Purification de population cellulaire spécifique par le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Bonjour, je suis Hope Campbell de Cytométrie en flux spécialiste de l’Institut de recherche sur le sang du Centre de sang du Wisconsin. Bonjour, je suis STR Baso, étudiante diplômée dans le laboratoire du Dr Bonnie Dieter. Je suis également à l’Institut de recherche sur le sang du Centre de transfusion sanguine du Wisconsin.

Aujourd’hui, nous allons effectuer une procédure d’isolement des cellules à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence. Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour étudier la fonction des lymphocytes et des populations de cellules myéloïdes. Commençons.

Dans cette procédure, quatre lymphocytes T B et CD seront purifiés à partir de cytes de souris. Le nombre de cellules cibles doit être calculé en fonction du nombre de cellules nécessaires et du taux de récupération de la machine à l’aide de cette méthode. Le taux de récupération typique des lymphocytes T B et CD quatre est de 85 à 90 %La population initiale de cytes SP est d’environ 60 à 70 % de lymphocytes B et 20 à 30 % de lymphocytes T.

Ainsi, si vous commencez avec 100 fois 10 à six cellules, vous serez en mesure de récupérer 50 à 60 millions de cellules B et 20 à 30 millions de cellules T avant de commencer les faits. Les solutions et les réactifs nécessaires au protocole doivent être placés sur de la glace. Il s’agit notamment d’un tampon de coloration composé d’une solution saline tamponnée au phosphate avec 3 % de sérum de veau fœtal, d’un tampon de suspension de sérum de veau composé de 25 millimolaires préparés dans une solution saline équilibrée de Hank ou d’un HBSS contenant 3 % de sérum de veau fœtal A, d’une solution d’hépatite B de 25 millimolaires préparée dans des anticorps de coloration sérique de veau fœtal et de billes de compensation.

Ce protocole nécessite également les alimentations et les réactifs suivants : tubes coniques de 15 millilitres, tubes d’écoulement en polystyrène ou en polypropylène de 12 x 75 millimètres. Une crépine cellulaire en nylon trien bleu et un hémocytomètre de tri des tubes de collecte doivent également être préparés à l’avance.

À 300 microlitres de la solution FCS de he dans les tubes d’écoulement ou un millilitre de la solution FFC S de HEPs dans des tubes coniques de 15 millilitres. Ceux-ci doivent être placés sur de la glace jusqu’à ce que le processus de collecte commence. Commencez par générer une suspension cellulaire unique de la population cellulaire souhaitée.

Si les cellules isolées, en utilisant cette procédure, seront cultivées. L’ensemble de la préparation cellulaire doit être effectué dans une hotte de culture tissulaire. À l’aide d’une technique stérile, lavez les cellules une fois en ajoutant un tampon de coloration glacial et réanimez, en suspendant les cellules en inversant le tube plusieurs fois.

Ensuite, centrifugez les cellules pendant sept à huit minutes à environ 250 GS quatre degrés Celsius. Les conditions de lavage peuvent varier en fonction du type de cellule et de la concentration. Pour les cytes, laver jusqu’à 200 fois 10 à six cellules avec 10 millilitres de tampon de coloration.

Retirez soigneusement le surnageant par aspiration afin que la pastille cellulaire reste intacte. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans un tampon de coloration à froid glacé à une concentration allant jusqu’à 50 fois 10 à six par 100 microlitres. Remettez la pastille en suspension en effleurant ou en tourbillonnant doucement le tube.

Transférez ensuite 0,25 à une fois 10 des six cellules dans un nouveau tube d’écoulement en polystyrène ou en polypropylène de 12 x 75 millimètres sur de la glace. Et mettez-le de côté pour l’utiliser plus tard comme échantillon de contrôle non coloré dans le premier tube, ajoutez des anticorps primaires à la suspension cellulaire pour atteindre la concentration finale souhaitée. Ici, les anticorps anti B conjugués rouges de PE Texas, deux anticorps 20 sont utilisés pour colorer les lymphocytes B, tandis que les anticorps anti TCR R bêta et 700 conjugués ZI, les anticorps anti CD quatre sont utilisés pour colorer les lymphocytes T mélangés en effleurant le fond du tube ou par la lumière.

Vortexing puis placez les cellules sur de la glace et incubez dans l’obscurité pendant 20 à 30 minutes. Après l’incubation, laver les cellules marquées par Resus, en les suspendant dans 10 millilitres de suspension glacée, tampon et centrifusion comme précédemment, après retrait soigneux du surnageant. Répétez cette étape pour laver les cellules une deuxième fois.

