Name: Préparation et de la culture dexplants Objectif Rat épithéliales pour létude de la différenciation terminale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: Découvrez la culture d'explants épithéliaux du cristallin chez le rat nouveau-né pour étudier la différenciation terminale induite par le FGF-2. Cette méthode permet d'analyser l'expression génique et la signalisation cellulaire.

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La préparation des explants épithéliales du cristallin a été adaptée à partir des méthodes origine dans le laboratoire du Dr John McAvoy 9. Ce travail est financé par le National Eye Institute, Programme de recherche intra-muros Z01-EY000238-22

Partie 1: Retrait des lentilles Matériel et réactifs: <ol><li> Micro-dissection ciseaux, courbes, bouts arrondis, (tels as.RS-5983, Roboz instruments chirurgicaux Co., Inc, Gaithersburg, MD), les micro-dissection des pincettes, pointe recourbée (comme Roboz # RS5137). </li><li> Milieu de suspension: Milieu 199 contenant 0,1% d&#39;albumine sérique bovine, 100 unités / ml de pénicilline, la streptomycine 100μg/ml, 2,5 pg / ml d&#39;amphotéricine B. Réactifs sont disponibles chez Invitrogen, Carlsbad, CA. </li></ol> Procédure: <ol><li> Euthanasier les rats nouveau-nés (âgés de 2-4 jours), conformément aux directives fournies par le National Institutes of Health, Bethesda, MD. </li><li> Retirez les paupières avec des ciseaux chirurgicaux. Appuyez doucement avec des pinces courbées sur les côtés opposés de l&#39;orbite de l&#39;œil pour forcer l&#39;œil à gonfler vers l&#39;extérieur. Faire une petite incision sur le côté postérieur de l&#39;œil avec les ciseaux. En appuyant avec des pincettes contre le côté de l&#39;œil opposé de l&#39;incision, la lentille et une petite quantité de corps vitré fixé peut alors être forcé à travers la rupture, permettant à la lentille pour être ramassé avec des pincettes courbes. Il faut prendre soin de ne pas briser la capsule du cristallin. </li><li> Utilisez la pince à épiler courbée pour transférer les lentilles dans un plat en plastique 60mm tissus de culture contenant 5ml chaud, milieu de suspension stérile. </li></ol> Partie 2: Microdissection d&#39;explants Matériel et réactifs: <ol><li> Micro brucelles à dissection, 0,1 mm conseils, (comme Roboz RS-4976). Nous utilisons en alliage Dumostar raison de la flexibilité de la pointe, mais d&#39;autres alliages d&#39;acier sont aussi acceptables. Brucelles avec pointes plus mince que 0,1 mm ne sont pas recommandés, car ils ont tendance à casser ou plier lors de cette procédure. </li><li> Milieu de suspension (voir partie 1) </li><li> Non supplémenté milieu F12 de Ham ou Medium 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) </li></ol> Procédure: <ol><li> Les étapes suivantes devraient être effectuées dans un endroit propre, sans courant d&#39;environnement en utilisant des outils de dissection et stériles milieu stérile. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un microscope stéréoscopique, nettoyer les lentilles de tout tissu adhérant à la pointe de 0,1 mm et une pince à épiler les transférer à une boîte de culture contenant 5ml 60mm seconde milieu de suspension stérile (cette étape permet de réduire la contamination). Avec la pince à épiler, le transfert, le nombre souhaité de lentilles pour une boîte de culture contenant 35mm 5ml stérile, milieu non. (Nous utilisons souvent F12 de Ham (Invitrogen) pour cette étape, car la faible concentration de colorant rend la dissection plus facile, cependant, le milieu 199 est également acceptable Pas d&#39;antibiotiques ou autres ajouts sont nécessaires pendant cette étape..) Autant que 12 explants peuvent être faites dans le centre