Name: Profilage anticorps par immunoprécipitation Systèmes luciférase (LIPS) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-07T17:25:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Apprenez le profilage anticorps par immunoprécipitation luciférase (LIPS) pour quantifier les anticorps dans des extraits bruts de cellules COS-1. Cette méthode efficace facilite le diagnostic et le suivi des maladies.

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Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros de l&#39;NIDCR.

1. Aperçu schématique: Cette vidéo montre les étapes nécessaires à réaliser le dosage LIPS. Les antigènes sont exprimés dans les cellules COS1 que la luciférase de Renilla recombinante (RUC)-antigène fusions, et des extraits bruts sont obtenus et utilisés sans purification. Le dosage de LIPS est initiée par l&#39;incubation crud e Ruc-antigène des extraits avec des sérums de patients dans les puits de microtitration. Le mélange antigène-anticorps est ensuite transférée à une plaque de 96 puits filtre contenant la protéine A / G perles pour capturer les molécules d&#39;IgG. Après avoir lavé le filtre à plaques contenant la protéine, un anticorps / G perles, liée Ruc-antigène est mesurée par l&#39;addition du substrat coelentérazine et les unités de la lumière sont mesurées avec un luminomètre. PARTIE 1: La transfection de plasmides pour la production de protéines de fusion Renilla-antigène Set-up: COS1 cellules sont cultivées dans du DMEM-FCS 10% en utilisant des protocoles standard de culture de tissus. Plasmides pour Renilla luciférase fusions ont été décrits précédemment 1. ADN de ces plasmides est préparé en utilisant un kit de Qiagen Midiprep. Le rendement devrait être d&#39;environ 1 mg -3. Mesurer la concentration d&#39;ADN et de stocker en tant que mg 1000 / ml de solution concentrée à -20 ° C. Procédure: <ol><li> Un jour avant la transfection Cos-1, diviser les cellules en nouvelle 100 x 20 mm plats à environ 2 x 10 6 par plaque et incuber à 37 ° C. </li><li> Le jour suivant, les cellules COS-1 devrait être de 80-95% confluentes. Étiquette tubes de 1,5 ml de microcentrifugation en polypropylène pour chaque ADN plasmidique à transfecter. Laisser le réactif de transfection FuGENE-6, qui est stocké à 4 ° C, se réchauffer à température ambiante. </li><li> Ajouter 94 ul d&#39;Opti-MEM médias pour chaque tube de centrifugeuse. Ensuite, ajoutez 6 pl d&#39;FuGENE 6 aux médias Opti-MEM sans toucher la paroi latérale. </li><li> Incuber le mélange pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter 1-2 ug (en stock ADN 1mg/ml) du plasmide de fusion antigène Renilla luciférase construire. Mélanger et incuber le mélange pendant 15 minutes à température ambiante. </li><li> Transférer la solution d&#39;ADN-FuGENE 6 Opti-MEM pour les cellules en la goutte uniformément dans les médias de l&#39;COS1 cellules. </li></ol> PARTIE 2: Récolte Renilla-antigène Fusions <ol><li> Deux jours après transfection, les cellules COS-1 sont récoltées. Ceci est initiée par la suppression des médias et puis à rincer les cellules avec 6 ml de PBS. Après décantation du PBS, une pipette de suite tout résidu PBS de la boîte de culture tissulaire. </li><li> Ajouter 1,4 ml de tampon de lyse froid composé de 50 mM Tris, pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, 1% de Triton X-100, glycérol 50%, et les inhibiteurs de protéase (2 comprimés de cocktail miniprotease inhibiteur de terminer par 50 ml de tampon de lyse). Récolte des cellules avec un racloir cellulaire et transférer rapidement la moitié de la lysat à chacun des deux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation sur la glace. </li><li> Un Sonifier Branson 150 est utilisée pour briser les cellules ouvertes. Placer le microtube contenant le lysat cellulaire sur la glace et le pouls pendant 5 sec, 5 sec et 5 sec avec les réglages sonication de 2, 2 et 4, respectivement. </li><li> Centrifuger le lysat cellulaire à 12 500 RPM pour deux rotations 4 minute à 4 ° C. Après la première rotation, retourner doucement les tubes pour éliminer les débris lâchement de la paroi latérale du tube. Après la seconde vrille, transférer soigneusement le surnageant, sans perturber le culot, à partir de deux tubes d&#39;un tube de micro nouvelles sur la glace. </li><li> Calculer les unités légères (UGB) par de lysat. Pour mesurer la LU, diluer 1 de lysat avec 8 pi de PBS dans un tube de centrifugeuse de nouvelles. Directement ajouter 100 ul de substrat 1X coelentérazine au mélange dilué et mesurer immédiatement la luminescence dans le tube en utilisant un luminomètre tubes (20/20 n Turner scientifique) avec une lecture de 5 secondes. </li><li> Stocker le lysat Ruc-antigène à -20 ° C pendant 1-2 jours ou stocker pour une longue période de temps en aliquots à -80 ° C. </li></ol> PARTIE 3: Préparer une plaque de Sera maître <ol><li> Faites une plaque maître sérums en ajoutant d&#39;abord 450 pi de tampon A (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, 1% Triton X-100) dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits profonds polypropylène microtitration . À cette étape, un colorant, rouge de phénol, peuvent également être inclus dans le tampon A (concentration finale est de 0,2 ug / ml dans le tampon A) pour agir comme un traceur pour la surveillance future ajout de l&#39;échantillon des sérums et autres étapes de l&#39;essai LIPS. </li><li> Ensuite, ajoutez 50 pl de sérum de chaque échantillon dans les puits différents contenant 450 pi de tampon A. Notez que ceci est une dilution 1:10 de l&#39;sérum dans le tampon A. Typiquement sérums ne sont pas ajoutées aux deux derniers puits de la plaque maître car ceci est réservé pour les blancs de mémoire tampon. </li><li> Avant d&#39;utiliser la plaque de maître, il est largement ébranlée (1-2 heures) sur une plate-forme des rotateurs. Le sérum de la plaque maître est stable pour au moins 1 mois (ou plus) à 4 ° C, si stocké correctement pour éviter l&#39;évaporation. </li><li> Comme décrit ci-dessous, cette plaque maître fournit 10 l de sérum dilué à plusieurs reprises enlevé pour le profilage des sérums dirigés contre les antigènes multiples. Plaques maîtres grands et petits peuvent aussi être employées. Sceller la plaque bien avec Parafilm quand il n&#39;est pas utilisé. </li></ol> PARTIE 4: dosage de LIPS <ol><li> Polypropylène 96-superficielle des plaques de microtitration et sont utilisés pour tester les sérums. Dans la première étape, ajouter 40 ul de tampon A dans chaque puits de la plaque de 96 puits en utilisant une micropipette à 8 canaux. </li><li> Prenez ensuite 10 ul de dilution des sérums (1 équivalent ul sérums) de la plaque de maître et de l&#39;ajouter directement à chaque puits de la plaque de travail en utilisant une micropipette à 8 canaux. </li><li> Un mélange maître contenant l&#39;extrait de Ruc-antigène est la prochaine formulé tel que 1 x 10 7 unités de lumière (LU) est ajouté dans 50 ul de tampon A dans chaque puits. Basse entrées (aussi peu que 1 x 10 6) peut également être utilisé, mais entraîner une baisse de plage dynamique. Faire ce mélange maître et la pipette 50 ul d&#39;Ruc-antigène mélange à chaque puits. </li><li> Incuber la plaque sur un agitateur rotatif pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Durant l&#39;incubation, ajouter 5 pi d&#39;une suspension de 30% de protéines Ultralink A / G perles (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) dans le PBS au fond de chaque puits d&#39;une nouvelle plaque filtrante 96 puits HTS (Millipore, Bedford, MA) . </li><li> Après l&#39;incubation de 1 heure, le transfert des 100 ul Ruc-antigène des anticorps mélange réactionnel plaques à 96 puits HTS filtre contenant la protéine A / G perles en utilisant une micropipette à 8 canaux. </li><li> Incuber la plaque de 96 puits de filtre sur un agitateur rotatif pendant 1 heure supplémentaire à température ambiante. </li><li> Laver ensuite la plaque de filtre sur une rampe à vide. Chaque puits est lavé 8 fois avec 100 pi de tampon A, suivie par deux fois avec 100 ul de PBS. Ceci peut être réalisé manuellement ou avec une station de pipetage robotique. </li><li> Après le dernier lavage, le vide est éteint. Retirer la plaque de filtration et de tamponner sec en utilisant une pile de serviettes en papier ou papier filtre en veillant à éliminer l&#39;humidité sur le haut et le bas de la plaque. </li></ol> PARTIE 5: Mesure de l&#39;analyse des données et de luminescence Set-up: Un LB Berthold microplaques 960 Centro luminomètre est utilisé pour déterminer la luminescence dans chaque puits en utilisant un seul injecteur. Une fois que la machine est en marche, rincez à l&#39;eau distillée de l&#39;injecteur H 2 O en utilisant le cycle de lavage injecteur. Substrat coelentérazine est préparé en utilisant le kit Promega substrat Renilla comme décrit par le fabricant. Typiquement 6 ml de mélange de substrat coelentérazine 1X (soit 60 actions coelentérazine ul + 6 ml de tampon 1X) est préparé pour l&#39;amorçage de la machine et exécutant l&#39;un assiette pleine de 96 puits. Avant d&#39;analyser la plaque, le LB 960 Berthold microplaques Centro luminomètre est amorcée avec 1X substrat coelentérazine. Ouvrir un fichier contenant la configuration du programme pour l&#39;injection du substrat et de la lecture de la plaque. Pour ces mesures, 50 ul de substrat coelentérazine est injecté, la plaque est agitée pendant 2 secondes, suivie par une seconde lecture de la luminescence 5. <ol><li> Bien que le luminomètre plaque a la capacité de lire la plaque entière, une lecture partielle de la plaque peut également être sélectionné (sous le menu lecture). Démarrez le programme, ce qui déclenche la lecture de la plaque. </li><li> Après la course, enlever la plaque filtrante de microtitration rapidement pour éviter tout déversement dans le luminomètre. Exporter les données générées avec le programme MikroWin dans un format Excel pour l&#39;analyse. </li><li> Nous vous recommandons d&#39;évaluer les sérums des deux manches indépendant. Les données sont ensuite moyennées pour générer les valeurs titre LU pour chaque échantillon. Ces valeurs peuvent encore être ajusté pour soustraire les blancs de mémoire tampon. </li><li> Complémentaires d&#39;analyse de données telles que la détermination de la coupure peut être calculée en prenant la moyenne plus de 3 ou 5 écarts-types des valeurs de contrôle. </li></ol>

