Name: Limagerie in vivo de Deep couches corticales utilisant un microprisme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Découvrez l'imagerie in vivo des couches profondes du néocortex chez la souris en utilisant des microprismes à angle droit. Cette technique permet de visualiser simultanément les six couches corticales avec un champ de vision large et une résolution suffisante pour observer les épines dendritiques.

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Nous remercions Anthony J. Koleske, PhD pour fournir les souris YFP.

Partie 1: Optique microprismes et de configuration de microscope <ol><li> Les microprismes que nous utilisons sont de 1 mm, angle droit prismes à base de verre BK7 achetés auprès de la Société Optosigma (figure 1). Microprismes sont traitées en utilisant une pince quand c&#39;est possible. </li><li> L&#39;hypoténuse du microprismes est revêtu d&#39;argent améliorée afin de fournir une réflectivité supérieure à 97% de 400 à 2000 nm. Ceci fournit une réflexion interne à la fois la lumière d&#39;excitation laser et la fluorescence émise. </li><li> Microprismes sont toujours traités en utilisant une pince quand c&#39;est possible. Les gants sont portés en tout temps pour garder le prisme propre. </li><li> Nous utilisons une coutume construit microscope à deux photons capables d&#39;imagerie du petit animal. L&#39;animal, attaché à l&#39;appareil de stéréotaxie, est placé sur une scène à 3 axes motorisés. </li><li> Le microscope est connecté à un PC Windows exécutant le logiciel scanimage. Scanimage est un logiciel d&#39;acquisition d&#39;image écrit en Matlab par Pologruto et al 1. </li><li> Pour l&#39;imagerie microprismes, nous recueillons des images à une résolution de 1024 x 1024 ou 512 x 512 pixels. De plus, nous avons généralement scan à 2 ms / ligne ou 4 ms / ligne. </li><li> Deux types d&#39;objectifs sont utilisés dans les expériences: <ul><li> Inférieure un objectif chiffré de l&#39;air d&#39;ouverture (NA) pour grand champ de vision d&#39;imagerie (voir tableau des réactifs et des équipements). </li><li> Un objectif plus élevé de l&#39;air NA avec un collier de verre de correction susceptible de minimiser les aberrations sphériques induites par 0 - 2 mm de verre (voir le tableau des réactifs et des équipements). </li></ul></li><li> Lorsque l&#39;animal est prêt pour l&#39;imagerie sous un objectif à faible grossissement, d&#39;aligner le modèle raster carrés de balayage du laser avec le haut de la microprismes. Cela aidera à orienter l&#39;image et de faire une utilisation efficace de la puissance du laser. </li><li> En utilisant un objectif plus élevé NA avec un collier de verre de correction, régler la bague de correction pour corriger environ 1 mm de verre. Une fois une image fluorescente apparaît pendant l&#39;expérience, on peut bien accéder à l&#39;intérieur du microscope pour optimiser la bague de correction afin de maximiser la résolution d&#39;imagerie. </li></ol> Partie 2: La chirurgie des animaux non-survie et d&#39;insertion microprismes <ol><li> La longueur entière procédure, à partir de l&#39;incision initiale jusqu&#39;à l&#39;achèvement de l&#39;imagerie, dépend des objectifs de l&#39;expérience. Cependant, le placement non-intervention chirurgicale et la survie de microprismes peuvent être devrait prendre environ 30 - 40 minutes à compléter. </li><li> Souris (P30-P60) sont pesés et anesthésiés appropriée en utilisant une injection IP de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) à un plan approprié pour les procédures chirurgicales. </li><li> Tout au long de toute l&#39;expérience, l&#39;animal doit être vérifié toutes les 15-20 minutes pour évaluer son niveau de l&#39;anesthésie. Si l&#39;animal réagit à une entreprise toe-pincement, une dose supplémentaire de kétamine / xylazine est nécessaire. Généralement, une dose supplémentaire est d&#39;un tiers de la dose initiale et peut être préparé à l&#39;avance dans une seringue pour injection IP immédiat si nécessaire. </li><li> Une fois que la souris est correctement anesthésié, la majorité des cheveux sur la tête de l&#39;animal est rasé en utilisant un potentiomètre avec une lame # 40. </li><li> Nair ® est appliqué aux poils restant sur la tête pour aider à créer une surface libre de poils qui peuvent obtenir de la manière de l&#39;microprismes pendant l&#39;imagerie. Après 5 minutes, le Nair ® est nettoyée en utilisant un coton-tige. </li><li> L&#39;animal anesthésié est correctement placé dans un appareil stéréotaxique de la souris. Pendant les procédures chirurgicales et des séances d&#39;imagerie est gardé l&#39;animal sur un rempli d&#39;eau coussin chauffant réglé à 36 degrés Celsius. </li><li> Avec tête de l&#39;animal soit correctement fixé, une incision propre est faite en utilisant un scalpel sur la ligne médiane du crâne de séparer la peau. </li><li> Une petite quantité de peroxyde d&#39;hydrogène à 3% est placée