Name: Culture de la souris de neurones précurseurs de cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 27 min 44 s
Description: Découvrez la culture de neurones précurseurs isolés du cortex embryonnaire de souris. Cette méthode permet d'étudier le développement cérébral et les mécanismes de neurogenèse in vitro.

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<ol><li> Précurseurs neuronaux de la souris (PNJ) ont été isolés à partir du cortex E12.5 embryon. </li><li> Couches de la peau et mésenchymateuses ont été retirés de vésicules télencéphalique disséqué. </li><li> Les vésicules ont été incubés dans de la trypsine 0,05% à 0,02% EDTA et 0,2% de BSA dans du HBSS pendant 20 minutes à 37 ° C. </li><li> Trypsinisation a été arrêté par un volume égal de 1 inhibiteur mg / ml trypsine de soja (Sigma # T6522) dans HBSS. </li><li> Tissu de digestion ont été dissociées en utilisant plusieurs séries de trituration avec des pipettes Pasteur polie au feu. </li><li> Les cellules ont été lavées une fois avec 0,2% de BSA dans du HBSS et étalées à 50.000 cellules / ml sur la laminine enduit de lamelles dans les médias avec 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml FGF2 (R &amp; D Systems ou Peprotech), et 2 ug / ml d&#39;héparine ( Sigma). </li></ol>

<ol><li>Currle, D., Cheng, X., Hsu, C., Monuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+roles+of+CNS+dorsal+midline+cells+in+choroid+plexus+epithelial+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect roles of CNS dorsal midline cells in choroid plexus epithelial formation.</a> Development. 132 (15), 3549-3559 (2005).</li>
<li>Flanagan, L., Rebaza, L., Derzic, S., Schwartz, P., Monuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J Neurosci Res. 83, 845-856 (2006).</li>
</ol>

De grands progrès dans notre compréhension du développement du SNC et biologie des cellules souches ont été rendues possibles par notre capacité à récolter, isoler et cultiver des cellules embryonnaires souches neurales. Cette vidéo montre la dissection du cortex de souris E12.5 cérébrale et la désagrégation ultérieure et la culture d&#39;embryons des cellules souches neurales. Beaucoup d&#39;autres d&#39;autres méthodes similaires ont été employées avec succès par d&#39;autres chercheurs.

<table><tbody><tr><td>Ciseaux droits pour iris</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux moyens</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux micro</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinces courbées</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr></tbody></table>

culture de la souris de neurones précurseurs de cellules souches

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primaire cultures de cellules souches neurales sont utiles pour étudier les mécanismes sous-jacents développement du système nerveux central. Recherche sur les cellules souches va augmenter notre compréhension du système nerveux et peut nous permettre de développer des traitements pour les maladies du cerveau actuellement incurables et des blessures. En outre, les cellules souches doivent être utilisés pour la recherche sur les cellules souches destinées à l&#39;étude détaillée des mécanismes de différenciation neuronale et transdifférenciation et les signaux environnementaux et génétiques qui dirigent la spécialisation des cellules dans des types cellulaires particuliers. Cette vidéo montre une technique utilisée pour désagréger les cellules à partir du jour 12,5 prosencéphale embryonnaire dorsale de souris. La procédure de dissection comprend la récolte d&#39;embryons de souris E12.5 de l&#39;utérus, en supprimant la «peau» avec de fines pinces à disséquer, et enfin d&#39;isoler des morceaux de cortex cérébral. Après la dissection, le tissu est digéré et dissociées mécaniquement. Les cellules resuspendues dissociées sont ensuite cultivées en &quot;cellules souches&quot; des médias qui favorise la croissance des cellules souches neurales.

Cette vidéo décrit la méthode utilisée pour l&#39;isolement de neuroprecursors du cortex en développement de souris embryonnaires. La procédure pour la suppression des embryons dans l&#39;utérus, la dissection du tissu cortical, et digérant le cortex cérébral est démontré isolés.

