Name: Une évaluation quantitative du lipidome levure en utilisant la spectrométrie de masse électrospray ionisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-21T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Découvrez une méthode de lipidomique quantitative pour identifier les lipides de levure par spectrométrie de masse ESI. Cette technique améliore la sensibilité et la rapidité d'analyse des espèces lipidiques.

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Nous sommes reconnaissants à Alain Tessier à titre onéreux conseils, discussions, et le support technique. Nous reconnaissons le Centre pour les applications biologiques de la spectrométrie de masse à l&#39;Université Concordia pour services exceptionnels. Ce travail a été soutenu par des subventions des IRSC et le CRSNG du Canada. VIT est une nouvelle chercheuse des IRSC et président de Concordia recherche universitaire en génomique, biologie cellulaire et le vieillissement.

Matériel et méthodes <ol><li> Les souches de levures et de conditions de croissance La souche de type sauvage BY4742 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) a été cultivé en milieu riche YEPD (extrait de levure 1%, 2% de peptone, glucose 2%). Les cellules ont été cultivées à 30 ° C avec rotation agitation à 200 rpm dans des erlenmeyers à un &quot;flacon de volume / moyen volume&quot; ratio de 5:1. </li><li> Stockage des cellules de levure pour l&#39;extraction des lipides <ol><li> Une culture de 50 ml de cellules a été récolté par centrifugation à 3000 xg pendant 5 minutes. </li><li> Lavée deux fois avec de l&#39;eau froide. <ol style=" list-style-type:lower-alpha;"><li> Resuspendre le culot dans 25 ml d&#39;eau glacée </li><li> Cellules Pellet centrifuger à 3000 xg pendant 5 minutes </li></ol></li><li> Reprendre le culot et le transfert à tube Eppendorf </li><li> Par centrifugation, 16000 xg pendant 2 minutes, retirer le surnageant et congeler à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. (Nous utilisons un bécher d&#39;alcool isopropylique conservés dans le congélateur -80, l&#39;azote liquide peut également être utilisé) </li></ol></li><li> Réactifs Biotech grade et le chloroforme méthanol étaient de Sigma-Aldrich. Les acides gras libres et les triglycérides ont été achetés auprès Larodan (Malmö, Suède). Diverses espèces de phospholipides - y compris la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, le phosphatidylinositol, la phosphatidylsérine, l&#39;acide phosphatidique, et cardiolipines - ont été obtenus à partir de lipides polaires Avanti (Alabaster, Alabama, USA). Haute vitesse des tubes à centrifuger en verre avec des bouchons en téflon ont été doublés de Fisher. </li></ol> L&#39;extraction des lipides Ceci est une modification du protocole décrit par Bligh et Dyer 8. Toutes les manipulations avec les lipides extraits devrait être fait en utilisant des pipettes en verre ou des seringues, des plastiques va créer un signal de fond de grandes si elles entrent en contact avec du chloroforme. Les volumes exacts ne sont pas critiques pour autant que les ratios de 1:2:0.8 pour le chloroforme - MeOH - H 2 O à l&#39;étape 3 et 2:2:1.8 pour le chloroforme - MeOH - H 2 O à l&#39;étape 7 sont conservés. <ol><li> Resuspendre les cellules congelées dans 1,6 ml de glace froide distillée H 2 O. </li><li> Transfert 1,6 ml de la suspension cellulaire à haut débit des tubes à centrifuger en verre. </li><li> Ajouter 6 ml de chloroforme et de MeOH (1:2) mélanger et 0,8 ml de perles de verre à la suspension cellulaire. </li><li> Vortex la suspension cellulaire avec des perles de verre deux fois pendant 1 min. </li><li> Ajouter 2 ml de chloroforme et mélanger délicatement. </li><li> Incuber pendant 5 min à température ambiante avec mélange occasionnel. </li><li> Ajouter 2 ml de H 2 O distillée et mélanger doucement. </li><li> Incuber pendant 5 min à température ambiante avec mélange occasionnel. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante. </li><li> Recueillir toute la phase liquide dans un nouveau haut-débit tube à centrifuger en verre. </li><li> Ajouter 3,2 ml de chloroforme pour les culots de cellules de l&#39;étape 9. </li><li> Vortex deux fois pendant 1 min. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante. </li><li> Ajouter le surnageant dans la phase liquide de l&#39;étape 10. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante. </li><li> Jeter la partie supérieure (aqueuse) et le transfert de phase inférieure (phase organique) dans un nouveau haut-débit tube à centrifuger en verre. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante. </li><li> Transférer le surnageant entier dans un flacon en verre et sec sous azote. </li><li> Dissoudre le film lipidique dans 500 ul de chloroforme et de stocker à -20 ° C. </li></ol> Analyse des lipides par spectrométrie de masse Un mélange stock de lipides dans le chloroforme normes doivent être préparées à l&#39;avance conformément au tableau 1, ainsi que d&#39;une solution stock de MeOH - chloroforme (1:1) avec 0,1% (v / v) d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium. <ol><li> Avant l&#39;injection, mélanger 10 ul d&#39;un échantillon de 10 ul du mélange standard de lipides dans le Tableau 1. En 200 pl de 1:1 chloroforme: méthanol avec 0,1% de NH 4 OH. <ul><li> La norme ratio de l&#39;échantillon peut être changé dès que nécessaire. </li></ul></li><li> Résoudre les lipides en utilisant un Micromass Q-TOF 2 spectromètre de masse équipé d&#39;une source d&#39;exploitation de nano-electrospray à un débit de 1 l / min. <ul><li> Paramètres de l&#39;instrument exact varie d&#39;un instrument à l&#39;. Voir tableau 2 pour les paramètres d&#39;un Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) équipé d&#39;une source de nano-électrospray. Bien que nous avons pris avantage de la haute résolution d&#39;un type Q-TOF du spectromètre de masse, ce n&#39;est pas une exigence obligatoire. </li></ul></li><li> Après l&#39;acquisition des spectres de masse sont lissées, fond soustrait et centré, et puis la liste de pointe exportés vers Excel. Les pics de chaque classe de lipides sont ensuite normalisés à leur standard interne. Selon l&#39;application, il peut être nécessaire ne effectuer un post-traitement tels que deisotoping et déconvolution. </li></ol> Normes le tableau 1. Lipides internes, leurs concentrations dansle mélange standard, et le mode MS pour leur analyse. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Classe des lipides </td><td> Composition de la chaîne standard </td><td> Messe de la norme </td><td> Concentration (pg / ml) </td><td> MS Mode </td></tr><tr><td> L&#39;acide phosphatidique </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 591,40 </td><td> 100 </td><td> Négative </td></tr><tr><td> Phosphatidyléthanolamine </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 634,45 </td><td> 200 </td><td> Négative </td></tr><tr><td> Phosphatidylinositol </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Négative </td></tr><tr><td> Phosphatidylsérine </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 622,37 </td><td> 40 </td><td> Négative </td></tr><tr><td> Cardiolipine </td><td> 4x14: 0 </td><td> 619,92 </td><td> 100 </td><td> Négative </td></tr><tr><td> Les acides gras libres </td><td> 19:00 </td><td> 297,28 </td><td> 100 </td><td> Négative </td></tr><tr><td> La phosphatidylcholine </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 650,48 </td><td> 100 </td><td> Positive </td></tr><tr><td> Triacylglycérols </td><td> 13:0 / 13:0 / 13:0 </td><td> 698,63 </td><td> 200 </td><td> Positive </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Paramètres pour un instrument Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) équipé d&#39;une source de nano-électrospray. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Débit </td><td> Tension de cône </td><td> Tension capillaire </td><td> Gaz de collision </td></tr><tr><td> Mode positif </td><td> 1μl/min </td><td> -28 V </td><td> 3,0 kV </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Mode négatif </td><td> 1μl/min </td><td> 30 v </td><td> -3,2 KV </td><td> 10 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+lipokine%2C+a+lipid+hormone+linking+adipose+tissue+to+systemic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism.</a> Cell. 134, 933-944 (2008).</li>
<li>Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+defines+the+interactome+of+the+major+ADP%2FATP+carrier+protein+of+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane.</a> J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).</li>
<li>Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signal+from+inside+the+peroxisome+initiates+its+division+by+promoting+the+remodeling+of+the+peroxisomal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).</li>
<li>Russell, S. J., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of ageing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).</li>
<li>Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+storage+and+degradation+of+neutral+lipids+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).</li>
<li>Br&uuml, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &amp, F. T., Lehmann, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+biological+membrane+lipids+at+the+low+picomole+level+by+nano-electrospray+ionization+tandem+mass+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).</li>
<li>Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+%28ESI-MS%2FMS%29+analysis+of+the+lipid+molecular+species+composition+of+yeast+subcellular+membranes+reveals+acyl+chain-based+sorting%2Fremodeling+of+distinct+molecular+species+en+route+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
</ol>