sur un coton-tige et appliqué sur le crâne pour déblayer les membranes entre le crâne et la peau. </li><li> Le peroxyde d&#39;hydrogène permet également de révéler bregma, un jalon important de savoir où effectuer la craniotomie et insérez le microprismes. </li><li> Avant la craniotomie est démarré, les barres d&#39;oreille bouchée et un bar sont correctement ajustés à l&#39;inclinaison de la boîte crânienne exposée telle qu&#39;elle est essentiellement au niveau du tableau. Cela fournit une meilleure plateforme pour la craniotomie. De plus, ce qui rend la surface supérieure de la perpendiculaire prisme à la lumière d&#39;excitation entrants. Cela permettra de minimiser les aberrations optiques tout en imagerie. </li><li> Une petite bavure dentaires (~ 0,8 mm taille de la tête) est connecté à un outil de Dremel ® à l&#39;aide d&#39;un bras flexible de prolongation. Pour craniotomies, nous avons mis la vitesse à environ 7.000 à 10.000 RPM. </li><li> La fraise dentaire est écrémé le long du crâne jusqu&#39;à une rainure carrée est établie dans l&#39;os. Les côtés du carré sont environ 2-3 mm de longueur et 1,5 centré caudale et 1 mm latéral bregma. </li><li> Poursuivant l&#39;amincissement de l&#39;os jusqu&#39;à ce qu&#39;une petite ouverture se fait à travers le crâne. Une paire de pinces à can soulever le volet osseux loin du crâne. </li><li> La durée doit être enlevé avant que le microprismes peuvent être insérés dans le cortex. Le saignement est mieux contrôlée en laissant le sang coagule à la surface pendant plusieurs minutes. Ensuite, le sang coagulé est enlevée à l&#39;aide d&#39;une éponge chirurgicale avant d&#39;insérer la microprismes. </li><li> Pour aider à faciliter l&#39;alignement du prisme avec le cortex, la face verticale de la microprismes est aligné parallèlement à la poignée sur la pince. </li><li> Avec le prisme bien tenu, les microprismes ensemble est inséré jusqu&#39;au sommet du prisme est au ras de la surface du néocortex. </li><li> Lorsqu&#39;elle est insérée correctement, les microprismes doit rester dans la bonne position. Tout saignement qui en résulte est minime et peut être absorbé avec une petite éponge chirurgicale. Une fois le prisme est en place l&#39;animal est prêt pour l&#39;imagerie. </li><li> Après un microprisme a été utilisé dans un animal, il peut être réutilisé plusieurs fois. Toutefois, il ne doivent être correctement nettoyées pour éliminer tout résidu biologique. Ceci peut être accompli en trempant le prisme dans un petit volume d&#39;acide HCl, suivie par un plongeon dans le méthanol. Les microprismes peuvent ensuite être nettoyé enveloppés dans du papier lentille jusqu&#39;à une utilisation future. </li></ol> Partie 3: Résultats Représentant <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Images de l&#39;microprismes à angle droit. Prismes utilisés dans cette expérience sont d&#39;un millimètre, des prismes de verre BK7 avec un revêtement en argent renforcée sur l&#39;hypoténuse pour permettre une réflexion interne de l&#39;excitation et l&#39;émission de lumière. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: Image de la couche de neurones pyramidaux V YFP. Large champ de vision avec l&#39;imagerie microprismes révèle une grande population de corps cellulaires pyramidaux ~ 800 à 900 um de profondeur de la surface corticale. En outre, les dendrites apicales s&#39;étendant jusqu&#39;à vers la couche I peuvent également être résolus. Barre d&#39;échelle = 200 pm. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3: Un objectif d&#39;ouverture numérique élevée utilisés en conjonction avec les microprismes fournit une résolution spatiale suffisante pour résoudre les épines dendritiques sur les dendrites apicales des neurones pyramidaux couche V. Barre d&#39;échelle = 10 um. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4: Une image obtenue en utilisant les microprismes et une injection de queue veine d&#39;un colorant fluorescent. L&#39;image montre verticales, les navires de gros calibre qui s&#39;étend de régions profondes du cerveau et les petits capillaires bifurquant à travers le volume cortical. Barre d&#39;échelle = 200 pm. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5: Utilisation d&#39;un objectif plus élevé ouverture numérique, le réseau de capillaires dans le néocortex peuvent être imagées avec plus de détails. Barre d&#39;échelle = 50 microns. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6: microprismes permet aussi pour les cellules sanguines d&#39;imagerie rouges (hématies) circulant dans les vaisseaux. Globules rouges n&#39;absorbent pas le colorant fluorescent et sont donc considérés comme des rayures foncées sur le navire. En ligne de balayage dans le récipient, on peut obtenir des mesures de flux de RBC et de vitesse. Barre d&#39;échelle = 10 microns (barre horizontale à l&#39;image de haut et bas) et 250 ms (barre verticale à l&#39;image de fond).

