Name: Évolutif fluidique Arrays Injecteur pour virale ciblage dIntact circuits du cerveau en 3-D (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Découvrez une méthode d'injection fluidique parallèle pour le ciblage viral de circuits cérébraux intacts en trois dimensions. Cette technique permet la manipulation optique précise des circuits neuronaux in vivo.

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ESB admet un financement par le Prix du directeur des NIH Innovateur Nouvelle (DP2 OD002002-01), le NIH subvention défi 1RC1MH088182-01, le NIH Opportunités Grand-Grant 1RC2DE020919-01, le NIH 1R01NS067199-01, la NSF (0835878 et 0848804), le Programme McGovern Institute Award Neurotechnology , le ministère de la Défense, NARSAD, la Fondation Alfred P. Sloan, Jerry et Marge Burnett, le Prix de recherche SFN pour l&#39;innovation en neuroscience, le MIT Media Lab, la Fondation Benesse, et le Wallace H. Coulter Foundation.

1. Construire Clamp stéréotaxique <ol><li> La pince stéréotaxique est utilisé pour attacher le tableau injecteur à l&#39;stereotax, de sorte que les injecteurs sont parallèles au bras stéréotaxique. </li><li> Chaque laboratoire ne nécessite qu&#39;une seule pince, sauf s&#39;il est prévu que plus d&#39;une chirurgie peuvent avoir lieu simultanément. Dans ce cas, faire le même nombre que le nombre maximum prévu de chirurgies simultanées. Il pourrait aussi être conseillé de faire une supplémentaire, en cas de dommages à la première. </li><li> Pour rendre le collier stéréotaxique, premièrement, d&#39;un diamètre de 1,5 mm extérieur (OD) canule en acier est coupé à deux pouces de longueur, et l&#39;une des extrémités est Dremeled jusqu&#39;à ce plat. </li><li> Ensuite, un petit morceau (environ 0,5 x 0,5 cm) est découpée de PCB proto-pension, pour être utilisé comme une entretoise. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un laser cutter afin de s&#39;assurer que toute réduction faite sont perpendiculaires à la surface du matériau, deux rectangles identiques (1 / 2 &quot;x 3 / 8&quot;) sont coupés de 1 / 8 &quot;bâches acrylique, chaque rectangle ayant deux trous circulaires dans les coins opposés du rectangle. Le premier trou a un diamètre de 1,5 mm, et est juste assez grand pour contenir la canule métallique hermétiquement. Le deuxième trou a un diamètre 1 / 16 &quot;(figure 1C). </li><li> La canule métallique est insérée dans le trou de 1,5 mm d&#39;un rectangle, puis dans le trou de 1,5 mm de la seconde. L&#39;extrémité inférieure de la canule est aligné avec la face inférieure du rectangle en bas, formant la forme d&#39;un bâton de hockey. </li><li> Tout en gardant l&#39;entretoise bien eu lieu entre les deux rectangles, cette structure est cimenté par l&#39;aide de la colle chaude autour des trous de 1.5mm canule et, en prenant soin d&#39;éviter de coller l&#39;entretoise sur les rectangles. Pâte à modeler peut être utile pour maintenir les choses ensemble durant ce processus. </li><li> Une fois la colle séchée, une vis 1-72 est insérée dans le trou de 1 / 16 de la partie supérieure des rectangles. Puis un écrou hex 1-72 est vissé sur l&#39;extrémité de la vis de 1-72, et resserré. Les vis et écrou servent à maintenir la pince ensemble. </li><li> Pour fixer l&#39;écrou sur la face inférieure du rectangle en bas, de petites quantités de 5-minute époxy sont abandonnés sur le bord de l&#39;écrou, sans permettre à l&#39;époxy de pénétrer dans les filets de l&#39;écrou ou la vis. Toute la pâte à modeler est enlevée, et il est confirmé que l&#39;entretoise peut être maintenu fermement en place en serrant la vis. </li></ol> 2. Préparer le système pour le tableau personnalisé injecteur: Hamilton pompe et stereotax <ol><li> Le système de réseau injecteur peut être personnalisé pour n&#39;importe quel ensemble de coordonnées dans le cerveau. </li><li> Le premier utilisateur localise coordonnées des sites d&#39;injection souhaitée dans une souris (ou d&#39;autres espèces) Atlas du cerveau, la conversion des coordonnées appropriées utilisées par les stereotax (ici, X, Y et Z les coordonnées). Le nombre de sites d&#39;injection (trois dans les Figures 1A et 1B) seront ci-après appelé k. </li><li> nombre k de 10 seringues Hamilton ul sont placés dans une seringue d&#39;injection / soutirage comme celui d&#39;un appareil de Harvard. </li><li> Ensuite, trois pieds de long morceaux de tuyaux en polyéthylène sont solidement attachés à l&#39;aiguille de chaque seringue Hamilton. </li><li> Pour chaque morceau de tube en polyéthylène, un F-252 manches tube de Upchurch Scientific est glissé sur l&#39;extrémité ouverte et attachée à un adaptateur de tuyau P-627 en utilisant l&#39;écrou et la ferrule incluse, également de Upchurch Scientific. </li></ol> 3. Construire le tableau personnalisé injecteur <ol><li> Chaque tableau injecteur est adapté à l&#39;ensemble de coordonnées que l&#39;utilisateur choisit. Cependant, pour des ensembles de coordonnées qui ne diffèrent que par une traduction et / ou de rotation, le même tableau injecteur peut être utilisé. </li><li> Considérant que le X relative et coordonnées Y des sites d&#39;injection, les trous sont percés dans k un PCB proto-conseil d&#39;épaisseur de 1 / 32 &quot;, avec le même espacement relatif. Ces trous sont forés à l&#39;aide d&#39;un moulin et d&#39;un mini Modela 0.011&quot; foret de diamètre de l&#39;Université McMaster-Carr. Veillez à utiliser un faible taux de forage (Z-vitesse) pour éviter de casser ou de l&#39;usure du foret. Avant de retirer la carte du moulin, un rectangle est percé de petits trous autour de l&#39;aide d&#39;un peu plus grand foret de diamètre 1 / 32 &quot;, d&#39;éviter de porter le plus petit code pour l&#39;usine mini peut être généré facilement à l&#39;aide de MATLAB;. Échantillon code est fourni dans les fichiers suivants. <ol class="lroman"><li> generate.m - code MATLAB pour générer du code à partir des coordonnées souhaitées Modela </li><li> holes_ex.rml - Code Modela pour sonnerie de forage (huit trous) en proto-pension </li><li> outline_ex.rml - Code Modela pour rectangle autour des trous de forage </li></ol></li><li> 245 um um OD/100 diamètre interne (ID) tube capillaire en silice fondue, disponible à partir Polymicro Technologies, est coupé en nombre k de 3 morceaux de pouce. Celles-ci comprennent les injecteurs individuels. Une pièce à usage de tubes capillaires est fourré danschacun des trous, pour déblayer les débris, sans obstruer les injecteurs réelle. Les injecteurs sont ensuite insérés à moitié dans chaque trou, de sorte qu&#39;ils sont fermement maintenue et parallèles les uns aux autres. Les injecteurs sont époxy au conseil d&#39;administration, formant la structure de la matrice de l&#39;injecteur. Tout ce qui reste est de couper les injecteurs à la bonne longueur. </li><li> Le tableau de l&#39;injecteur est fixé à la pince stéréotaxique en plaçant un coin de la proto-pension entre les rectangles acrylique, puis en serrant la vis de la pince stéréotaxique. Ensuite, la canule en métal de la pince est attaché à la stereotax, en utilisant le mécanisme de fixation de l&#39;stereotax. </li><li> Tous les suivants se fait sous un microscope. Pour l&#39;un des injecteurs extérieure (qui est, celui qui peut être approché par le côté avec une arête droite, sans heurter aucune des autres injecteurs), la pointe au-delà du fond de la proto-pension est coupé avec des ciseaux. Pour les injections corticales, il est approprié d&#39;avoir l&#39;injecteur s&#39;étendant approximativement 5mm au-delà de la surface de la proto-pension. Pour plus d&#39;injections, ce nombre peut être augmenté par l&#39;augmentation correspondante de la profondeur. La pointe est aplatie avec un outil Dremel. Conseils injecteur peut également être sol avec un angle comme une précaution supplémentaire contre le colmatage, si la précision dans la profondeur est moins importante. </li><li> Ensuite, un point de référence stable est choisi dans la portée du bras stéréotaxique, et le tableau de l&#39;injecteur est déplacé de sorte que la pointe aplatie de l&#39;extérieur injecteur, est à ce point de référence. </li><li> Une seconde injection est choisie, avec ses coordonnées correspondantes. Considéré comme la différence relative en hauteur (direction z) entre les coordonnées injecteur premier et deuxième. Le tableau de l&#39;injecteur est déplacée le long de l&#39;axe Z par cette distance relative. L&#39;injecteur est coupé et la seconde Dremeled à la bonne longueur, de sorte que la pointe de l&#39;injecteur seconde est maintenant à plat et à la hauteur du point de référence. Le tableau injecteur peut être déplacé dans les directions X et Y pour faciliter la comparaison de la pointe d&#39;injecteur avec le point de référence. </li><li> Ce processus d&#39;ajustement est répétée pour les injecteurs restants. </li></ol> 4. Assemblage de l&#39;ensemble du système <ol><li> La pince stéréotaxique et personnalisés array injecteur, tous deux déjà construits, sont requises pour cette partie. </li><li> L&#39;extrémité arrière de chaque injecteur (la fin qui n&#39;a pas été taillée) est inséré dans un bleu à manches F-240 tubes et, en utilisant un écrou de P-235 et P-200 férule d&#39;Upchurch Scientific, est fixé à l&#39;adaptateur fileté déjà connecté à la pompe à Hamilton par des tuyaux en polyéthylène. Les instructions du fabricant peuvent être consultés pour plus de détails. </li><li> En utilisant une aiguille de calibre 27, l&#39;huile de silicone est injectée dans le dos des seringues Hamilton afin que le système entier est rempli de la seringue de Hamilton à la pointe de l&#39;injecteur, sans bulles d&#39;air du tout. </li><li> Comme les seringues Hamilton sont re-placé dans la pompe à Hamilton, le plus grand volume possible de l&#39;huile de silicone est maintenu dans les seringues. </li><li> Si l&#39;expérience nécessite plus de seringues que la pompe est conçue pour les (deux dans ce cas), les seringues peuvent être espacées de petits morceaux de plastique (p.ex., casquettes aiguille) pour les maintenir parallèles les uns aux autres, et de s&#39;assurer que toutes les pièces sont poussé par la pompe dans la même mesure. Ou encore, un kit de mise à niveau multi-rack peuvent être achetés auprès de Harvard Apparatus à détenir jusqu&#39;à 10 seringues à la fois. </li></ol> 5. Injections / chirurgie <ol><li> Le processus d&#39;injection avec un parallèle injecteur est très similaire à celle de l&#39;injection avec une pipette simple. </li><li> Il est essentiel d&#39;utiliser des recharges lente / infuser taux tout au long de ce processus, parce que le pompage rapide pourrait mettre l&#39;accent sur l&#39;articulation entre les tubes de petits et grands. Poids max Taux: 2 l / min pour le chargement de virus, et 0,1 l / min pour infuser le virus. </li><li> Une souris anesthésiée est placé dans le stereotax, et reste anesthésié toute l&#39;expérience. </li><li> Préparer la souris si nécessaire. Par exemple, avec un scalpel, une seule coupe est faite en bas de la ligne médiane de la peau, d&#39;entre les yeux entre les oreilles. La peau est tirée en arrière pour exposer le crâne, et le fascia est nettoyée. Une pipette de verre tiré est attachée à la stereotax. Les positions des barres d&#39;oreilles sont ajustés jusqu&#39;au bregma et lambda sont alignés à la même hauteur, et afin que la ligne reliant entre eux est parallèle à l&#39;axe des Y de l&#39;stereotax. Les axes de la stereotax sont orientés selon le système de coordonnées dans lequel les coordonnées d&#39;injection ont été calculés. La stéréotaxie est remis à zéro à la pointe de la pipette en verre au bregma, puis l&#39;embout est positionné légèrement au-dessus du crâne à l&#39;X et Y coordonnées de l&#39;un des sites d&#39;injection. </li><li> En utilisant une fraise de dentiste, le crâne en dessous de la pointe est bien rogné jusqu&#39;à ce qu&#39;il y