d&#39;un plat de cette taille. Toutefois, un plat de 35 mm doit être utilisé même si moins explants sont à faire, parce que les outils de dissection ne peut pas être manipulé facilement dans un petit plat. Transférer le plat contenant les lentilles restantes à un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient nécessaires. </li><li> Identifier la face postérieure de la lentille. Il ya plusieurs façons de reconnaître cela: 1) Le postérieur est plus ronde que l&#39;antérieure, qui est légèrement aplatie, 2) les lentilles rat nouveau-né sous forme de cataractes froid, car ils refroidir à température ambiante pendant la dissection. Si la cataracte froid n&#39;a pas complètement rempli l&#39;objectif, le côté postérieur est le côté le plus éloigné de la région opaque. Si l&#39;opacité a rempli l&#39;objectif, le réchauffement de la parabole à 37 ° C pendant quelques minutes sera l&#39;inverse. Le côté postérieur peuvent être identifiés comme les réformes de la cataracte au refroidissement. 3) Les vestiges de la tunique vasculosa lentis peuvent être visibles sur le côté postérieur. 4) La suture postérieure peut être visible sur le côté postérieur. Identifier correctement le côté postérieur est essentiel, car c&#39;est là que la capsule sera ouverte. Ouverture de la lentille sur la face antérieure va déchirer l&#39;épithélium. </li><li> Une fois le côté postérieur a été identifié, le tourner vers le haut et saisir la lentille dans la pince à gauche (pour un travailleur droitier). Puis pincer la capsule postérieure avec la pincette droit de produire un petit pli. </li><li> Tout en tenant la capsule postérieure avec la pince à épiler droite, saisir le pli de la capsule avec les pinces à gauche et tirez les deux paires de pinces à épiler dans des directions opposées pour faire une petite déchirure de la capsule. </li><li> Alors saisissant le bord de la capsule se rétracter à la pince à épiler, retirez la baisse, d&#39;abord sur un côté, puis de l&#39;autre, en le pressant dans le plastique de la boîte avec la pince à épiler. Répétez cette opération plusieurs fois, se déplaçant tout autour de l&#39;équateur de la lentille, jusqu&#39;à ce que la capsule est fermement attaché à la plaque en de nombreux points. Tenir la capsule en place avec les pinces à gauche, secouez légèrement la masse de fibres avec les pincettes droit de rompre l&#39;attachement entre les cellules des fibres et des cellules épithéliales à l&#39;équateur de l&#39;objectif. Puis poussez la masse de fibres de là, rouler hors de la capsule / épithélium, qui reste attaché au fond de laplat. Continuez ce processus avec toutes les lentilles dans le plat. Retirez et jetez les masses de fibres (ou les enregistrer congelés comme une source de protéines du cristallin pour les autres études). </li></ol> Partie 3: microdissection et de culture d&#39;explants centrale Matériel et réactifs: <ol><li> Stérile scalpel jetable, n ° 15 lame, (Cincinnati Surgical Co. Cincinnati, OH) </li><li> Phosphate stérile saline tamponnée avec du calcium et du magnésium (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Milieu de culture: milieu de suspension contenant 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc St Louis, MO). </li></ol> Procédure: <ol><li> Avec un scalpel stérile, rogner l&#39;épithélium périphérique (PE), qui contient des cellules dans les premiers stades de la différenciation (figure 1A), laissant une place centrale d&#39;environ 2,0 mm sur un côté, composé de cellules épithéliales centrale uniquement (CE) (figure 1B). </li><li> Placer la capsule contenant les explants centrale à un cabinet de biosécurité. Laver 3 fois avec du PBS stérile contenant du calcium et de magnésium et une fois avec 1 ml