<ol><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li>
</ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Université de Yale IACUC.

Utiliser un microprisme dans une expérience d&#39;imagerie est relativement simple et offre de nombreux avantages pour les études in vivo sur le néocortex. Des exemples représentatifs en utilisant cette technique comprennent des images prises à partir des souris transgéniques exprimant une protéine fluorescente jaune dans les neurones V couche corticale. Utiliser microprismes, on peut voir une collection de grands corps des cellules pyramidales dans la couche V, près de 1 mm en dessous de la surface corticale. On voit é...

<table><tbody><tr><td>Avec revêtement réfléchissant argenté amélioré-(R77)</td><td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td><td>055-0010</td><td>Avec revêtement réfléchissant argenté amélioré-(R77)</td></tr><tr><td>Dextrane-fluorescéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70</td><td>70 kDa </td></tr><tr><td>Objectif à air, 4x, NA 0,28</td><td>Olympus Corporation</td><td>XLFLUOR 4x/340</td><td></td></tr><tr><td>Objectif à air, 40x, NA 0,60</td><td>Olympus Corporation</td><td>LUCPLFLN</td><td>Avec correction pour couvre-objets de 0 à 2 mm</td></tr></tbody></table>

l&#39;imagerie in vivo de deep couches corticales utilisant un microprisme

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Nous présentons un protocole pour l&#39;imagerie in vivo du tissu cortical en utilisant une sonde d&#39;imagerie cérébrale profonde dans la forme d&#39;un microprisme. Microprismes sont de 1 mm en taille et ont un revêtement réfléchissant sur l&#39;hypoténuse pour permettre une réflexion interne de l&#39;excitation et l&#39;émission de lumière. La sonde microprismes simultanément plusieurs images couches corticales avec une perspective typiquement observée uniquement dans les préparations tranche. Les images sont recueillies avec un grand champ de vue (~ 900 um). En outre, nous fournissons des détails sur la procédure de non-chirurgical et la survie de configuration de microscope. Les résultats représentatifs comprennent des images de neurones pyramidaux couche V de Thy-1-H YFP souris montrant leurs dendrites apicales qui s&#39;étend à travers la couche superficielle du cortex et s&#39;étendant dans des touffes. Résolution a été suffisante pour épines dendritiques image proche du soma des neurones V couche. Une injection de queue veine de colorant fluorescent révèle le réseau complexe de vaisseaux sanguins dans le cortex. À balayage linéaire de globules rouges (hématies) qui coule à travers les capillaires révèle la vitesse de RBC et les taux de flux peuvent être obtenues. Cette sonde microprismes roman est un élégant mais puissant méthode nouvelle de visualiser en profondeur les structures cellulaires et la fonction corticale in vivo.

À angle droit microprismes inséré dans le néocortex de souris permet d&#39;imagerie profonde de plusieurs couches corticales avec un point de vue on trouve généralement dans les tranches. Un millimètre microprismes offrent un champ de vision large (~ 900 um) et des résolutions spatiales suffisantes pour résoudre les épines dendritiques. Nous démontrons la couche V imagerie neuronale et néocorticale imagerie vasculaire en utilisant microprismes.

L&#39;imagerie in vivo de Deep couches corticales utilisant un microprisme

Nous présentons un protocole d'imagerie in vivo du tissu cortical utilisant une sonde d'imagerie cérébrale profonde sous forme de microprisme. Les microprismes sont d'une taille de 1 mm...