reste une couche extrêmement fine d&#39;os. La pipette en verre peut être inférieureed et a grandi pour vérifier que le trou foré est centrée à la position correcte. En utilisant une aiguille de calibre 30, un petit morceau de la couche est doucement égrappés, à l&#39;X et Y coordonnées correctes, de sorte que la dure-mère est exposée. Ce trou doit être juste assez grand pour accueillir l&#39;un des injecteurs (0,25 de large). Voir Figure 1D pour le diagramme. De cette façon, les petits, 0.25mm trous larges sont faites dans le crâne, à l&#39;X et Y coordonnées correspondant à chaque site d&#39;injection. </li><li> La pipette en verre est jeté dans un contenant pour objets pointus, et le tableau personnalisé injecteur est attaché à l&#39;aide de la pince stereotax stéréotaxique. </li><li> Afin de régler correctement l&#39;angle de la matrice de l&#39;injecteur, deux injecteurs extérieurs sont choisis pour être calibré à un point de référence donné, comme suit. Après l&#39;un des injecteurs est jumelé avec le point de référence, considérer la relative X et Y les distances entre les sites d&#39;injection par rapport à cet injecteur et un autre. Les axes de la stereotax est ajustée de sorte que toute matrice injecteur est déplacé dans le X et Y. directions par ces distances relatives. Si l&#39;injecteur seconde n&#39;est pas maintenant aligné sur le point de référence, la canule métal est desserré et tourné. Ce processus est répété itérativement jusqu&#39;à ce que le réseau de l&#39;injecteur est inclinée correctement. </li><li> Avant de remplir les injecteurs par le virus, les injecteurs sont remplis d&#39;huile de silicone jusqu&#39;à ce que les seringues sont au point 2 pl (ou plus). Cela donne une zone tampon, de sorte que les bulles d&#39;air ou l&#39;obstruction à la pointe peut être facilement retiré en poussant l&#39;huile avant d&#39;utiliser la pompe à Hamilton, sans avoir à recharger l&#39;ensemble du système avec de l&#39;huile de silicone à l&#39;arrière de la seringue, comme décrit précédemment. </li><li> Une pièce stérile de Parafilm est placée sur le crâne, et les injecteurs sont doucement abaissée sur le Parafilm. Pour les coordonnées des profondeurs très variables, une coutume blanchi une partie (par exemple un objet en escalier) pourrait faciliter le chargement. </li><li> Les pièces suivantes supposent que 1 ul de virus est d&#39;être chargé à chaque site (les quantités suivantes doivent être revus à la baisse si les plus petites quantités sont souhaités). Afin de garantir que&gt; 1 pl de virus est injecté dans chaque site, 1,5 l de virus est à la pipette sur l&#39;Parafilm ou un escalier à l&#39;extrémité de chaque injecteur. </li><li> Avec le taux de remplissage de la pompe à Hamilton mis à 1 l / min, 1,2 ul du virus est rempli dans chaque injecteur. </li><li> La pointe de la plus longue de l&#39;injecteur est remis à zéro au bregma, puis le tableau de l&#39;injecteur est déplacé à l&#39;X et Y coordonnées de l&#39;injecteur. Si colmatage est un problème, dire si de nombreuses cibles profondes sont impliqués: avant même d&#39;insérer les astuces injecteur dans le cerveau, il est parfois conseillé de commencer l&#39;infusion de la pompe, jusqu&#39;à ce que le virus peut être vu sortant de tous les conseils injecteur. Cela supprime les bulles d&#39;air à l&#39;extrémité d&#39;injection, et assure également qu&#39;il n&#39;ya pas de colmatage. Dans le cas de colmatage, la pompe à Hamilton est d&#39;insuffler une impulsion brève à une vitesse supérieure de 2 pl / min, pour doucement vider colmatage. </li><li> Le tableau de l&#39;injecteur est alors abaissée, à travers les petits trous faits avec des aiguilles de calibre 30, à la bonne profondeur Z. </li><li> 1 pl de virus est injecté par chaque injecteur, à 0,1 ul / min. </li><li> Les injections sont laissés seuls pendant 30 minutes. </li><li> Après le tableau de l&#39;injecteur est lentement extraite du cerveau, la pompe à Hamilton est d&#39;insuffler à la même vitesse de 0,1 l / min, afin de vérifier le colmatage dans chaque injecteur. </li><li> Puis les injecteurs sont nettoyées par le remplissage et infuser 1,5 ul d&#39;éthanol à 2 pl / min. </li><li> Enfin, les injecteurs sont rechargées avec de l&#39;huile de silicone pour maintenir la zone tampon de 2 pi dans chaque seringue Hamilton. </li><li> Tous les équipements doivent être stérilisés avant et après la procédure, conformément à la biosécurité de votre institution et les protocoles d&#39;utilisation d&#39;animaux. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Le réseau parallèle injecteur accélère une chirurgie à peu près par un facteur égal au nombre d&#39;injecteurs, sans compter les temps d&#39;installation et de récupération, bien que les temps individuels dépendra de la compétence du praticien. Pour une injection 1 microlitre, nous avons généralement vu l&#39;expression des lentivirus dans une sphère d&#39;environ 1mm de diamètre (figure 1E). La précision de l&#39;injection a été telle que la variabilité dans le positionnement de pointe, d&#39;un essai à, a été d&#39;environ 45 microns (déviation standard de la distance de la position de la pointe à la position de pointe destiné). <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Conception, mise en œuvre, et l&#39;utilisation d&#39;une matrice d&#39;injection du virus parallèle. Un schéma, du système d&#39;injection réseau parallèle, montrant une configuration triple injecteur, pour trois injections simultanées. B, photographie d&#39;un tableau injecteur triple parallèle comme schématisé Une . <strong&gt; C, pince stéréotaxique, représentées en trait du haut D, l&#39;illustration de la technique pour l&#39;efficacité, les dommages-minimisant, ouverture de trous dans le crâne d&#39;injecteur d&#39;insertion dans le cerveau:. avec une fraise de dentiste, mince du crâne jusqu&#39;à l&#39;épaisseur ~ 50 microns, puis utilisez la pointe d&#39;une aiguille forte pour ouvrir une petite craniotomie. E, image de fluorescence montrant channelrhodopsin-2 (CHR2)-GFP cellules marquées dans les trois régions corticales de souris, et visés par le tableau triple injecteur montré en B.