<ol><li>Burbelo, P. D., Goldman, R., Mattson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunoprecipitation+method+for+quantitatively+measuring+antibody+responses+in+clinical+sera+samples+by+using+mammalian-produced+Renilla+luciferase-antigen+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simplified immunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses in clinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferase-antigen fusion proteins.</a> BMC Biotechnol. 5, 22-22 (2005).</li>
<li>Burbelo, P. D., Leahy, H. P., Iadarola, M. J., Nutman, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Four-Antigen+Mixture+for+Rapid+Assessment+of+Onchocerca+volvulus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A Four-Antigen Mixture for Rapid Assessment of Onchocerca volvulus Infection.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e438-e438 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+luminescent+profiling+of+anti-La+and+other+autoantibodies+in+Sj+gren%E2%80%99s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust luminescent profiling of anti-La and other autoantibodies in Sj gren’s syndrome.</a> Autoimmunity. 139, 241-245 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+antibody+quantification+and+generation+of+whole+proteome+antibody+response+profiles+using+LIPS+%28luciferase+immunoprecipitation+systems%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid antibody quantification and generation of whole proteome antibody response profiles using LIPS (luciferase immunoprecipitation systems).</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 889-895 (2007).</li>
<li>Burbelo, P. D., Groot, S., Dalakas, M. C., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+definition+profiling+of+autoantibodies+to+glutamic+acid+decarboxylases+GAD65%2FGAD67+in+stiff-person+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 366, 1-7 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+luminescence+assay+for+autoantibodies+to+mammalian+cell-prepared+insulinoma-associated+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">A new luminescence assay for autoantibodies to mammalian cell-prepared insulinoma-associated protein 2.</a> Diabetes Care. 31, 1824-1826 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+diagnosis+of+human+herpes+simplex+virus+type+1+and+2+infections+by+luciferase+immunoprecipitation+system+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serological diagnosis of human herpes simplex virus type 1 and 2 infections by luciferase immunoprecipitation system assay.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 366-371 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+quantitative+serological+detection+of+anti-cytomegalovirus+%28CMV%29+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Highly quantitative serological detection of anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies.</a> Virol J. 6, 45-45 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-antigen+mixture+containing+v-cyclin+for+serological+screening+of+human+herpesvirus+8+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Four-antigen mixture containing v-cyclin for serological screening of human herpesvirus 8 infection.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 621-627 (2009).</li>
<li>Ramanathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luciferase+immunoprecipitation+systems+assay+enhances+the+sensitivity+and+specificity+of+diagnosis+of+Strongyloides+stercoralis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A luciferase immunoprecipitation systems assay enhances the sensitivity and specificity of diagnosis of Strongyloides stercoralis infection.</a> J Infect Dis. 198, 444-451 (2008).</li>
</ol>