Les techniques de microscopie à fluorescence ont une capacité limitée à imager des structures profondes dans les tissus, en particulier dans les matériaux fortement diffusants comme le tissu cérébral. Même dans le cas de la microscopie à deux photons, il peut être très difficile d'obtenir des images in vivo de haute qualité de structures neuronales situées à plus de 500 micromètres sous la surface du néocortex. Ici, la ligne verte indique une profondeur de 500 micromètres.En général, les couches néocorticales quatre, cinq et six se trouvent à plus de 500 micromètres de la surface. Nous montrerons comment un microprisme en verre d'un millimètre inséré dans le néocortex peut transmettre la lumière vers l'intérieur et l'extérieur des couches corticales superficielles et profondes. En utilisant cette technique chez une souris, il est possible d'obtenir un champ de vision d'un millimètre et de visualiser simultanément les six couches corticales selon une perspective d'imagerie, généralement observée uniquement dans des tissus cérébraux sectionnés.Les microprismes offrent un large champ de vision permettant de visualiser les corps cellulaires des neurones paramétaux de la couche V avec leurs longues dendrites apicales ainsi que le réseau complexe des vaisseaux sanguins du néocortex, tout en conservant une résolution spatiale suffisante pour distinguer les épines dendritiques et l'écoulement des globules rouges à travers les microcapillaires. Je m'appelle Thomas Chia et je suis étudiant diplômé dans le laboratoire du professeur Michael Levine au Département de génie biomédical de l'Université Yale. Le protocole que nous allons aborder dans cette vidéo concerne l'utilisation de microprismes en verre droits d'un millimètre de côté pour obtenir des images de fluorescence de structures situées à un millimètre de profondeur dans le néocortex d'une souris.Les microprismes que nous utilisons sont des prismes droits d'un millimètre fabriqués en verre BK7, achetés auprès de la société Opto Sigma Corporation. Les microprismes sont manipulés à l’aide de pinces chaque fois que possible. L’hypoténuse du microprisme est recouverte d’argent amélioré afin d’assurer une réflectivité supérieure à 97 % entre 400 et 2000 nanomètres.Ceci permet une réflexion interne à la fois de la lumière d'excitation laser et de la fluorescence admise. Nous utilisons un microscope à deux photons sur mesure, capable d'effectuer l'imagerie de petits animaux. L'animal fixé à un dispositif stéréotaxique est placé sur une platine motorisée à trois axes.Le microscope est connecté à un ordinateur Windows exécutant le logiciel Scan Image. Scan Image est un logiciel d'acquisition d'images écrit en MATLAB par Polo Gudo et al. Pour l'imagerie au prisme microscopique, nous collectons des images avec une résolution de 10 24 par 10 24 ou de cinq 12 par cinq 12 pixels.En outre, nous effectuons généralement la numérisation à deux millisecondes par ligne ou à quatre millisecondes par ligne. Un aspect important de ce protocole réside dans le type d'objectifs microscopiques utilisés en conjonction avec les microprismes. Deux types d'objectifs sont utilisés dans les expériences.L'objectif situé à gauche est un objectif à air à faible ouverture numérique, destiné à l'imagerie sur de larges champs de vision ; dans ce cas précis, un objectif Olympus 4 x, ouverture numérique 0,28. L'objectif situé à droite est un objectif à air 40 x, haute ouverture numérique (0,60), muni d'un collier de correction en verre capable de minimiser les aberrations sphériques induites par une épaisseur de verre comprise entre zéro et deux millimètres. Afin de préparer la souris à une intervention chirurgicale et à l'insertion du microprisme, la première étape consiste à anesthésier correctement l'animal jusqu'à un niveau adapté aux procédures chirurgicales.Tout d'abord, le poids de l'animal est enregistré en fonction de la posologie établie. Un volume approprié d'un cocktail de kétamine et de xylazine est prélevé dans une seringue. Les agents anesthésiques sont administrés par injection intrapéritonéale à l'aide d'une aiguille de calibre 28.Une fois que la souris est sous un plan d'anesthésie adapté aux interventions chirurgicales, la majeure partie des poils sur la tête de l'animal est rasée à l'aide d'un tondeur équipé d'une lame numéro 40. Ensuite, un épilatoire est appliqué sur les poils restants au niveau de la tête afin d'obtenir une surface dépourvue de poils qui pourraient gêner le microprisme. Pendant l'imagerie, après cinq minutes, l'épilatoire est retiré à l'aide d'un coton-tige, puis l'animal anesthésié est correctement positionné dans un dispositif stéréotaxique pour souris.Pendant les interventions chirurgicales et les séances d'imagerie, l'animal est maintenu sur un coussin chauffant rempli d'eau réglé à 36 degrés Celsius. Une fois la tête de l'animal correctement fixée, une incision nette est pratiquée le long de la ligne médiane du crâne. Pour séparer la peau, une