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</ol>

Toutes les procédures ont été en conformité avec le Guide du NIH pour les animaux de laboratoire et approuvés par le soin des animaux du MIT et de l&#39;emploi et des comités de biosécurité.

Ces dernières années, un certain nombre d&#39;organismes génétiquement codés sensibilisateurs optiques ont permis neurones à être activé et fait taire in vivo d&#39;une manière temporellement précise, en réponse à des impulsions brèves de lumière (par exemple, 1,4,5,6,7,8 , 11). Une méthode clé avec laquelle les neurones ont été sensibilisés à la lumière dans le cerveau des mammifères, se fait par des virus tels que les lentivirus et virus adéno-associés (AAV), qui peuvent délivrer des gènes codant pour des opsines au cerveau des animaux allant des souris aux singes, dans un manière sûre et durable (par exemple, 2,9,10). Virus laisser le temps d&#39;exécution plus rapide que ne le font les transgéniques, en particulier pour les organismes qui ne sont pas des organismes modèles génétiques comme les rats et les singes, et pour opsines peut permettre des niveaux d&#39;expression élevés qui peuvent ne pas être possible dans des scénarios transgéniques. Ici nous démontrons une gamme parallèle injecteur capable de créer, dans un délai rapide &quot;, au niveau circuit transgéniques», permettant à l&#39;ensemble des structures du cerveau en 3 dimensions pour être viralement ciblée d&#39;un gène, en une seule étape chirurgicale. Le tableau injecteur comprend un ou plusieurs pompes volumétriques que chaque lecteur un ensemble de seringues, dont chacun se nourrit dans un verre de silice-polyimide / capillaire via un connecteur haute pression tolérant. Les capillaires sont de taille, puis inséré dans, endroits désirés spécifiés par la coutume, un conseil de fraisage positionnement stéréotaxique, permettant ainsi à des virus ou d&#39;autres réactifs pour être livré à l&#39;ensemble des régions du cerveau désirée. Pour utiliser l&#39;appareil, le chirurgien remplit d&#39;abord le sous-système fluidique entièrement avec de l&#39;huile, des remblais des capillaires avec le virus, insère le dispositif dans le cerveau, et infuse lentement réactifs (&lt;0,1 ul / min). Cette technologie permettra à une grande variété de nouveaux types d&#39;expériences, telles que milliseconde calendrier d&#39;arrêt de façon complexe en forme de structures (telles que l&#39;hippocampe) à des moments précis au cours de comportement, l&#39;inactivation temporellement précise des structures bilatérales qui peuvent agir de manière redondante (tels que l&#39;amygdale gauche et droite), et la perturbation de plusieurs régions cérébrales discrètes (par exemple, conduire deux régions reliées en opposition de phase pour étudier comment la Croix-région dépend de l&#39;activité synchronie dans chaque région, ou de stimuler les entrées d&#39;une région tout en taire un sous-ensemble de les cibles afin de comprendre lequel des plusieurs cibles sont essentielles pour la médiation des effets de ces entrées). Pour un grand cerveau comme celles chez le primate, dans lequel nous avons récemment démontré optiques de type cellulaire d&#39;activation spécifique de neurones 3, perturbant l&#39;activité dans une zone behaviorally pertinente peut exiger l&#39;étiquetage virale de grandes structures complexes. Nous notons que les tableaux parallèles injecteur peut être utilisé pour injecter près de toute charge utile - les médicaments, les neuromodulateurs, des neurotransmetteurs, ou même des cellules - en 3-D complexes schémas dans le cerveau, d&#39;une manière temporellement précis. Enfin, du point de vue de translation, il est possible que la rapidité, la thérapie génique patient personnalisés ou des dispositifs de délivrance de médicaments peuvent être rapidement personnalisés conçus et fabriqués pour correspondre à géométries cerveau individuel, en soutenant de nouveaux traitements pour une variété de pathologies, potentiellement grâce à l&#39;utilisation des molécules de contrôle optique. Les tableaux injecteurs sont conçus pour être précis, à la fois spatialement et volumétrique. Dans le X et Y-directions, ceci est accompli par le forage des trous placés de façon très précise en utilisant un moyen peu coûteux de mini-moulin, avec les trous juste assez grand pour accueillir les injecteurs, de sorte que les injecteurs sont tenues parallèlement les uns aux autres, et de manière précise emplacement. Dans la direction Z, les injecteurs sont coupés à l&#39;aide d&#39;un appareil de stéréotaxie, permettant un niveau de précision équivalente à celle de la chirurgie stéréotaxique lui-même. La précision volumétrique découle de la précision de la pompe à Hamilton, ainsi que les proches de zéro volume mort connecteurs, adapté de la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) sur le terrain. Les injecteurs sont fabriqués à partir de tube capillaire en silice fondue, ce qui est solide et assez rigide qu&#39;il maintient la forme et un espacement précis sous pression, sans l&#39;épaisseur plus grande muraille de solutions de rechange telles que des canules en acier. De petites modifications peuvent facilement être faits pour adapter le réseau parallèle injecteur à une variété d&#39;expériences. Par exemple, si un plus petit volume de virus ou de l&#39;espacement plus fine est nécessaire, les petits tubes capillaires peuvent être employés, avec un peu plus petit foret correspondant. Les futurs appareils peuvent utiliser des canaux microfluidiques et des pompes, pour augmenter le nombre d&#39;injecteurs parallèlement, de minimiser la taille (peut-être permettant à ces dispositifs pour être montés sur la tête des animaux se déplacent librement).