de frais, milieu de suspension équilibrée (37 ° C CO, 5% 2). Ces lavages de réduire considérablement la probabilité de contamination. </li><li> Ajouter 2 mL de milieu de culture pour induire la différenciation 1, et le lieu des explants dans un incubateur humidifié, incubateur de culture tissulaire à 37 ° C, 5% de CO 2. Périodes de la culture peut être aussi courte que quelques heures ou de prolonger aussi longtemps que deux à trois semaines, en fonction du paramètre étudié. Milieu doit être changé tous les deux à trois jours. </li></ol> Partie 4: La récolte des explants pour l&#39;analyse des événements liés à une différenciation 1. Explants récolte pour l&#39;analyse de protéines ou d&#39;ARN Matériaux: <ol><li> Brucelles Microdissecting </li><li> SDS Lysis Buffer ou de l&#39;ARN-tard </li></ol> Procédure: <ol><li> A la fin de la période d&#39;incubation, éliminer le milieu de culture. </li><li> Utilisation du microscope stéréoscopique, détacher doucement les bords de chaque explant. </li><li> Soulevez chaque explant avec la pince à épiler et le transférer dans un tube contenant environ 100 ul de tampon de lyse SDS (pour l&#39;analyse des protéines) ou d&#39;ARN-tard (pour l&#39;analyse de l&#39;ARN). Agiter la pointe de la pince à épiler dans la solution pour s&#39;assurer que l&#39;explant ne colle pas à la pince à épiler. </li></ol> 2. Explants récolte pour immunofluorescence Matériel et réactifs: <ol><li> Tampon phosphate salin avec du calcium et du magnésium (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Tampon phosphate salin (sans calcium ni magnésium) (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Paraformaldéhyde à 4% (bioproduits Boston, Worcester, MA) </li><li> Brucelles Microdissecting </li><li> Hydrophobe marqueur </li><li> Lames de microscope </li><li> 0,25% de Triton X-100 en tampon phosphate salin. </li></ol> Procédure: <ol><li> Rincer brièvement les explants dans du PBS contenant du calcium et du magnésium. </li><li> Fixer les tissus en ajoutant paraformaldéhyde à 4% pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Retirer le fixateur et le remplacer par un tampon phosphate salin. Explants fixes deviennent un peu raide, leur permettant d&#39;être levé et transféré à lames de verre pour l&#39;immunocoloration. </li><li> Placer une petite goutte de PBS (sans calcium et magnésium) sur la diapositive pour aider à positionner le tissu et empêcher le curling. L&#39;aide de pincettes microdissecting, ascenseur de l&#39;explant et l&#39;insérer dans la goutte sur la lame. Sans toucher l&#39;explant, retirez soigneusement le liquide avec une mèche de papier pour aplatir l&#39;explant sur le verre et laissez le tissu sécher à l&#39;air à température ambiante pendant 3 à 5 minutes. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1 A. L&#39;épithélium périphériques exprime une différenciation des protéines spécifiques. L&#39;explant a été montré immunocolorées pour la N-cadhérine immédiatement après microdissection. L&#39;expression est vu dans une bande de cellules de l&#39;épithélium périphérique, ce qui indique que les cellules de cette région ont commencé à se différencier. B. L&#39;épithélium périphérique peut être coupé, pour supprimer les cellules qui expriment la N-cadhérine et d&#39;autres protéines spécifiques de différenciation. L&#39;anneau rouge représente l&#39;emplacement des cellules qui expriment la N-cadhérine, tandis que le petit carré décrites dans le quadrant grise représente de l&#39;épithélium montré dans le panneau 1A. L&#39;épithélium périphérique peut être enlevé par quatre coupes de scalpel, laissant une place centrale qui contient uniquement des cellules qui n&#39;ont pas encore commencé à se différencier.