petite quantité de peroxyde d'hydrogène à 3 % est appliquée sur le crâne à l’aide d’un coton-tige afin d’éliminer les membranes situées entre le crâne et la peau.Le peroxyde d'hydrogène aide également à révéler le BMA, un repère majeur permettant de déterminer l'endroit où réaliser la craniotomie et insérer le microprisme. Avant de commencer la craniotomie, les barres auriculaires et la barre d'occlusion sont correctement ajustées afin d'incliner le crâne exposé de manière à ce qu'il soit pratiquement parallèle à la table. Cela fournit une meilleure plateforme pour la craniotomie.Une petite fraise dentaire est reliée à un outil Dremel pour les craniotomies. Nous réglons la vitesse à environ 7 000 à 10 000 tr/min. La fraise est déplacée délicatement le long du crâne jusqu'à ce qu'une rainure carrée soit formée dans l'os. Les côtés du carré mesurent environ deux à trois millimètres de longueur et sont centrés. Cisaillez 1,5 millimètre et continuez à amincir l'os sur un millimètre latéral jusqu'à créer une petite ouverture dans le crâne. Une paire de forceps peut soulever le lambeau osseux.La dure-mère doit être retirée avant que le microprisme puisse être inséré dans le cortex. Les saignements sont mieux contrôlés en laissant le sang coaguler à la surface pendant plusieurs minutes. Ensuite, le sang coagulé est éliminé à l’aide d’une éponge chirurgicale afin de faciliter l’alignement du prisme avec le cortex.La face verticale du microprisme est alignée parallèlement aux poignées de la pince. Une fois le prisme correctement tenu, on insère entièrement le microprisme jusqu'à ce que son sommet soit au niveau de la surface du néocortex. Ici, on peut voir le prisme en place dans le néocortex.Lorsqu'il est inséré correctement, le microprisme doit rester en position adéquate. Tout saignement résultant est minime et peut être absorbé à l'aide d'une petite éponge chirurgicale. Une fois le prisme en place, l'animal est prêt pour l'imagerie avec l'animal.Avec un objectif de faible grossissement, on peut observer le balayage laser en raster sur le microprisme à la surface du cerveau. Voici quelques exemples représentatifs d'images provenant de souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente jaune. Dans les neurones corticaux de la couche V à l'aide de microprismes, on peut voir un ensemble de grands corps cellulaires paramétaux situés dans la couche V, à près d'un millimètre sous la surface corticale.On observe également les dendrites apicales qui s'étendent à travers toutes les couches superficielles avant de se ramifier en touffes. À l'aide d'un objectif à haute ouverture numérique équipé d'un collier de correction du verre, il est possible de distinguer les épines dendritiques dans ce cas. Sur les dendrites apicales des neurones paramétaux de la couche V, les épines dendritiques sont des structures submicrométriques et plusieurs sont identifiées sur l'image à l'aide de flèches jaunes. On peut également marquer les vaisseaux sanguins corticaux avec un colorant fluorescent, tel que le dextran-fluorescéine, en utilisant des techniques établies d'injection dans la veine de la queue.Grâce à cette technique, on peut observer les vaisseaux de plus grand calibre provenant des couches profondes, s'étendant vers la PIE et se divisant pour former le réseau de microcapillaires. Ce réseau délicat de microcapillaires dans le néocortex s'apprécie au mieux à l'aide d'un objectif à haute ouverture numérique. En outre, il est possible de mesurer la vitesse et le flux des globules rouges dans les capillaires néocorticaux profonds par balayage en ligne.La ligne rouge indique le motif de balayage sur l'image du capillaire à travers le microprisme. Étant donné que les globules rouges n'absorbent pas le colorant fluorescent, ils apparaissent sous forme de stries sombres. L'image du bas représente le résultat d'un balayage en ligne, avec une dimension spatiale sur l'un des axes et une dimension temporelle sur l'autre.À partir de cet outil, on peut calculer le flux et la vitesse des globules rouges à travers le capillaire. Après qu'un microprisme a été utilisé sur un animal, il peut être réutilisé plusieurs fois. Toutefois, il doit être correctement nettoyé afin d'éliminer tout matériau biologique résiduel.Cela peut être réalisé en trempant le prisme dans un petit volume d'acide chlorhydrique, suivi d'une immersion dans du méthanol. Le microprisme propre peut ensuite être enveloppé dans du papier-lentille jusqu'à sa prochaine utilisation. Ceci conclut notre protocole sur l'utilisation de microprismes pour l'imagerie corticale in vivo chez la souris.L'utilisation de microprismes dans une expérience d'imagerie est relativement simple et offre de nombreux avantages pour les études in vivo sur le néocortex. Nous espérons que vous avez trouvé cette technique intéressante et qu'elle pourra être utilisée dans votre laboratoire à l'avenir. Merci d'avoir regardé et bonne chance.

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