<table><tbody><tr><td>Outil Dremel</td><td>Outil</td><td>Dremel</td><td>3956-02</td><td></td></tr><tr><td>Coupe-laser</td><td>Outil</td><td>Universal Laser Systems</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet à colle chaude</td><td>Outil</td><td>Stanley Bostitch</td><td>GR20</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue d'injection/retrait (pompe Hamilton)</td><td>Outil</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Seringues Hamilton de 10 &amp;mu;l</td><td>Outil</td><td>Hamilton Co</td><td>701N</td><td>Une nécessaire par site d'injection</td></tr><tr><td>Stéréotaxie pour souris</td><td>Outil</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725D</td><td></td></tr><tr><td>Fraiseuse mini-Modela</td><td>Outil</td><td>Roland</td><td>MDX-15</td><td></td></tr><tr><td>Foret de diamètre 0,011&quot; pour fraiseuse mini</td><td>Outil</td><td>McMaster-Carr</td><td>8915A12</td><td></td></tr><tr><td>Foret de diamètre 1/32&quot; pour fraiseuse mini</td><td>Outil</td><td>McMaster-Carr</td><td>8848A35</td><td></td></tr><tr><td>Micro-moteur dentaire à haute vitesse</td><td>Outil</td><td>Lynx</td><td>333</td><td></td></tr><tr><td>Accessoires pour micro-moteur dentaire</td><td>Outil</td><td>Pearson Assessments</td><td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td><td></td></tr><tr><td> </td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Cannule en acier inoxydable, diamètre extérieur (DE) de 1,5 mm</td><td>Matériau</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-15R</td><td></td></tr><tr><td>Vis machine à fente 1-72</td><td>Matériau</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>MX-0172B</td><td></td></tr><tr><td>Écrou hexagonal 1-72</td><td>Matériau</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HNX-0172</td><td></td></tr><tr><td>Carte de prototypage PCB, épaisseur 1/32&quot;</td><td>Matériau</td><td>Digi-Key</td><td>PC57-T-ND</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d'acrylique, épaisseur 1/8&quot;</td><td>Matériau</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K239</td><td></td></tr><tr><td>Connecteurs HPLC</td><td>Matériau</td><td>Upchurch Scientific</td><td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (certains sont disponibles en lots de 10 ; il suffit d'ajouter un &amp;#8216;x&amp;rsquo; à la fin du numéro de pièce)</td><td>Un nécessaire par injection par site, sauf pour F-252, P-627 et P-235, qui peuvent être réutilisés</td></tr><tr><td>Tuyau capillaire en silice fondue, DE : 245 &amp;mu;m, DI : 100 &amp;mu;m</td><td>Matériau</td><td>Polymicro Technologies</td><td>2000022-10M</td><td></td></tr><tr><td>Époxy polyvalent à prise rapide (5 minutes)</td><td>Matériau</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td>Époxy polyvalent à prise rapide (5 minutes)</td></tr><tr><td>Tuyau en polyéthylène, 0,066 x 0,095 pouce</td><td>Matériau</td><td>VWR international</td><td>63018-827</td><td></td></tr></tbody></table>

Évolutif fluidique arrays injecteur pour virale ciblage d&#39;intact circuits du cerveau en 3-d

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Notre compréhension des circuits neuronaux - comment ils arbitrer les calculs que cette sensation subserve, la pensée, l&#39;émotion et l&#39;action, et comment ils sont corrompus dans les troubles neurologiques et psychiatriques - serait grandement facilitée par une technologie de cibler rapidement les gènes de 3 complexes - dimensions circuits neuronaux, permettant la création rapide de &quot;niveau circuit transgéniques.&quot; Nous avons récemment développé des méthodes d&#39;encodage dans lequel des virus sensibles à la lumière des protéines peuvent sensibiliser les types de cellules spécifiques à la milliseconde-calendrier d&#39;activation et de réduire au silence dans le cerveau intact. Nous présentons ici la conception et la mise en œuvre d&#39;un tableau d&#39;injection capable de délivrer des virus (ou d&#39;autres liquides) à des dizaines de points définis au sein de la structure en 3 dimensions du cerveau (<strong&gt; Figure. 1A, 1B</strong&gt;). Le tableau injecteur comprend un ou plusieurs pompes volumétriques que chaque lecteur un ensemble de seringues, dont chacun se nourrit dans un verre de silice-polyimide / capillaire via un connecteur haute pression tolérant. Les capillaires sont de taille, puis inséré dans, endroits désirés spécifiés par la coutume, un conseil de fraisage positionnement stéréotaxique, permettant ainsi à des virus ou d&#39;autres réactifs pour être livré à l&#39;ensemble des régions du cerveau désirée. Pour utiliser l&#39;appareil, le chirurgien remplit d&#39;abord le sous-système fluidique entièrement avec de l&#39;huile, des remblais des capillaires avec le virus, insère le dispositif dans le cerveau, et infuse lentement réactifs (&lt;0,1 microlitres / min). La nature parallèle du tableau injecteur facilite l&#39;étiquetage rapide, précis et robuste de l&#39;ensemble des circuits neuronaux avec des charges virales comme sensibilisateurs optiques pour permettre à la lumière d&#39;activation et au silence des circuits cérébraux définis. Avec d&#39;autres technologies, telles que des tableaux de fibre optique pour la livraison de lumière à des ensembles souhaités de régions du cerveau, nous espérons créer une boîte à outils qui permet à la