<ol><li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li>
<li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li>
<li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+major+intrinsic+protein+%28MIP%29%2Faquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li>
<li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+%28ERK1%2F2%29+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li>
<li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li>
<li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6%2C+c-Maf%2C+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li>
<li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li>
</ol>

Le système explant rat lentille a été utilisé avec succès par un certain nombre de laboratoires pour étudier la différenciation terminale des cellules épithéliales du cristallin aux fibres optique 21,3,4,5. Lorsqu&#39;ils sont exposés à FGF-2 au 100ng/ml les explants va commencer à montrer les changements dans la signalisation dans les minutes 6, avec des changements dans la morphologie et l&#39;expression des gènes apparaissant séquentiellement sur ​​plusieurs jours 3,4,5. Les cultures restent viables pendant 2-3 semaines, si on prend soin d&#39;éviter toute contamination. Les explants centrale décrite dans ce protocole sont particulièrement utiles pour l&#39;étude de la séquence des événements associés à la différenciation, car ils contiennent peu ou pas de cellules qui expriment des marqueurs de différenciation, avant le FGF-2 est ajouté 1,5. Les cellules se différencient ensuite synchrone, comme une cohorte, ce qui permet de suivre l&#39;évolution temporelle de la signalisation et les événements transcriptionnels associés à la différenciation. Explants de culture différentes longueurs de temps fournit donc des informations précises sur les événements temporels séquence. Des inhibiteurs spécifiques peuvent être ajoutés au milieu de culture afin d&#39;identifier les voies de signalisation pertinente. Explants peuvent être utilisés pour analyser l&#39;expression des protéines par électrophorèse sur gel SDS et immunoempreinte ou pour analyser l&#39;expression des ARNm spécifiques par RT-PCR. Protéines rendements large de 20 à 50 mg / explant et le rendement en ARN est d&#39;environ 200 à 600 ng / explant, selon la longueur de la période de culture. En général, nous constatons que 5-6 explants par boite fournira suffisamment de protéines ou d&#39;ARN pour des essais de plusieurs années. ARN à partir d&#39;explants peut également être utilisé pour préparer l&#39;ADNc pour évaluer l&#39;expression des gènes par l&#39;analyse des microréseaux, qui permet d&#39;identifier de nouveaux gènes qui peuvent être cruciaux pour la différenciation. Explants peuvent également être transfectées. Bien que l&#39;efficacité de la transfection est généralement faible, il est suffisant pour le dosage de gènes rapporteurs 4, 7, 8. Immunofluorescence des explants fournit un complément utile à des méthodes biochimiques, en déterminant la localisation subcellulaire des protéines d&#39;intérêt. Ainsi, la préparation et à la culture d&#39;explants lentilles rat fournit un système puissant pour l&#39;étude de différenciation terminale optique chez les mammifères, ce qui peut compléter des techniques in vivo, comme la génération de souris transgéniques et knock-out.

préparation et de la culture d&#39;explants objectif rat épithéliales pour l&#39;étude de la différenciation terminale

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

La surface antérieure de la lentille oculaire est recouverte par une monocouche de cellules épithéliales, qui prolifèrent dans une zone annulaire sous le corps ciliaire. Après la division, ces cellules migrent arrière, où la diffusion de la rétine FGF induit à se différencier dans un tableau postérieure de cellules allongées en fibres optique, qui composent le gros de la lentille. La différenciation des cellules épithéliales du cristallin en fibres lentille peut être induite in vitro par des explants en culture de la région centrale de l&#39;épithélium antérieur, en présence de FGF-2. Les explants sont préparés à partir des lentilles de rats nouveau-nés en enlevant le cristallin de l&#39;œil et de saisir la capsule du cristallin sur la face postérieure avec des pincettes dissection. La capsule postérieure est déchirée puis doucement ouvert et enfoncé dans le fond d&#39;un plat en plastique culture de tissus. Les régions périphériques de l&#39;explant sont enlevés avec un scalpel et la zone centrale est ensuite mis en culture en présence du FGF-2 100ng/ml aussi longtemps que 2-3 semaines, selon les paramètres à étudier. Comme les cellules épithéliales de différencier les explants cultivés en synchronie approximative sur une période de quelques jours ou semaines, le cours du temps de la signalisation et l&#39;expression des gènes peut être déterminé en utilisant des techniques moléculaires, biochimiques et pharmacologiques. Immunofluorescence est un complément puissant à ces méthodes, car elle démontre la localisation subcellulaire des protéines d&#39;intérêt et peuvent révéler les conséquences physiologiques de manipulations expérimentales des voies de signalisation.