LIPS nécessite l&#39;optimisation des essais minime et, en raison de sa simplicité, les données de haute qualité peuvent généralement être générés en utilisant les lèvres en moins de deux semaines pour tout antigène donné. Les étapes les plus consommatrices de temps sont le clonage et la génération du vecteur d&#39;expression approprié plasmide contenant la fusion Ruc-antigène. Une fois ces plasmides sont générés, les antigènes simples ou multiples peuvent être rapidement testé avec les lèvres comme décrit ci-dessus. Il est à noter que les lèvres est assez polyvalent tels que les sérums peuvent également être testés dans un format tube ou encore sur une plaque de microtitration avec filtre à l&#39;aide d&#39;un poste de travail robotique Biomek 2 ou un laveur de plaques de filtration sous vide. Ce système hautement évolutif permet l&#39;lèvres parallèles profilage d&#39;un panel d&#39;autoantigènes humaine 3 ou le protéome entier d&#39;un quatre virus. Il est probable que de nombreux profils d&#39;anticorps différents générés par LIPS sera utile pour le diagnostic de 3-9, antigène de la découverte 9, suivant le cours d&#39;un traitement de 10, la surveillance des vaccins et a de larges implications pour des maladies spécifiques et pour la santé publique en général.

<table><tbody><tr><td>KIt midi plasmidique HiSpeed</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire 100 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>1814443</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d'inhibiteurs de protéase Complete, Mini</td><td>Roche Group</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Plaque Polypropylène 96 puits profonds 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td>Plaque à puits profonds avec couvercle et scellée avec du Parafilm</td></tr><tr><td>Plaque microtitration en polypropylène</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td></td></tr><tr><td>Plaque filtrante HTS</td><td>EMD Millipore</td><td>MSBVN1B50</td><td></td></tr><tr><td>Protéine A/G immobilisée Ultralink</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>53133 (10 ml)</td><td></td></tr><tr><td>Système d'essai de luciférase Renilla</td><td>Promega Corp.</td><td>E2820</td><td>Pour 2000 dosages</td></tr><tr><td>Luminomètre microplaque Centro</td><td>Berthold Technologies</td><td>LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