systématique de palpage de causalité fonctions neuronales dans le cerveau intact. Cette technologie peut non seulement ouvrir un tel approches systématiques au circuit axé sur les neurosciences chez les mammifères, et de faciliter l&#39;étiquetage des régions du cerveau chez les gros animaux comme les primates non-humains, mais peut aussi ouvrir une voie clinique translationnelle pour les cellules spécifiques des prothèses de contrôle optique , dont la précision peut permettre l&#39;amélioration du traitement des troubles du cerveau réfractaire. Enfin, des dispositifs tels que décrits ici peuvent faciliter justement au moment opportun la livraison fluidique d&#39;autres charges utiles, comme les cellules souches et les agents pharmacologiques, à 3 dimensions des structures, de manière facilement personnalisables par l&#39;utilisateur.

Contrôle et analyse des circuits neuronaux<em&gt; In vivo</em&gt; Serait facilitée par une technologie pour la prestation des virus et autres réactifs pour désirée en 3 dimensions des ensembles de régions cérébrales. Nous démontrons la fabrication personnalisée fluidiques array injecteur, et la livraison de viro-codés sensibilisateurs optiques, permettant la manipulation optique des circuits cérébraux complexes.

Évolutif fluidique Arrays Injecteur pour virale ciblage d&#39;Intact circuits du cerveau en 3-D

Notre compréhension des circuits neuronaux — la manière dont ils assurent les calculs qui sous-tendent la sensation, la pensée, l'émotion et l'action, et la manière dont ils sont altérés ...

Deux pièces rectangulaires d'acrylique sont découpées au laser, puis assemblées pour former la pince stéréotaxique, qui permet de maintenir fermement le réseau d'injecteurs par rapport aux stéréo-attaques. Une pompe à seringue est chargée avec des seringues reliées à un tube en polyéthylène pour un circuit cérébral donné. Une fraiseuse est utilisée pour percer des trous dans lesquels un tube en silice fondue est inséré, formant ainsi les injecteurs.Les injecteurs sont montés de manière réversible dans la pince, puis ajustés pour cibler les circuits cérébraux d'intérêt. Chaque injecteur est relié à un canal en polyéthylène unique. La préparation du système pour utilisation consiste à remplir le système via les seringues avec de l'huile de silicone, puis à charger les réactifs fluidiques dans les injecteurs.L'injecteur parallèle est ensuite inséré dans les cibles cérébrales et les réactifs sont perfusés. Bonjour, je suis Stephanie Chan du groupe de neurobiologie synthétique du MIT. Jusqu'à présent, l'expression de gènes dans des circuits cérébraux spatialement complexes nécessitait soit la création lente et coûteuse d'animaux transgéniques, soit le processus fastidieux d'injections virales, qui doivent être effectuées un hémisphère à la fois.Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment construire et utiliser un réseau d'injecteurs parallèles capable de délivrer des fluides selon des motifs tridimensionnels complexes dans le cerveau. Nous utilisons ce réseau pour générer rapidement des souris transgéniques ciblant des circuits spécifiques, en délivrant des virus en parallèle à l'aide de l'ensemble des injecteurs afin d'atteindre simultanément toutes les cibles. Notre injecteur peut être utilisé pour acheminer n'importe quel réactif fluide vers une distribution complexe de sites cérébraux.Notre objectif aujourd'hui est d'acheminer des virus codant pour des protéines sensibles à la lumière afin de pouvoir activer et désactiver de manière temporellement précise des types cellulaires spécifiques dans des circuits précis. Dans notre laboratoire, nous utilisons cette technologie conjointement avec des réseaux de fibres optiques qui délivrent la lumière de façon spécifique au circuit ciblé. Commençons donc.Nous construisons d'abord une pince stéréotaxique qui maintient le réseau d'injecteurs et peut être montée sur la stéréotaxie. Pour fabriquer la pince, les éléments suivants sont nécessaires : une canule en acier de deux pouces avec un diamètre extérieur ou OD de 1,5 millimètre, un petit morceau de circuit imprimé prototype d'environ 0,5 sur 0,5 centimètre, et deux rectangles identiques.Une pièce de dimensions un demi-pouce sur trois huitièmes de pouce, découpée dans une feuille d'acrylique d'un huitième de pouce d'épaisseur, pour chacun des deux rectangles en acrylique. Découper deux trous circulaires dans des coins opposés. Le premier trou doit avoir un diamètre de 1,5 millimètre et être juste assez grand pour maintenir fermement la canule métallique.Le deuxième trou doit avoir un diamètre d'un seizième de pouce. Insérez la canule métallique dans le trou de 1,5 millimètre d'un rectangle, puis à travers le trou de 1,5 millimètre du deuxième rectangle, alignez l'extrémité inférieure de la canule avec la face inférieure du rectangle du bas afin de former la forme d'un bâton de hockey, placez l'entretoise entre les deux rectangles. De la pâte à modeler peut être utile pour maintenir l'ensemble en place durant cette opération tout en gardant l'entretoise fermement maintenue entre les deux rectangles.Fixez cette structure en utilisant de la colle chaude autour de la canule et des trous de 1,5 millimètre. Veillez à ne pas coller l'entretoise aux rectangles une fois la colle sèche au centre. Placez un écrou