 5-10 minutes et changer le tampon à deux reprises. </li><li> Le gel est prêt pour un traitement ultérieur en utilisant un séchoir sous vide ou de gel de numérisation directe du gel. </li></ol>

<ol><li>Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+length+determination+of+small+double-+and+single-stranded+DNA+molecules+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbright%2C+LM+%22Curr+Protoc+Nucleic+Acid+Chem%22">Curr Protoc Nucleic Acid Chem</a>. , (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PROTEAN+II+xi+Cell+and+PROTEAN+II+xi+2-D+Cell+Instruction+Manual%22">PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual</a>. , Biorad. (2001).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

<ol><li> La netteté bande dépend de plusieurs facteurs. Le volume d&#39;échantillon chargé pour les bandes pointus devrait être aussi petit que possible, c&#39;est à dire idéalement entre 1-5 pl. Toutefois, jusqu&#39;à 15 ul ne peut être chargé qui assure toujours une résolution acceptable. Moins de résultats volume d&#39;échantillon plus nettes bandes. </li><li> La qualité bande est également dépendant de l&#39;épaisseur du gel. Diluant gels, tels que 0,75 mm montrent de meilleurs résultats que 1,5 mm d&#39;épaisseur des gels. </li><li> La for...

Électrophorèse sur gel dénaturant urée polyacrylamide (page urée)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

PAGE urée ou électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide urée emploie 6-8 M d&#39;urée, qui dénature l&#39;ADN secondaire ou structures d&#39;ARN et est utilisé pour leur séparation dans une matrice de gel de polyacrylamide en fonction du poids moléculaire. Fragments de 2 à 500 bases, avec des différences de longueur aussi petite que d&#39;un seul nucléotide, peuvent être séparés en utilisant cette méthode 1. La migration de l&#39;échantillon est dépendante de la concentration d&#39;acrylamide choisi. Un pourcentage plus élevé de polyacrylamide résout fragments de poids moléculaire plus faible. La combinaison de l&#39;urée et des températures de 45-55 ° C pendant la course de gel permet la séparation de l&#39;ADN non structurées ou des molécules d&#39;ARN. En général, cette méthode est nécessaire d&#39;analyser ou de purifier l&#39;ADN simple brin ou de fragments d&#39;ARN, comme les oligonucléotides synthétisés ou étiquetés ou produits à partir des réactions de clivage enzymatique. Dans cet article, vidéo, nous montre comment préparer et exécuter les gels de polyacrylamide dénaturant l&#39;urée. Conseils techniques sont inclus, en plus des 1,2 protocole original.

Électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide urée est utilisée pour séparer l&#39;ADN simple brin ou l&#39;ARN jusqu&#39;à une limite de 500 nucléotides. L&#39;urée en combinaison avec des échantillons dénature la chaleur et non structurées brins simples migrer dans la matrice de gel en fonction de leur poids moléculaire.

Électrophorèse sur gel dénaturant Urée polyacrylamide (PAGE urée)

L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide à l'urée, ou électrophorèse dénaturante à l'urée, utilise de l'urée 6-8 M, laquelle dénature les structures secondaires de l'ADN ou de l'ARN et est utilisée pour leur...