Enfin, remettez les cellules en suspension dans un tampon de suspension glacial. Si les anticorps primaires ne sont pas directement conjugués à un fluoro quatre, ajoutez des anticorps secondaires marqués ou un streptocoque AVID conjugué à la suspension cellulaire et encore une fois, incubez les cellules sur de la glace dans l’obscurité pendant 20 à 30 minutes après l’incubation. Lavez les cellules deux fois avec un tampon de suspension glacé.

Après ressusciter, suspendre les cellules dans un tampon de suspension glacé. Déterminez la concentration et la viabilité des cellules à l’aide d’un colorant vital tel que le bleu trian et l’hémocytomètre. Ajustez la concentration cellulaire à 10 à 20 fois 10 à six cellules par millilitre en ajoutant un tampon de suspension pour éviter d’obstruer le télécopieur avec des grappes de cellules qui pourraient être mortes pendant l’isolement.

Procédure et coloration. Filtrez les cellules à travers une passoire goutte à goutte immédiatement avant de commencer le protocole de tri. La taille des pores de la crépine doit être choisie en fonction du type de cellule pour les cytes, une passoire avec une taille de pore de 40 micromètres est utilisée.

Collectez les cellules filtrées dans un tube conique de 15 litres ou des tubes à débit de 12 x 75 millimètres selon le volume. Et placez les cellules sur de la glace pendant que le cytomètre est configuré pour la procédure de tri. Si vous utilisez des billes de comp BD comme témoins positifs d’une seule couleur, préparez un tube de contrôle pour chaque couleur utilisée dans le test ainsi qu’un tube de contrôle négatif non coloré.

Après avoir soigneusement vortexé les suspensions de billes, ajoutez-en une, déposez chacune des suspensions de billes négatives et positives dans un tampon de suspension de 100 microlitres pour chaque couleur utilisée et le contrôle négatif. Ensuite, ajoutez un microlitre de l’anticorps marqué dans chaque tube de contrôle positif. Dans cette expérience, un tube est préparé à l’aide de deux anticorps PE TexasRed B deux 20.

L’un utilisant des anticorps bêta ETCR en forme et l’autre utilisant lor 700 CD, quatre anticorps mélangés en effleurant le fond des tubes et incubés pendant 15 à 30 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Lavez les billes une fois avec deux millilitres de colorant, tamponnez et centrifugez à 200 G pendant 10 minutes. Retirer le surnageant par aspiration et remettre en suspension la bille dans 200 à 500 microlitres de coloration.

La mise en place du tampon du cytomètre en flux varie selon le fabricant et ne doit être effectuée que par du personnel dûment formé. La procédure de tri cellulaire sera effectuée ici à l’aide des défauts BD aria. Avant de trier, sélectionnez la buse appropriée en fonction du type de cellule à trier.

Les tailles disponibles pour l’aria des faits sont de 70 micromètres, 100 micromètres et 130 micromètres. La taille de la buse doit être au moins trois fois la taille de la cellule à trier pour les lymphocytes, la buse de 70 micromètres est sélectionnée. Le tri aseptique des cellules peut être effectué à l’aide de l’option de tri aseptique de l’instrument.

En utilisant cette option, l’ensemble du chemin de la gaine est décontaminé avec de l’éthanol à 70 % selon les instructions du fabricant. Assurez-vous de remplacer les filtres de gaine et de remplacer le PBS par du PBS stérile. Une fois que le cytomètre est prêt à fonctionner, placez les tubes de prélèvement pré-réfrigérés contenant des tas de FCS dans le dispositif de collecte approprié.

Les dispositifs de collecte disponibles peuvent contenir jusqu’à deux tubes coniques de 15 millilitres. Quatre tubes de 12 x 75 millimètres ou quatre micro-tubes. Utilisez des tubes de 12 x 75 millimètres pour collecter moins de 1,5 fois 10 à la sixième cellule et des tubes coniques de 15 millilitres pour collecter 1,5 fois 10 à la sixième cellule.

Placez le dispositif de collecte approprié dans la chambre de collecte de tri. Dirigez les flux latéraux dans le dispositif de collecte installé pour les tris multicolores. Le cytomètre doit d’abord être calibré pour tenir compte du chevauchement spectral entre les détecteurs.