hexagonal 1/72 sur le trou d'un seizième de pouce, puis vissez une vis 1/72 depuis le côté opposé des rectangles.Déposez de petites quantités de colle époxy à prise rapide autour des bords de l'écrou pour la fixer au rectangle. Veillez à ne pas laisser l'époxy pénétrer dans les filetages de l'écrou ou de la vis. Une fois l'époxy durcie, insérez une vis 1 72 dans le trou situé à un seizième de pouce du bord supérieur du rectangle et vissez-la dans l'écrou.Retirez l'argile de modélisme et vérifiez que l'espacement peut être maintenu fermement en place en resserrant la vis. Le système de réseau d'injecteurs peut être personnalisé pour s'adapter pratiquement à n'importe quel ensemble de coordonnées dans le cerveau. Tout d'abord, repérez les coordonnées des sites d'injection souhaités dans un atlas cérébral de l'espèce étudiée, puis convertissez-les en les coordonnées appropriées utilisées par les stéréotaxiques.Dans cette démonstration, nous utiliserons une souris et il y aura trois sites d'injection, et par conséquent trois tubes pour les injecteurs. Les coordonnées X, Y et Z correspondront aux coordonnées médio-latérales, antérieures, postérieures et/ou ventrales d'un atlas du cerveau de souris. Ensuite, placez trois seringues Hamilton de 10 microlitres dans une pompe à seringue d'injection et de retrait, comme celle-ci provenant de Harvard Apparatus, puis fixez solidement trois morceaux de tubulure en polyéthylène d'un mètre de long à l'aiguille de chaque seringue Hamilton, pour chaque morceau de tubulure en polyéthylène.Faites glisser un manchon de tube F 2 52 sur l'extrémité ouverte et fixez-le à un raccord de tube P 6 27 à l'aide de l'écrou P 2 35 et du P 200 fal. Pour construire le réseau d'injecteurs personnalisé, utilisez une fraiseuse modela mini et un foret de diamètre 0,011 pouce pour percer trois trous dans un espace de circuit imprimé prototype d'un trente-deuxième de pouce d'épaisseur. Les trois trous selon les coordonnées X et Y relatives des sites d'injection avant de retirer la plaque de la fraiseuse, percez un rectangle autour des petits trous à l'aide d'un foret de diamètre égal à un trente-deuxième de pouce.Ensuite, les injecteurs individuels sont insérés à moitié dans chaque trou de manière à ce qu'ils soient bien maintenus et parallèles les uns aux autres. Les fixer sur la plaque à l'aide de résine époxy pour former le réseau d'injecteurs. Pour fixer le réseau d'injecteurs au serre-fût stéréotaxique.Placez un coin de la platine d'essai entre les rectangles en acrylique et serrez la vis du support stéréotaxique. Ensuite, fixez la canule métallique du support au stéréotaxique à l'aide du mécanisme de fixation des stéréotypes. Ces étapes suivantes sont réalisées au microscope pour l'un des injecteurs extérieurs qui peut être approché latéralement avec une arête droite sans heurter aucun des autres injecteurs.Coupez l'extrémité qui dépasse sous la platine d'essai. Aplatissez l'extrémité à l'aide d'un outil Dremel. Ensuite, choisissez un point de référence stable dans la plage de déplacement du bras stéréotaxique et déplacez le réseau d'injecteurs de manière à ce que l'extrémité aplatie de l'injecteur externe se trouve à ce point de référence.Choisissez un deuxième injecteur ainsi que ses coordonnées correspondantes. Déplacez le réseau d'injecteurs le long de l'axe Z selon la différence relative de hauteur ou de direction Z entre les coordonnées du premier et du deuxième injecteur. Ajustez ce deuxième injecteur afin que sa pointe se trouve désormais à la hauteur du point de référence, puis aplanissez-le à l'aide d'un outil Dremel.Le réseau d'injecteurs peut être déplacé selon les directions X et Y afin de faciliter la comparaison entre l'extrémité de l'injecteur et le point de référence. Après avoir répété ce processus de réglage pour les injecteurs restants, le réseau d'injecteurs est prêt à être assemblé dans l'ensemble du système. L'assemblage du système complet nécessite la pince stéréotaxique précédemment construite et le réseau d'injecteurs personnalisé.Après avoir stérilisé le réseau d'injecteurs, insérez l'extrémité arrière de chaque injecteur, celle qui n'a pas été coupée, dans un manchon tubulaire bleu F deux 40. À l'aide d'un écrou P 2 35 et d'un P 200 freal, fixez l'extrémité arrière de l'injecteur à l'adaptateur fileté déjà relié à la pompe Hamilton par un tube en polyéthylène. À l'aide d'une aiguille de calibre 27, injectez de l'huile de silicone stérile à l'arrière des seringues Hamilton afin que l'ensemble du système soit rempli, des seringues Hamilton jusqu'aux extrémités des injecteurs.Veillez à ne pas introduire de bulles d'air, sans quoi le volume de virus injecté sera incorrect ou le virus risque de ne pas être injecté du tout. Lorsque les seringues Hamilton sont remplacées dans la pompe Hamilton, le volume maximal possible d'huile de silicone est conservé dans les seringues. Si l'expérience nécessite plus de deux seringues, des entretoises peuvent être placées dans la pompe Hamilton, comme nous l'avons fait ici.Alternativement, un kit de mise à niveau multiporte peut être acheté auprès de Harvard Apparatus pour contenir jusqu'à 10 seringues simultanément. Pour injecter le virus dans le cerveau de la souris, commencez par administrer des analgésiques conformément à votre protocole