profilage anticorps par immunoprécipitation systèmes luciférase (lips)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies pour complètement comprendre et quantifier les profils anticorps à des auto-antigènes et les agents infectieux peuvent produire de nouvelles connaissances sur les mécanismes de la maladie et peut éclairer de nouveaux marqueurs à substratify maladie avec différentes caractéristiques cliniques et de mieux comprendre la pathogenèse. Nous avons développé une méthode hautement quantitative appelés systèmes immunoprécipitation luciférase (LIPS) pour le profilage des patients réponses anticorps sérum à des autoantigènes et les antigènes des pathogènes associés à l&#39;infection. Contrairement ELISA, les lèvres très sensibles est facilement mis en œuvre pour l&#39;enquête humorale profils de réponse sérologique aux antigènes différents dans un format universel et produit le titre d&#39;anticorps dynamique des distances allant jusqu&#39;à 6 log<sub&gt; 10</sub&gt; Pour certains antigènes. Dans ces études, le profilage quantitatives par des lèvres du patient réponses humorale contre les antigènes des panneaux ou même l&#39;ensemble du protéome de certains agents pathogènes (ie VIH), est généralement plus informative que les tests un seul antigène par ELISA. En outre, LIPS élimine également le temps et les efforts nécessaires pour produire des antigènes hautement purifiés ainsi que les étapes de main-d&#39;œuvre nécessaire à l&#39;optimisation des essais ELISA standard. Ici, nous fournir un protocole détaillé décrivant les aspects techniques de l&#39;exécution des tests pour LIPS facilement profilage réponses des anticorps à des antigènes uniques ou multiples.

Les aspects techniques du spectacle LIPS (Systèmes immunoprécipitation luciférase) sont décrits. L&#39;approche globale consiste à exprimer des gènes codant pour des antigènes chimériques fusionnées à luciférase de Renilla (RUC) dans les cellules de mammifères. Ruc-antigène brut extraits sont ensuite préparés et, sans purification, employées dans des essais d&#39;immunoprécipitation de quantifier les anticorps.

Profilage anticorps par immunoprécipitation Systèmes luciférase (LIPS)

Les technologies permettant de comprendre et de quantifier de manière exhaustive les profils d'anticorps dirigés contre des autoantigènes et des agents infectieux pourraient apporter de nouvelles perspectives sur la maladie...