L’exemple présenté ici illustre le chevauchement entre les spectres d’émission de fit E et pe. Ce chevauchement illustré dans la zone ombrée sombre est appelé débordement. Ici, le débordement PE serait détecté dans le canal E ajusté et le débordement Fit E serait détecté dans le canal PE.

Ce débordement doit être corrigé afin d’éliminer la fluorescence résiduelle d’un étage quatre dans un autre canal. Le processus de correction du débordement est appelé compensation pour effectuer une compensation manuelle. Utilisez un logiciel de cytométrie pour mettre en place un modèle qui comprend un tracé bivarié pour afficher le FSC de diffusion vers l’avant et le SSC de diffusion latérale et un histogramme pour chaque fluro qui sera utilisé.

La méthode de mise en place de ces tracés varie en fonction du logiciel. Placez le tube de commande négative dans l’orifice de chargement du cytomètre et commencez l’acquisition des données pendant que l’échantillon est en cours d’exécution. Ajustez le FSC et le SSC pour placer la population d’intérêt sur l’échelle.

Ajustez ensuite les paramètres PMT de fluorescence pour placer la population négative ou l’autofluorescence dans la partie la plus à gauche de l’histogramme. Enregistrez le tube de contrôle négatif. Retirez le tube de contrôle négatif de l’orifice de chargement du cytomètre et remplacez-le par le premier tube de contrôle positif.

Commençons maintenant l’acquisition. Répétez ce processus pour chacun des tubes de contrôle positif en enregistrant les données de chaque tube. Pour chaque contrôle positif, tracez une porte d’intervalle ou une boîte autour des événements enregistrés sur l’histogramme.

Dessinez ensuite une autre porte d’intervalle dans la partie négative de l’histogramme. Lorsque vous effectuez une compensation manuelle, tenez compte de chaque fluro utilisé dans l’expérience en ajustant la médiane des positifs jusqu’à ce qu’elle soit égale à la médiane des négatifs. Pour ajuster la médiane, ajustez les valeurs de chevauchement spectral, à la hausse ou à la baisse, jusqu’à ce que les médianes de chaque paramètre fluorescent correspondent le plus possible.

À l’aide des paramètres établis pour les échantillons de contrôle positifs et négatifs, préparez-vous à la procédure de tri en déterminant les paramètres de marche de l’échantillon expérimental. Placez le tube de cellules à trier dans l’orifice de chargement du cytomètre et commencez l’acquisition à une vitesse de neuf à 10 000 événements par seconde. Sélectionnez un graphique à points pour afficher la dispersion vers l’avant par rapport à la diffusion latérale.

La diffusion vers l’avant est un indicateur général de la taille de la cellule et est placée sur l’axe des x, tandis que la diffusion latérale est un indicateur de la granularité de la cellule et est placée sur l’axe Y. Maintenant, dirigez-vous vers la population d’intérêt. Une fois les portes déterminées, assurez-vous que la température de l’orifice de chargement du cytomètre est réglée à quatre degrés Celsius.

Placez ensuite le tube d’échantillon expérimental dans l’orifice de chargement. Appuyez sur l’option de tri et commencez l’acquisition Les tubes de collecte doivent être placés sur de la glace au fur et à mesure qu’ils sont remplis. Continuez le tri jusqu’à ce que le nombre souhaité de cellules ait été collecté ou jusqu’à ce que le tube d’échantillon soit vide.

Arrêtez ensuite le tri en sélectionnant à nouveau le bouton de tri et retirez l’échantillon de l’orifice de chargement. Ensuite, placez le tube de prélèvement directement sur l’orifice de chargement du cytomètre et acquérez 500 à 1000 événements. En utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour le tri des lymphocytes T, la procédure de tri a augmenté la pureté de 21 à 99 %Pour les lymphocytes B, la population initiale de lymphocytes B de 5 % a été augmentée à 98 % après le tri.

Nous venons donc de vous montrer comment purifier la population de cellules B et T des cytes par fax. N’oubliez pas que les faits peuvent être utilisés pour purifier n’importe quelle population cellulaire si une suspension de cellule unique peut être générée et que des anticorps appropriés sont disponibles. De plus, les cellules empilées génétiquement avec des marqueurs fluorescents peuvent facilement être purifiées sans l’utilisation d’anticorps.

De plus, n’oubliez jamais d’utiliser les commandes appropriées pour vos expériences et vérifiez toujours la configuration de votre laser de cytométrie en flux pour vous assurer que vous utilisez les bons fluorochromes et assurez-vous d’utiliser les portes appropriées pour qu’elles soient correctement autour de vos populations. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.