animal. Placez la souris anesthésiée dans le stéréotaxique et confirmez, à l'aide d'une pincée du orteil, que l'animal est suffisamment anesthésié.Ensuite, effectuez une incision unique dans le plan médian de la peau, de l'espace situé entre les yeux jusqu'à celui entre les oreilles. Relevez la peau pour exposer le crâne et retirez la fascia. Fixez une pipette en verre étirée sur les stéréo-attaches.Ajustez la position des tiges auriculaires jusqu'à ce que bgma et lambda soient alignés à la même hauteur et que la ligne les reliant soit parallèle à l'axe Y des attaques stéréotaxiques. Mettez à zéro les coordonnées stéréotaxiques avec la pointe de la pipette en verre située au niveau de bgma, puis positionnez la pointe légèrement au-dessus du crâne aux coordonnées x et y de l'un des sites d'injection. À l’aide d’un foret dentaire, percez délicatement le crâne sous la pointe jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une couche osseuse extrêmement fine ; puis, à l’aide d’une aiguille de calibre 30, retirez soigneusement un minuscule morceau de cette couche aux coordonnées x et y correctes afin d’exposer la dure-mère.Ce trou doit être juste assez grand pour permettre d'insérer l'un des injecteurs de cette manière. De petits trous de 0,25 millimètre de large sont percés dans le crâne aux coordonnées x et y correspondant à chaque site d'injection. Une fois le perçage terminé, jetez la pipette de calibrage en verre et fixez le réseau d'injecteurs personnalisé au stéréotaxique à l'aide de la pince stéréotaxique.Pour régler correctement l'angle du dispositif d'injection, choisissez deux injecteurs extérieurs devant être calibrés par rapport à un point de référence donné. Une fois qu'un des injecteurs est aligné avec le point de référence, considérez les distances relatives selon les axes X et Y entre les sites d'injection pour cet injecteur et l'autre. Déplacez le dispositif d'injection selon les directions X et Y de ces distances relatives. Si le second injecteur n'est pas aligné avec le point de référence, desserrez la canule métallique et faites-la pivoter.Répétez ce processus de manière itérative jusqu'à ce que le réseau d'injecteurs soit correctement orienté. Réglez le débit de remplissage de la pompe Hamilton à un microlitre par minute et remplissez à nouveau les injecteurs avec de l'huile de silicone jusqu'à ce que les seringues atteignent le repère de deux microlitres ou plus. Cela fournit une réserve d'huile suffisante pour éliminer facilement toute bulle d'air ou obstruction à l'extrémité en poussant l'huile vers l'avant à l'aide de la pompe Hamilton, sans avoir à remplir à nouveau l'ensemble du système avec de l'huile de silicone par l'arrière des seringues, comme décrit précédemment.Placez un morceau propre de paraforme sur le crâne et abaissez délicatement les injecteurs sur la paraforme. Si un microlitre de virus doit être délivré à chaque site, pipetez 1,5 microlitre de virus sur la paraforme pour chaque site, avec le même débit de remplissage d’un microlitre par minute. Rechargez 1,2 microlitre de virus dans chaque injecteur.Positionnez à zéro la pointe de l'injecteur le plus long au niveau du bgma, puis déplacez le réseau d'injecteurs aux coordonnées X et Y de cet injecteur. Abaissez le réseau d'injecteurs à travers les petits trous réalisés avec les aiguilles de calibre 30 pour ajuster la profondeur en Z. Injectez un microlitre de virus à travers chaque injecteur à raison de 0,1 microlitre par minute ou moins.Laisser les injections en place pendant 30 minutes afin que celles-ci diffusent. Après 30 minutes, extraire lentement le réseau d'injecteurs du cerveau. Ensuite, régler la pompe Hamilton pour une perfusion au même débit de 0,1 microlitre par minute afin de vérifier l'obstruction éventuelle de chaque injecteur.Ensuite, nettoyez les injecteurs en les remplissant à nouveau et en infusant deux microlitres d'éthanol à un débit de deux microlitres par minute. Enfin, remplissez à nouveau les injecteurs avec de l'huile de silicone afin de maintenir une zone tampon de deux microlitres dans chaque seringue Hamilton. Cette figure montre le résultat obtenu avec le dispositif d'injection précédemment présenté, contenant trois canules, utilisé pour délivrer des réactifs viraux à différentes régions du cerveau de souris.Dans ce cas, la charge génétique du virus contient la molécule fluorescente GFP, produisant trois volumes fluorescents de cellules marquées en une seule étape. En principe, un nombre arbitraire de canules peut être utilisé pour constituer un réseau d'injecteurs viraux. Ici, par exemple, un réseau d'injecteurs adapté à une cible bilatérale de la région CA1 de l'hippocampe avec 16 injecteurs.Grâce au protocole que nous vous avons présenté aujourd'hui, vous serez en mesure d'administrer un virus selon un motif tridimensionnel dans le cerveau, créant ainsi efficacement des transgéniques au niveau des circuits. De plus, le réseau parallèle d'injecteurs peut être utilisé pour délivrer tout réactif liquide dans le cerveau, permettant peut-être, par exemple, d'administrer des agonistes dopaminergiques selon un motif précis à des circuits neuronaux spécifiques chez un animal en comportement fixé par la tête. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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