Ce vidéo montre les étapes nécessaires pour réaliser le test. Les antigènes sont exprimés dans des cellules CO un comme des fusions de luciférase recombinante ran vanilla ou d'antigène rook. Des extraits bruts sont obtenus et utilisés sans purification.Le test ELISA débute par l'incubation d'extraits bruts d'antigènes de rook avec le SRA du patient. Dans des puits de microplaque, le mélange anticorps-antigène est ensuite transféré vers une plaque filtrante de 96 puits contenant des billes de protéine A G afin de capturer les molécules d'IgG après lavage de la plaque filtrante contenant les billes de protéine AG. L'antigène de rook lié aux anticorps est mesuré par l'ajout d'un substrat chimiluminescent, et les unités de lumière sont quantifiées à l'aide d'un luminomètre.Bonjour, je suis le Dr. Catherine Chang du Laboratoire de biologie sensorielle de l'Institut national de recherche dentaire et crâniofaciale. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure des systèmes d'immunoprécipitation de la luciférase utilisant les lips. Nous utilisons les lips dans notre laboratoire pour mesurer les titres d'anticorps afin de diagnostiquer une maladie ou une infection.Les profils d'anticorps permettent de stratifier les états pathologiques, de surveiller la vaccination et d'autres applications impliquées dans la génération de profils d'anticorps. Commençons donc. Avant de commencer la transfection, les plasmides pour les fusions de luciférase Vanille sont préparés à l'avance comme décrit dans l'article de BMC Biotechnology.L'ADN plasmatique BYO et al. 2005 est préparé à l'aide d'un kit MIDI prep avec un rendement de un à trois milligrammes et est conservé sous forme de solution mère à un milligramme par millilitre à moins 20 degrés Celsius. Les cellules Cost one utilisées lors de la transfection sont cultivées en DMEM contenant 10 % de SFC selon des protocoles standards de culture tissulaire. Un jour avant la transfection, les cellules Cost one sont divisées dans de nouvelles boîtes de 100 par 20 millimètres à environ deux fois 10 puissance six cellules par plaque et incubées à 37 degrés Celsius le jour suivant.Les cellules doivent être confluentes à 80 à 95 %. Laisser l'ADN plasmidique et le réactif de transfection FuGene 6, stockés à quatre degrés Celsius, atteindre la température ambiante pendant que l'ADN plasmidique se réchauffe. Étiqueter des tubes microfuge en polypropylène de 1,5 millilitre pour chaque ADN plasmidique à transfecter, en prenant soin de ne pas toucher les parois latérales des tubes. Ajouter six microlitres de FuGene 6 dans les tubes, qui doivent déjà contenir 94 microlitres de milieu OPTI-MEM, puis incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter un à deux microgrammes de plasmide contenant la construction de fusion Ran-Luciférase, mélanger en retournant plusieurs fois le tube, centrifuger brièvement, puis incuber à température ambiante pendant 15 minutes.Transférez l'ensemble de la solution optimale d'ADN de fusion vers les cellules en la déposant uniformément dans le milieu des cellules COS. Incubez les cellules COS transfectées pendant deux jours, puis procédez à la récolte. Pour commencer la récolte de la protéine de fusion, retirez le milieu et lavez les cellules avec six millilitres de PBS.Évacuez tout résidu de PBS de la boîte de culture cellulaire, ajoutez 1,4 millilitre de tampon de lyse froid et récoltez les cellules à l’aide d’un grattoir à cellules. Transférez rapidement la moitié du lysat dans chacun de deux tubes microcentrifugeurs de 1,5 millilitre placés sur de la glace. Un Branson SOLIDIFIER one 50 est utilisé pour rompre les cellules. Placez le tube microcentrifugeur contenant le lysat cellulaire sur de la glace et appliquez une impulsion de cinq secondes.Cinq secondes et cinq secondes. Avec des réglages de sonication de deux, deux et quatre respectivement. Centrifuger le lysat cellulaire à 12 500 tr/min pendant deux minutes et quatre.Effectue une centrifugation à quatre degrés Celsius. Entre chaque centrifugation, retourner doucement les tubes pour éliminer les débris faiblement adhérents à la paroi du tube. Ensuite, transférer soigneusement le surnageant sans perturber le culot, des deux tubes vers un nouveau tube microcentrifugeé placé sur de la glace.Pour mesurer les unités de lumière (lu) du lysat, diluez un microlitre de lysat avec huit microlitres de PBS dans un nouveau tube microfuge, ajoutez directement 100 microlitres de substrat de lucéérine à une concentration donnée au mélange dilué, puis mesurez immédiatement la luminescence dans le tube à l’aide d’un luminomètre à tubes avec une lecture de cinq secondes à partir de cette étape. N’oubliez pas d’appliquer les précautions de sécurité lors de la manipulation d’échantillons humains et animaux. Pour préparer une plaque-mère de sérum, source d’anticorps de patients pour le profilage d’antigènes, ajoutez d’abord 450 microlitres de tampon A dans chaque puits d’une plaque polypropylène de 96 puits profonds.