Des explants de la région centrale du cristallin chez le rat l&#39;épithélium de différencier de manière synchrone lorsque cultivées en présence de FGF-2. Microscopie par immunofluorescence de ces cultures peut fournit des informations roman sur l&#39;expression des gènes et des événements de signalisation associées à la différenciation terminale.

Préparation et de la culture d&#39;explants Objectif Rat épithéliales pour l&#39;étude de la différenciation terminale

La surface antérieure du cristallin est recouverte d'une monocouche de cellules épithéliales, qui prolifèrent dans une zone annulaire située sous le corps ciliaire.

Cette procédure commence par l'extraction des lentilles chez des rats âgés de deux à quatre jours et leur nettoyage de tout tissu adhérent. La face postérieure de la lentille est identifiée et une petite déchirure est pratiquée dans la capsule. La capsule est ensuite pelée vers le bas et appliquée contre le fond de la boîte.Ce processus est répété tout autour du cristallin. La masse des fibres du cristallin est retirée en effectuant un mouvement de bascule latéral. L'épithélium périphérique est découpé et les échantillons sont ensuite mis en culture.Enfin, ils sont transférés dans un tube à essai pour une analyse biochimique ou sur une lame de verre pour la microscopie. Bonjour, je suis Peggy Lanka au laboratoire de Biologie moléculaire et développementale de l'Institut national de la santé oculaire aux NIH. Bonjour, je suis Al Tu, également du laboratoire de Biologie moléculaire et développementale de l'Institut national de la santé oculaire.Je suis Chung Ga, également du même laboratoire au NEI. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour l'excision et la culture d'épithélium lentillaire provenant de rats nouveau-nés. Nous allons vous montrer comment retirer la région périphérique de l'épithélium, qui contient des cellules aux premiers stades de différenciation.Ensuite, nous allons vous montrer comment induire la différenciation des cellules épithéliales centrales du cristallin restantes en fibres cristalliniennes en les exposant à l'FGF. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le moment des événements impliqués dans la différenciation terminale. Nous récoltons l'EXPLAN à différents moments après l'ajout d'FGF dans le milieu de culture.Ensuite, nous analysons l'expression protéique par immunotransfert, l'expression ARN par R-T-P-C-R ou par puces à ADN, et nous réalisons une immunomarquage de l'explant pour déterminer la localisation sous-cellulaire des protéines d'intérêt. Commençons donc par prélever les lentilles de rats nouveau-nés. Pour commencer, utilisez des ciseaux de dissection microchirurgicaux afin d'extraire les lentilles des yeux de rats euthanasiés âgés de deux à quatre jours en pratiquant une petite incision postérieure et en appuyant sur le côté opposé.Transférez les lentilles dans une boîte de culture plastique de 60 millimètres contenant cinq millilitres de milieu de suspension stérile tiède, à l’aide de pinces munies d’une pointe de 0,1 millimètre. Nettoyez tout tissu adhérent sur les lentilles et transférez-les dans une seconde boîte de culture de 60 millimètres contenant cinq millilitres de milieu de suspension stérile. Cette étape permet de réduire la contamination par les pinces.Transférez le nombre souhaité de lentilles dans une boîte de culture de 35 millimètres contenant deux millilitres de milieu stérile non supplémenté. Jusqu'à 12 x explants peuvent être préparés au centre d'une boîte de cette taille. Toutes les lentilles supplémentaires peuvent être conservées dans la deuxième boîte de 60 millimètres préparée précédemment et placées dans une incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius jusqu'à une heure avant leur utilisation pour produire des explants X.Repérez maintenant le côté postérieur du cristallin. Je peux dire que ces deux-là sont positionnés avec leur face antérieure vers le haut. Je vais les tourner sur la tranche