Culture de la souris de neurones précurseurs de cellules souches

Les cultures primaires de cellules souches neurales sont utiles pour étudier les mécanismes sous-jacents au développement du système nerveux central. La recherche sur les cellules souches augmentera...

Voici donc la première étape de l'isolement, de la dissociation et de la culture des cellules souches neurales. Tout d'abord, je vais revêtir une plaque de 24 puits. Elle n'est pas traitée pour la culture de tissus.Je vais l'enduire de laminine afin que les cellules adhèrent. Tout d'abord, je vais l'enduire d'un mélange d'eau et de poly-L-lysine. J'ajouterai environ 450 microlitres par puits.Je vais donc simplement, j'ai donc recouvert la moitié de la plaque, ces deux rangées ici, avec la solution de poly-D-lysine. Et je vais incuber pendant cinq minutes à température ambiante, directement dans la hotte. L'incubation a donc duré cinq minutes.Je vais simplement retirer la solution de PDL à l’aide d’un vide ici. Action d’aspiration. Maintenant, je vais rincer à nouveau les puits avec de l’eau, environ 450 microlitres.Aucun temps d'incubation réellement pour le rinçage à l'eau. Je vais simplement aspirer l'eau. Maintenant, je vais ajouter la solution de stratification.Le laminine est dissoute dans le milieu EM à deux microgrammes par millilitre. J'ajoute donc 450 microlitres de la solution de laminine à chaque échantillon ; pour l'instant, je recouvre du plastique. Vous auriez également pu recouvrir des lamelles dans ces puits.Je vais incuber les cellules à 37 degrés dans un incubateur de culture tissulaire pendant au moins quatre heures. J'ai donc deux pincettes fines courbées à un angle de 45 degrés. J'ai également une paire de ciseaux fins, eux aussi courbés à un angle de 45 degrés.Quelques pinces émoussées uniquement pour la dissection initiale de l'utérus et de grandes ciseaux pour la découpe chez la femelle. Très bien, ceci est une souris CD1, femelle normale. Elle est enceinte d'embryons âgés de 12 jours et demi.J'ai déjà sacrifié l'animal par asphyxie au CO2 et dislocation cervicale. Et maintenant, je vais retirer l'utérus puis les embryons. Tout d'abord, je dois désinfecter la zone abdominale avec de l'éthanol à 70 %.J'attrape mes grandes pinces au milieu de son abdomen et vers la moitié inférieure, j'effectue une incision, je pose mes instruments et j'arrache simplement la peau, exposant à nouveau l'abdomen en saisissant au même endroit. Je fais une autre incision au milieu, puis je coupe latéralement pour ouvrir la femelle. Maintenant, j'expose les embryons.Voici son utérus, gonflé d'embryons. Je fais donc la première incision juste en dessous des ovaires, j'ôte la graisse au fur et à mesure tout en tirant vers le haut. Je pose ce côté vers le bas et je ne saisis qu'entre les embryons.Il est évident que saisir les embryons par le haut pourrait endommager le tissu. Et c'est évident. Ils ressemblent à une grappe de raisin.Prendre entre les grappes, encore une fois, couper au-dessus de l'ovaire de l'autre côté et retirer le tissu adipeux. La coupe finale sera effectuée ici au milieu. Encore une fois, je retire le tissu adipeux.Voici l'utérus avec les embryons. Mon milieu de dissection est constitué de PBS, de 0,6 % de glucose et de pénicilline-streptomycine. Je vais d'abord rincer les embryons dans ce milieu de dissection afin d'éliminer le sang.Donc, ma dissection est propre. Je vais donc couper le long de l'utérus, du côté opposé à la graisse, afin d'exposer les embryons. Où est la graisse ?Il est de l'autre côté parce qu'on ne peut pas le voir. Il y a donc un embryon exposé ici. Je peux vous montrer à quoi cela ressemble au microscope.Voici donc à quoi cela ressemble sous le microscope. Je vais inciser le long de ce côté de l'utérus. Côté