Cette méthode permet une évaluation quantitative rapide du lipidome levure à l&#39;aide disponible, des matériaux peu coûteux. La méthode permet l&#39;identification de la plupart des espèces de lipides dans les cellules de levure à l&#39;exception de diacylglycérols, ergostérols et esters ergosteryl, bien que ces lipides peuvent être identifiés en remplaçant l&#39;hydroxyde d&#39;ammonium avec de l&#39;hydroxyde de lithium. La méthode décrite permet l&#39;identification et la quantification des lipides à des concentrat...

une évaluation quantitative du lipidome levure en utilisant la spectrométrie de masse électrospray ionisation

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Les lipides sont une des principales classes de biomolécules et de jouer des rôles importants dynamique de la membrane, le stockage de l&#39;énergie, et la signalisation<sup&gt; 1-4</sup&gt;. La levure bourgeonnante<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Un eucaryote génétiquement et biochimiquement manipulable avec des unicellulaires génome annoté et lipidome très simple, est un précieux modèle pour étudier les fonctions biologiques des espèces lipidiques différents eucaryotes multicellulaires<sup&gt; 2,3,5</sup&gt;.<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; A 10 principales classes de lipides avec des longueurs de chaîne principalement de 16 ou 18 atomes de carbone et zéro ou un degré d&#39;insaturation<sup&gt; 6,7</sup&gt;. Les méthodes existantes pour l&#39;identification et la quantification des lipides - comme la chromatographie liquide à haute performance, chromatographie sur couche mince, de microscopie par fluorescence et chromatographie en phase gazeuse suivie par MS - sont bien établis, mais ont une faible sensibilité, insuffisamment séparés diverses formes moléculaires de lipides, de lipides nécessitent dérivatisation avant à l&#39;analyse, ou peut être beaucoup de temps. Nous présentons ici une description détaillée de notre approche expérimentale pour résoudre ces limitations inhérentes en utilisant l&#39;enquête de balayage ESI / MS pour l&#39;identification et la quantification de l&#39;effectif total de lipides dans les cellules de levure. La méthode décrite ne nécessite pas de séparation chromatographique de mélanges de lipides complexes récupérés de cellules de levure, ce qui accélère considérablement le processus d&#39;acquisition de données. Cette méthode permet l&#39;identification et la quantification des lipides à des concentrations aussi faibles que g / ml et a été appliquée avec succès pour évaluer lipidomes des cellules de levure entier et leurs organites purifiés. L&#39;extraction des lipides à partir des cellules de levure entière pour l&#39;utilisation de cette méthode d&#39;analyse des lipides prend deux à trois heures. Il ne faut que cinq à dix minutes à courir chaque échantillon de lipides extraits et séché sur un spectromètre de masse Q-TOF équipé d&#39;une source de nano-électrospray.

Nous décrivons une nouvelle méthode quantitative lipidomique pour identifier les espèces de lipides dans la levure à l&#39;aide de nombreuses enquêtes-scan spectrométrie de masse electrospray ionisation (ESI / MS). Cette méthode dépasse actuellement les méthodes disponibles pour l&#39;identification et la quantification des lipides dans la capacité à résoudre les diverses formes moléculaires de lipides, la sensibilité et la vitesse.

Une évaluation quantitative du lipidome levure en utilisant la spectrométrie de masse électrospray ionisation

Les lipides constituent l'une des principales classes de biomolécules et jouent des rôles importants dans la dynamique membranaire, le stockage de l'énergie et la signalisation1-4. La levure bourgeonnante...

Ce protocole permet d'analyser rapidement les composants majeurs du lipidome de la levure. Il commence par la récolte et le lavage des cellules de levure. Les cellules lavées sont placées dans un mélange de chloroforme et de méthanol (1:2) et lysées à l'aide de billes de verre.L'ajout de chloroforme et d'eau permet de séparer les deux phases. La phase organique est récupérée, séchée, puis le film lipidique est dissous dans du chloroforme pour être stocké avant la spectrométrie de masse. Les lipides extraits sont dilués dans un mélange de chloroforme et de méthanol contenant de l'hydroxyde d'ammonium, et un mélange d'étalons internes est ajouté.La solution lipidique peut maintenant être injectée directement dans le spectromètre de masse. Bonjour, je suis Simon Bork du laboratoire de Vladimir Teco au Département de biologie de l'Université Concordia. Aujourd'hui, je vais vous montrer une méthode permettant de quantifier les lipides de levure à l'aide de la spectrométrie de masse.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les modifications des lipides de levure dans différentes conditions de croissance. Commençons donc. Pour commencer cette procédure, resuspend

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