afin que vous puissiez les observer de bout, et vous verrez la cataracte froide, qui correspond à une zone opaque située au centre.Le côté le plus éloigné du centre opaque est le côté postérieur. Je le retourne donc sur le côté postérieur. Sur le côté postérieur, on peut également observer ces stries, qui sont les vestiges de cette tératovasculite.C'est un réseau de vaisseaux sanguins situé autour de la périphérie du cristallin qui marque également la face postérieure. Exact. L'identification est cruciale, car c'est à cet endroit que la capsule sera ouverte. Ouvrir le cristallin du côté antérieur déchirerait l'épithélium.Il existe plusieurs façons d'identifier le côté postérieur. Premièrement, il est plus arrondi que le côté antérieur, qui est légèrement aplati. Deuxièmement, les lentilles de rat nouveau-né forment des cataractes froides lorsqu'elles refroidissent à la température ambiante pendant la dissection.Si la cataracte froide n’a pas encore complètement rempli le cristallin, le côté postérieur correspond au côté le plus éloigné de la région opaque. Si l’opacité a envahi tout le cristallin, réchauffer la boîte à 37 degrés Celsius pendant quelques minutes permettra de l’inverser. Le côté postérieur peut être identifié lorsque la cataracte se reforme lors du refroidissement.Des vestiges tertiaires des VASIs de la tunique peuvent être visibles sur le côté postérieur. Enfin, la suture postérieure peut être visible sur le côté postérieur. Une fois le côté postérieur identifié, tournez-le vers le haut et soutenez la lentille avec la pince gauche.Ensuite, pincer la capsule postérieure avec la pince droite pour former un petit pli tout en maintenant la capsule postérieure avec la pince droite, saisir le pli de la capsule avec la pince gauche et tirer les deux paires de pinces en sens opposés afin de créer une petite déchirure dans la capsule ; tout en maintenant le bord de la capsule rétractée avec les pinces, la tirer d'abord vers le bas d'un côté, puis de l'autre, en l'aplatissant contre le fond en plastique de la boîte à l'aide des pinces. Répéter cette opération plusieurs fois, en faisant le tour de l'équateur de la lentille jusqu'à ce que la capsule soit fermement fixée à la plaque. À de nombreux endroits, maintenir la capsule en place avec la pince gauche et, à l'aide de la pince droite, balancer doucement la masse de fibres afin de rompre l'attachement entre les cellules fibreuses et les cellules épithéliales au niveau de l'équateur de la lentille.Maintenant, tirez délicatement la masse de fibres en la roulant hors de la capsule, qui reste attachée au fond de la boîte. Répétez ce processus pour toutes les lentilles présentes dans la boîte. Les masses de fibres peuvent être jetées ou congelées et conservées comme source de protéines de lentille pour d'autres études impliquant la microdissection complète de l'explant épithélial entier.Examinons la microdissection et la culture de l'explant central. À l'aide d'un scalpel stérile, retirez l'épithélium périphérique, qui contient des cellules au stade initial de différenciation. Conservez un carré central d'environ deux millimètres de côté, composé de cellules épithéliales centrales.Transférez uniquement la boîte contenant l'explant central dans une hotte de sécurité biologique. Lavez les aubergines trois fois avec du PBS stérile et une fois avec un millilitre de milieu de suspension frais équilibré. Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu de culture pour induire la différenciation et placez l'explant dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone.La durée de la culture peut aller de quelques heures à deux ou trois semaines, selon le paramètre étudié. Le milieu doit être renouvelé tous les deux ou trois jours avec une microdissection et une complétude de Turing. Commençons la récolte des explants pour analyse.