opposé, le tissu adipeux.Observez la graisse ici, je peux bien voir la graisse. Je vais donc simplement inciser le long de la partie supérieure sur toute la longueur. Vous pouvez constater que les embryons sortiront au fur et à mesure que j'ouvre l'utérus vers le bas.Un peu plus au nord. Oh, en voilà un. Magnifique. Vous faites donc une incision sur le côté opposé à la graisse, là où les embryons sortent juste.Oui, ils le sont tous. Il y en a quelques-uns ici qu'il faut parfois retrouver en revenant en arrière et en ouvrant quelque chose si on les a manqués. Alors, s'agit-il de l'amnion ou du chorion et du, ceci est le chorion.L'amnios est à l'intérieur, est étroitement associé à l'embryon. Vous ne pouvez pas vraiment voir l'amnios depuis ici. Une fois que j'aurai sorti l'embryon, vous verrez, je peux dire que ceux-ci sont plus petits et je n'irai pas les utiliser.Mais voilà tous les embryons exposés. J'ai donc maintenant les embryons exposés ici. Je vais retirer les couches qui entourent l'embryon, puis transférer l'embryon dans un plat propre pour la dissection fine.Il y a donc la première couche. Une fois que je l'ai retirée, je cherche généralement le cordon ombilical. C'est un tissu assez résistant.Et je peux effectivement soulever l'animal par le cordon ombilical. C'est exactement cela. Pouvez-vous le montrer du doigt ?Oui, juste là. Voyez le, oui, le vaisseau rouge, ce truc en forme de poire. Oui. C'est le cordon ombilical, il est attaché à l'abdomen, et je tends généralement la main et je l'attrape.Voilà. J'enlève maintenant la peau de la tête de l'embryon. Cela expose le cortex cérébral, là où je vais prélever les cellules.Ainsi, avec ma main gauche, je vais simplement percer l’arrière de l’embryon pour le maintenir fermement en place. Je le tiens contre le fond de la boîte. De ma main droite, je vais introduire la pince sous l’œil, puis sous la peau, la percer et ensuite l’arracher.Donc, j'ai maintenant un bord ici que je peux saisir. Très bien. Ensuite, avec mes quatre autres doigts, je saisis le bord opposé et j'ôte la peau, et généralement le mésenchyme sous-jacent vient avec elle. Vous pouvez maintenant voir l'hémisphère droit exposé, orienté vers le nord.Je vais retourner l'embryon et essayer de trouver un autre bord à saisir. Il y a donc un autre bord de peau. Retournez-le et continuez à décoller.Voilà. On expose le cortex cérébral. Maintenant, je vais simplement pincer la tête pour me placer dans une meilleure position afin de prélever des fragments du cortex cérébral.Donc, je pince simplement avec mes pinces, frotte avec une autre paire de pinces en dessous, en le coupant net. Et voici une vue dorsale. Ici, on peut observer une vue dorsale du cerveau antérieur, les deux hémisphères du cortex cérébral, le diencéphale, puis autour, le mésencéphale.Voici comment procéder pour prélever les fragments destinés à l'association des cellules souches neurales. Je vais maintenant saisir l'embryon avec la pince gauche afin de le maintenir fermement comme ceci. Cela me donne une bonne position et un bon angle pour découper des morceaux du cortex.Alors maintenant, avec mes fines ciseaux, j'entre et je coupe simplement le cortex cérébral antérieur comme ceci. Je me ménage un orifice afin de réaliser ma coupe latérale, et j'effectue une incision proche de la ligne médiane dorsale, mais j'évite les cellules de la ligne médiane en essayant d'isoler les précurseurs neuronaux ou neuroprécurseurs situés dans le cortex. Ceci est donc un fragment provenant du cortex cérébral.Et comme vous pouvez le constater, il y a un épaississement ici du côté droit. C'est en réalité le début de l'élévation latérale du GIC, que nous ne souhaitons pas conserver dans notre prélèvement, car nous nous intéressons aux précurseurs du cortex