En général, ce type de gel est nécessaire pour séparer des fragments d'ADN ou d'ARN simple brin, tels que des oligonucléotides synthétisés ou marqués, ou les produits de réactions de clivage enzymatique. La plage de séparation dépend de la concentration en polyacrylamide, de l'urée en combinaison avec une dénaturation thermique de l'échantillon, et les molécules simples brins migrent dans la matrice du gel selon leur masse moléculaire. Cette vidéo présente la préparation, l'électrophorèse et le traitement d'un gel typique.Bonjour, je m'appelle Haki. Je suis à l'Université technologique de Nang. Dans cette démonstration, je vais vous montrer comment réaliser une électrophorèse sur gel polyacrylamide dénaturant.Utilisez des plaques de verre propres et assemblez le sandwich gel selon les instructions du fabricant. Fixez le gel dans la chambre standard de coulée de gel. Démoulez les plaques de verre des gels de grande taille si le gel a tendance à adhérer aux plaques de verre.Choisissez une taille et une épaisseur de gel en fonction de vos besoins en matière de séparation. Préparez la solution de gel selon les protocoles actuels en biologie moléculaire.Choisissez une concentration de polyamide adaptée à vos besoins de séparation. Un pourcentage plus élevé d'acrylamide permettra de mieux résoudre les fragments de faible masse moléculaire. Utilisez de l'UIA Alta pure et mélangez-la avec la quantité souhaitée de polyacrylamide dans un bécher ou une bouteille.Ajouter 10 volumes de tampon XTBE à la solution et compléter jusqu'au volume requis avec de l'eau. Chauffer la solution pendant 20 secondes au micro-ondes et la mélanger doucement jusqu'à ce que tout l'UIA soit dissous. Vous pouvez conserver la solution si nécessaire pour de plus grands volumes de gel.Répétez l'étape au micro-ondes jusqu'à ce que la solution soit tiède au toucher. Évitez de chauffer excessivement la solution. Ne pas surchauffer car l'urée commencera à se dégrader au-delà de 60 degrés.Le degré centigrade peut être détecté à l'odeur d'ammoniaque. Lorsque la solution est claire et qu'elle a refroidi à environ la température ambiante, ajoutez un PS et du tamid à la solution de gel et mélangez délicatement. Si la solution de gel est trop chaude, le gel polymérisera à l'intérieur de la pipette.Versez le gel à l’aide d’une pipette serologique, puis utilisez un aide-pipettage entre les deux plaques de verre. Évitez d’introduire des bulles d’air. Insérez le peigne avec précaution.Veillez à ne pas emprisonner de bulles d'air et laissez le gel polymériser de 30 à 60 minutes. Démontez le gel du support de coulée et assemblé-le à la chambre tampon supérieure. Conformément au protocole du fabricant, placez le gel dans la chambre tampon inférieure et remplissez le réservoir inférieur avec du tampon de migration, généralement du TBE 0,5 à 1 X.À la même concentration que pour le gel, remplir la chambre supérieure de tampon de migration jusqu'au bord de la plaque de verre. Avant de charger vos échantillons, vous devez faire une pré-course du gel d'au moins 30 minutes afin de réchauffer le gel et d'éliminer l'urée résiduelle. La température optimale doit se situer entre 45 et 55 degrés Celsius, comme pour la course réelle du gel.Évitez les températures supérieures à 60 degrés, car les bandes pourraient s'étaler ou les plaques de verre pourraient se fissurer soigneusement. Retirez le tampon sans perturber les bords et rincez les puits à travers celui-ci pour éliminer l'urée qui s'est infiltrée dans ceux-ci. Utilisez des pointes de chargement pour gel et pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas.Pour chacun, fixez le couvercle du système de gel et branchez les câbles à une alimentation haute tension. Choisissez des watts constants pour la pré-course, environ 15 à 20 watts par gel. Lorsque l'alimentation est mise sous tension, la formation de bulles d'air indique une bonne conductivité.Entre-temps, préparez vos échantillons en ajoutant la quantité appropriée de deux x tampon de charge pour votre échantillon. Lorsque le pré-électrophorèse est terminée, retirez le couvercle et rincez soigneusement la poche comme décrit précédemment ; il est très important de bien rincer les poches du gel afin d'éliminer les résidus d'urée, car l'urée forme une couche dense qui empêche l'échantillon de pénétrer dans le gel.Juste devant vous. Appliquez le chauffage de votre échantillon en l'incubant à au moins 70 degrés Celsius pendant plusieurs minutes. Appliquez les échantillons soigneusement depuis le fond de la poche.Pour certaines applications, le colorant interfère avec