À la fin de la période d'incubation, retirez le milieu de culture à l’aide de pinces de dissection microchirurgicales. Desserrez délicatement les bords de chaque explant. Saisissez chaque explant avec les pinces et transférez-le dans un tube contenant environ 100 microlitres de tampon de lyse SDS pour l’analyse des protéines ou de RNAlater pour l’analyse de l’ARN. Agitez délicatement l’extrémité des pinces dans la solution afin de vous assurer que l’explant ne reste pas collé aux pinces.Les explants sont désormais prêts pour l'analyse des protéines ou de l'ARN ; ils peuvent également être analysés par immunofluorescence. Commencez par rincer brièvement les explants dans du PBS. Fixez les tissus en ajoutant du paraformaldéhyde 4 % pendant 30 minutes.À température ambiante, retirez le fixateur et remplacez-le par du PBS. Les explants deviennent légèrement rigides, ce qui permet de les soulever et de les transférer sur des lames en verre pour la coloration immunohistochimique. Déposez une petite goutte de PBS sans calcium ni magnésium sur la lame afin de positionner le tissu et d'éviter qu'il ne se recroqueville. À l’aide de pinces de dissection microchirurgicales, soulevez l’explant et insérez-le dans la goutte sur la lame sans le toucher ; utilisez ensuite soigneusement une mèche en papier pour éliminer le liquide et aplatir l’explant sur la lame.Laisser sécher le tissu à l'air à température ambiante pendant trois à cinq minutes. Les implants sont maintenant prêts pour une analyse en immunofluorescence. On voit ici un exemple d'un explant entier de l'épithélium microdisséqué qui a été immunomarqué pour NCO, un marqueur d'adhérence cellulaire.Au stades précoces de la différenciation, seules les cellules situées dans la région périphérique de l'épithélium présentent une coloration positive pour cette protéine en cours de clivage. L'épithélium périphérique, tel que décrit dans ce protocole, laisse un explant central qui contient peu, voire aucune, cellule exprimant de manière cohérente. Ceci est démontré par immunotransfert, comparant les tissus épithéliaux central et périphérique, et un immunotransfert pour GA.DH a été utilisé afin de confirmer que les échantillons protéiques avaient été chargés de manière équivalente.Le moment des événements associés à la différenciation peut être déterminé en cultivant des explants centraux pendant différentes durées. Les explants centraux ont été cultivés pendant 2, 5, 24 et 48 heures dans un milieu avec ou sans 100 nanogrammes par millilitre de FGF. Les explants X ont été récoltés aux moments indiqués et transférés dans un tampon d'échantillonnage SDS pour analyse par immunobuvardage.Les résultats montrent que l'expression du protéine cohérente finale est induite après 24 à 48 heures en culture. Le transfert Western pour GA DH démontre que les échantillons protéiques ont été chargés de manière équivalente.Immunomarquage des explants centraux cultivés pendant quatre jours en l'absence ou en présence de 100 nanogrammes par millilitre de FGF, montrant que l'immunofluorescence de la N-cadhérine est fortement augmentée dans les explants exposés au FGF. L'immunofluorescence montre également la localisation subcellulaire de la N-cadhérine au niveau des limites entre cellules.Nous venons donc de vous montrer comment préparer des épithéliums de lentille en culture pour étudier la différenciation. Le principal avantage de ce système est que les cellules se différencient de manière synchrone. Cela permet de déterminer la séquence des événements.En outre, nous pouvons ajouter des facteurs de croissance ou des inhibiteurs spécifiques au milieu afin d'activer ou de bloquer des voies de signalisation particulières. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de prévenir toute contamination en effectuant la dissection et la préparation du milieu stérile dans un environnement propre, ainsi qu'en observant attentivement l'explant avant de le mettre en culture. Voilà donc tout ce qu'il faut savoir.Merci d'avoir regardé. Bonne chance avec votre expérience. Au revoir. Au revoir.

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