À cette étape, un colorant, le rouge de phénol, peut également être ajouté au tampon A afin de servir de traceur pour le suivi des éditions ultérieures des échantillons SRA et des autres étapes du test sur les lèvres. Ensuite, ajouter 50 microlitres de sérum de chaque échantillon dans chaque puits contenant 450 microlitres de tampon. À noter, il s'agit d'une dilution au 1/10 de l'SRA dans le tampon.Un SRA est généralement non ajouté aux deux derniers puits de la plaque maîtresse, car ceux-ci sont réservés aux témoins tampon avant le stockage de la plaque maîtresse pour une utilisation ultérieure. Elle est agitée vigoureusement pendant une à deux heures sur une plateforme rotative. À 650 tr/min, le sérum reste stable pendant au moins un mois, voire plus, à quatre degrés Celsius, et la plaque peut être scellée avec du parafilm afin d'éviter l'évaporation si elle doit être stockée avant d'effectuer le test des lèvres. Organisez une feuille de calcul contenant les numéros d'identification des échantillons et les puits correspondants sur la plaque maîtresse. Des plaques microtitration polypropylène 96 puits peu profonds sont utilisées comme plaques de travail pour tester les sérums.Au cours de la première étape, ajoutez 40 microlitres de tampon A dans chaque puits de la plaque 96 puits à l’aide d’une micropipette à huit canaux. Ensuite, prélevez 10 microlitres de sérum dilué à partir de la plaque maîtresse et ajoutez-les directement dans chaque puits de la plaque de travail à l’aide d’une micropipette à huit canaux. Après utilisation, scellez la plaque maîtresse avec du paraform, remettez le couvercle sur la plaque maîtresse, puis recouvrez-la de film plastique et stockez-la à quatre degrés Celsius.Un mélange maître contenant l'extrait d'antigène de tour est ensuite formulé de manière à ce qu'une fois dix puissance sept UL soit ajouté dans 50 microlitres de tampon A dans chaque puits. Préparez ce mélange maître et pipetez 50 microlitres du mélange d'antigène de tour dans chaque puits. Recouvrez la plaque avec un couvercle en polystyrène et incubez-la sur un agitateur rotatif à 100 tr/min pendant une heure.À température ambiante pendant l'incubation, prélever un aliquot de 1,5 millilitre d'une suspension à 30 % de billes de protéine Ag ultra liée dans du PBS à partir du réfrigérateur. Ajouter cinq microlitres au fond de chaque puits d'une nouvelle plaque filtrante HTS de 96 puits. Après l'incubation de la plaque d'une heure, transférer les 100 microlitres du mélange réactionnel antigène anticorps vers les plaques filtrantes HTS de 96 puits contenant les billes de protéine Ag à l'aide d'une micropipette à canal A. Incuber la plaque filtrante de 96 puits sur un agitateur rotatif pendant une heure supplémentaire à 100 tr/min à température ambiante.Ensuite, lavez la plaque filtrante à l'aide d'une station de travail automatisée Biome FX avec un collecteur sous vide. Chaque puits est lavé huit fois avec 100 microlitres de tampon A, puis deux fois avec 100 microlitres de PBS. Après le dernier lavage, éteignez le vide. Retirez la plaque filtrante et séchez-la en l'apposant sur une pile de serviettes en papier ou du papier filtre, en veillant à éliminer l'humidité présente sur la face supérieure et inférieure de la plaque. Un luminomètre microplaque Burt hold LB nine 60 Centro est utilisé pour déterminer la luminescence dans chaque puits de la plaque.Mettez la machine en marche et rincez l'injecteur avec de l'eau distillée. Pour amorcer et faire fonctionner l'appareil, utilisez le cycle de lavage de l'injecteur avec le substrat INE, préparé à l'aide du kit de substrat ranil de Promega selon les instructions du fabricant ; généralement, six millilitres d'un mélange de substrat d'excellente qualité sont nécessaires pour une plaque. Chargez le mélange de substrat dans le luminomètre, puis ouvrez un fichier de programme contenant les paramètres pour l'injection du substrat et la lecture de la plaque.Pour ces mesures, 50 microlitres de substrat soine sont injectés. La plaque est agitée pendant deux secondes, suivie d'une lecture de la luminescence pendant cinq secondes.Démarrer le programme qui initie la lecture de la plaque après l'analyse, puis retirer rapidement la plaque filtrante microtitration pour éviter tout déversement dans le luminomètre. Les données sont automatiquement exportées depuis le programme microwind vers un format Excel pour une analyse ultérieure. Faire la moyenne des résultats de deux analyses différentes réalisées avec les mêmes sérums.Afin de générer des valeurs de titres en lu pour chaque échantillon, il est recommandé d'utiliser des échantillons en double qui doivent présenter une forte concordance entre les valeurs de titres obtenues lors des deux essais. Pour la représentation graphique des données, les valeurs de titres en lu peuvent être ajustées en soustrayant les blancs au tampon, comme indiqué ici.La sensibilité et la spécificité du test peuvent également être calculées en utilisant des seuils dérivés de la moyenne plus trois ou cinq écarts-types des échantillons témoins. Nous venons de vous montrer comment mesurer les titres d'anticorps à l'aide de LIPS. La méthode LIPS nécessite peu d'optimisation du test et, en raison de sa simplicité, peut être utilisée pour produire des données de haute qualité en moins de deux semaines pour tout antigène donné. Lorsque vous travaillez avec du sérum humain, il est important de prendre les précautions de sécurité appropriées.Et gardez à l'esprit que lifts est hautement évolutif et peut donc être utilisé pour mesurer un petit nombre d'échantillons à l'aide d'un lavage manuel ou une plaque entière à l'aide d'une station de travail robotisée. Compte tenu de cette polyvalence, nous pensons que lips sera très utile dans l'analyse séro-antigénique et aura des implications importantes dans l'analyse des maladies et la santé publique en général. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences de profilage des anticorps.