votre échantillon et peut provoquer des bandes diffuses, ou bien le colorant émet un signal fluorescent. Dans ce cas, il est utile d'éliminer un colorant ou tous les colorants et de charger le tampon contenant le colorant standard. Dans un puits vide, un étalon de taille, la quantité d'échantillon que vous devez charger pour obtenir des bandes nettes se situe idéalement entre un et cinq microlitres, mais vous pouvez également charger des volumes plus élevés allant jusqu'à 15 microlitres.Un volume d'échantillon plus faible donne des bandes plus nettes. Évitez d'introduire des bulles d'air et laissez l'échantillon pénétrer lentement dans la poche afin qu'une couche homogène se forme. Si vous utilisez un marqueur fluorescent, enveloppez le système de gel dans du papier d'aluminium pour éviter l'exposition à la lumière, qui pourrait provoquer la décoloration photochimique de votre échantillon.Assemblez le couvercle et allumez l'alimentation électrique. Faites migrer le gel jusqu'à ce que le front de DIA atteigne l'extrémité inférieure du gel. La durée de l'électrophorèse dépend du pourcentage d'acrylamide.Vous choisissez la force ionique, l'épaisseur et la longueur de votre gel tampon. Une électrophorèse peut durer entre une heure et plusieurs heures. Observez la migration des marqueurs pour déterminer la durée de l'électrolyse.Utilisez une puissance constante en watts et vérifiez la température du gel. Un thermomètre pour gel peut aider à surveiller la température adéquate pendant l'électrophorèse, ou consultez le mode d'emploi de l'appareil à gel lorsque la course est terminée. Éteignez l'alimentation électrique et retirez le couvercle de l'appareil à gel.Ensuite, retirez le gel sandwich de la chambre tampon inférieure. Jetez le tampon de la chambre tampon supérieure. Remplissez un récipient avec de la solution de fixation du gel.Cette solution doit avoir la même concentration de TB et contenir entre cinq et 10 % de méthanol et d'acide acétique. Retirer le sandwich de gel de l'appareil et desserrer les pinces. Enlever les entretoises et démonter soigneusement les plaques de verre à l'aide d'une spatule. Si nécessaire, découper le peigne au-dessus d'un puits contenant la partie de gel ou la partie inférieure vide du gel, et jeter les morceaux inutiles de gel, comme les bandes contenant le colorant.Pour les échantillons fluorescents, détacher délicatement le gel de la plaque de verre et le transférer dans une boîte remplie de solution de fixation du gel. Laisser le gel dans la solution pendant cinq à dix minutes et changer le tampon deux fois. Agiter doucement la boîte pour éliminer l'urée du gel ou placer le gel dans la solution de coloration selon l'application prévue.La qualité du gel dépend également de son épaisseur. Les gels plus fins, comme ceux de 0,75 millimètre, donnent de meilleurs résultats que les gels de 1,5 millimètre d'épaisseur, mais sont plus difficiles à manipuler. La netteté des bandes dépend de plusieurs facteurs.Une faible tension au début de la course peut permettre d'obtenir des bandes plus nettes, car l'échantillon pénètre uniformément dans le front du gel, évitant ainsi l'effondrement des puits en raison d'une tension trop élevée. Un gel de concentration court, à faible pourcentage d'acrylamide, peut avoir le même effet de resserrement des bandes ; l'ajout de 10 % de glycérol aide également lors du chargement du gel, en faisant descendre l'échantillon au fond des puits. Appliquez plus facilement du tampon de charge dans les puits vides afin de maintenir des conditions égales durant la course.Lorsque votre gel est dans la solution de fixation, vous pouvez le sécher à l’aide d’un séchoir à gel sous vide pour un examen ultérieur ou numériser directement le gel, selon l’étiquetage ou la coloration utilisée. Cette page U est utile pour analyser ou isoler des échantillons d’ADN ou d’ARN simples brins. Les gels peuvent être conservés à température ambiante.Par conséquent, enveloppez le gel dans une serviette en papier et imbibez-le d'eau ou de tampon de migration. Placez le gel enveloppé et humide dans un sac plastique hermétique et utilisez-le dans les 48 heures. Un problème fréquemment observé est le « sourire » du gel.Cela est dû à une répartition inégale de la chaleur dans le gel. Si le gel n'est pas entouré de tampon, la fixation d'une plaque métallique peut améliorer la qualité du gel. Bonjour, je suis Hi Kasam.Je suis de l'Université technologique Nanyang. Je vous ai montré comment réaliser une électrophorèse dénaturante. À la prochaine fois.

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