dorsal. Je vais donc simplement le retirer.Je ne vous laisse que les cellules issues du cortex dorsal. Je vais maintenant passer à l'autre côté. Même méthode.C’est un peu plus maladroit parce que je suis droitier, mais là encore, effectuez l’incision antérieure, placez vos ciseaux dans le trou. Coupez le long du côté dorsal, puis du côté latéral. Cette fois, je vais essayer d’éviter les ganglions maniaques visibles.Voici donc les deux fragments provenant des hémisphères du cortex dorsal. J'utilise maintenant une pointe de pipette P1000 coupée pour transférer les cortex dans un tube conique de 15 ml contenant du milieu de dissection, où ils resteront pendant que je poursuis la dissection du reste de la portée. Je vais simplement aspirer un fragment maintenant.Je transfère maintenant les corticaux depuis la boîte vers le tube conique de 15 ml contenant le milieu de dissection, où ils resteront pendant que je dissection le reste de la portée. J'ai maintenant terminé la dissection de toute la portée, et je vais aspirer l'excès de milieu de dissection, en laissant une petite quantité de liquide ainsi que les corticaux. J'ajoute maintenant environ 500 microlitres de trypsine et d'EDTA, puis je place le tube dans un bain-marie à 37 degrés pendant 20 minutes.Après l'incubation de 20 minutes, j'ajoute 500 microlitres d'inhibiteur de la trypsine de soja. Ensuite, je vais dissocier mécaniquement les cellules à l'aide d'une pipette Pasteur polie à la flamme, ayant un très petit diamètre. Je cherche à introduire le moins de bulles d'air possible, mais si cela arrive, ce n'est pas grave non plus.Vous montez et descendez environ cinq à dix fois et les cellules doivent se disperser en une nuée. Maintenant, je vais centrifuger les cellules à 1000 tr/min, à 25 degrés pendant une minute. Après la centrifugation, je vais éliminer le liquide excédentaire par aspiration, en laissant un petit culot, à peine visible.On dirait une petite couche de SA au fond de ce tube conique. Je pense qu'une petite quantité de liquide suffit, en faisant très attention de ne pas aspirer le culot. Évidemment, j'ajoute maintenant de la solution de lavage au culot.Très bien, une autre centrifugation à 1 000 tr/min, à 25 degrés pendant une minute. Encore une fois, je vais aspirer le liquide excédentaire en laissant uniquement le culot cellulaire et une très petite quantité de liquide après l'aspiration. Je vais ajouter le milieu de croissance souhaité contenant les facteurs de croissance.Évidemment spécifique à l'expérience de culture, le volume que je vais ajouter dépend du nombre d'embryons que j'ai disséqués et de leur âge. Typiquement, pour une portée entière d'embryons E 12 et demi, vous pouvez ajouter jusqu'à environ 700 microlitres. Pour cela, je vais en ajouter environ 300 microlitres afin de concentrer un peu plus mes cellules. Prendre ma plaque revêtue de laminine hors de l'incubateur.Il s'est écoulé au moins quatre heures. Je vais maintenant aspirer le milieu lamellaire. Ensuite, je vais effectuer un rinçage avec mon milieu de croissance.Je rince avec environ 300 microlitres et j'aspire puis ajoute 400 microlitres de milieu de croissance. J'ai compté mes cellules à l'aide d'un cytomètre Hema et je vais ensemencer environ 100 000 cellules par puits. Dans cette plaque 24 puits.Chaque expérience nécessite un nombre différent de cellules par puits. Pour mon dosage particulier, 100 000 cellules se sont révélées appropriées. Je place les cellules dans l'incubateur de culture tissulaire, à 37 degrés et 5 % de CO2, et je les laisse en culture pendant environ un jour.Ils adhéreront au lambeau et s'étaleront après 24 heures. J'ajouterai mes facteurs de croissance souhaités pour mon dosage particulier.

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