Une évaluation quantitative du lipidome levure en utilisant la spectrométrie de masse électrospray ionisation

Ce protocole permet d’analyser rapidement les principaux composants des lipides de levure. Il commence par la récolte et le lavage des cellules de levure. Les cellules lavées sont placées dans un mélange de chloroforme et de méthanol et lysées avec des billes de verre.

L’ajout de chloroforme et d’eau sépare les deux phases. La phase organique est recueillie, séchée, puis le film lipidique est dissous dans du chloroforme pour être stocké avant la spectroscopie de masse. Les lipides extraits sont dilués dans du chloroforme et du méthanol avec de l’hydroxyde d’ammonium et un mélange d’étalons internes est ajouté.

La solution lipidique peut maintenant être injectée directement dans le spectromètre de masse. Bonjour, je m’appelle Simon Bork et je travaille du laboratoire de Vladimir Teco au Département de biologie de l’Université Concordia. Aujourd’hui, je vais vous montrer une méthode pour quantifier les lipides de levure à l’aide de la spectroscopie de masse.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les changements de lipides de levure dans différentes conditions de croissance. Alors commençons. Pour commencer cette procédure, réanimez les granulés de levure congelés préalablement préparés dans 1,6 millilitre de glace, d’eau distillée froide, et transférez 1,6 millilitre de suspension cellulaire dans des tubes de centrifugation en verre à grande vitesse.

Notez que tout au long de cette procédure, toutes les manipulations avec les lipides extraits se font à l’aide de pipettes ou de seringues en verre. Étant donné que les plastiques créent un signal de fond important, s’ils entrent en contact avec le chloroforme, commencez l’extraction des lipides en ajoutant six millilitres d’un mélange de méthanol de chloroforme dans un rapport de un à deux et 0,8 millilitre de billes de verre mesurées dans un tube einor à la suspension cellulaire. Les volumes exacts ne sont pas critiques tant que le rapport de un à deux pour 0,8 pour le chloroforme, le méthanol et la levure en suspension dans l’eau est conservé. Tourbillon.

La suspension cellulaire et les billes de verre se mélangent deux fois pendant une minute à chaque fois, continuent en ajoutant deux millilitres de chloroforme et en mélangeant doucement, puis incuberont pendant cinq minutes à température ambiante avec un mélange occasionnel. Après les cinq minutes d’incubation, ajoutez deux millilitres d’eau distillée et mélangez doucement. Là encore, incubez pendant cinq minutes à température ambiante avec un mélange occasionnel.

Ici aussi, il est plus important de maintenir le rapport de deux à deux à 1,8 pour le chloroforme, le méthanol et l’eau plutôt qu’un volume spécifique. Lorsque la deuxième incubation est terminée. Centrifugez pendant cinq minutes à 3000 Gs à température ambiante, collectez tout le surnageant de cette première extraction dans un nouveau tube de centrifugation en verre à grande vitesse et ajoutez 3,2 millilitres de chloroforme aux pastilles cellulaires restantes pour une deuxième extraction lipidique.

Vortex les pastilles cellulaires avec le chloroforme ajouté deux fois pendant une minute à chaque fois. Puis centrifuger pendant cinq minutes à 3000 Gs À température ambiante, ajouter le surnageant de cette deuxième extraction au surnageant recueilli après la première extraction. Ensuite, centrifugez les surnageants collectés pendant cinq minutes.

À 3000 Gs à température ambiante, les lipides extraits sont maintenant dissous dans la phase organique inférieure. Jetez la phase aqueuse supérieure et transférez la phase inférieure dans un nouveau tube de centrifugation en verre à grande vitesse. Pour produire des spectres plus propres sur la centrifugeuse du spectromètre de masse, la phase organique pendant cinq minutes à 3000 Gs à température ambiante et pour transférer l’intégralité du surnageant dans un flacon en verre.

Séchez les lipides dissous sous de l’azote, dissolvez le film lipidique séché dans 500 microlitres de chloroforme et stockez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à analyser les échantillons par spectrométrie de masse. Commencez par préparer un mélange standard des lipides dans le chloroforme, comme indiqué dans le tableau un qui se trouve dans le protocole écrit ci-joint. Chaque lipide représente une classe différente.

Cette solution peut être conservée à moins 20 degrés Celsius pour être utilisée plus tard avant l’injection des lipides extraits dans le spectromètre de masse. Combinaison de 10 microlitres de l’échantillon avec 10 microlitres du mélange standard de lipides. Notez que le rapport standard/échantillon peut être modifié au besoin.

Résoudre le mélange d’échantillons et de lipides étalons à l’aide d’un spectromètre de masse micro Q à F deux, équipé d’une source d’électronébulisation nano fonctionnant à un débit d’un microlitre par minute. Les paramètres sont détaillés dans le tableau deux du protocole écrit ci-joint. Bien que l’utilisation de la haute résolution d’un spectromètre de masse Q à F soit avantageuse, elle n’est pas une exigence obligatoire.

Les paramètres exacts de l’instrument varient d’un spectromètre de masse à l’autre. Après l’acquisition des données, les spectres de masse sont lissés, le bruit de fond soustrait et les pics sont centrés. Enfin, exportez la liste des pics vers excel.

Normalisez ensuite les pics de chaque verre lipidique à leur étalon interne. Selon l’application, il peut être nécessaire d’effectuer d’autres post-traitements, tels que la désisotope et la déconvolution. Cette méthode permet de déterminer rapidement et en profondeur les principaux composants du lipide de levure

Ici, nous avons mis en évidence un lipide, qui a été de l’isotope de convoluté et normalisé à son étalon interne. Nous venons de vous montrer comment isoler les lipides de levure et comment déterminer les lipides de levure à l’aide de la spectroscopie de masse à ionisation d’affichage électrique. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’éviter l’utilisation de plastiques et de maintenir votre échantillon dans la plage linéaire des concentrations.

Cette méthode est assez flexible et, dans de nombreux volumes, peut être modifiée selon les besoins. Ce protocole d’extraction convient également à d’autres méthodes d’analyse des lipides, telles que la chromatographie sur couche mince et la spectroscopie de masse multidimensionnelle. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.