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Un test ELISA peut être facilement converti en un dosage Luminex xMAP et, grâce aux bienfaits de multiplexage, plusieurs anticorps peuvent être projetés simultanément pour identifier une paire d'anticorps optimal, ce qui entraîne une sensibilité accrue et une gamme dynamique, tout en réduisant les coûts du test.

Conversion d&#39;un test ELISA de capture à un test Luminex xMAP utilisant une méthode de dépistage d&#39;anticorps Multiplex

La vidéo montre le dosage de la luciférase utilisé pour quantifier les protéines marquées à la luciférase. Le test utilise une enzyme luciférase modifiée composée d’un gros fragment qui se lie au petit fragment, qui est conjugué à une protéine d’intérêt. Les sous-unités liées forment une enzyme active qui, en présence du substrat, libère un signal luminescent. Ce signal est ensuite quantifié à l’aide d’un luminomètre.

Le test de la luciférase : un test à haut débit pour mesurer les signaux luminescents à l’aide de biorapporteurs basés sur le système de nanoluciférase

Cette vidéo montre l’utilisation du test ELISpot pour évaluer la fonction des lymphocytes B sécrétant des anticorps, les ASC. Les anticorps sécrétés par les ASC interagissent avec les fragments d’anticorps polyclonaux liés à la membrane, qui sont détectés par les anticorps IgG ou IgM conjugués aux enzymes. La tache colorée produite dans chaque puits indique la présence de l'isotype spécifique de l'anticorps, qui est en corrélation avec l'activité sécrétoire des lymphocytes B.

Évaluation fonctionnelle des lymphocytes B sécrétant des anticorps à l’aide du dosage ELISpot

Les interactions protéine-protéine peuvent se produire à la fois dans le noyau et le cytoplasme d’une cellule. Pour étudier ces interactions, la co-immunoprécipitation traditionnelle et le test moderne de ligature de proximité sont appliqués. Dans cette étude, nous comparons ces deux méthodes pour visualiser la distribution des interactions NF90-RBM3 dans le noyau et le cytoplasme.

Visualisation des interaction protéine-protéine en nucléaire et cytoplasmique Fractions par Co-immunoprécipitation et<em&gt; In Situ</em&gt; Proximité Ligation Assay

Un test immunologique capillaire-basé utilisant une plate-forme commerciale pour mesurer les protéines cibles des préparations de protéines totales est démontré. En outre, les paramètres de dosage des temps d’exposition et la concentration de protéines et l’affaiblissement de l’anticorps sont optimisés pour un système de modèle de culture cellulaire.

Procédure et des stratégies d’optimisation clés pour un procédé de dosage immunologique axée sur électrophorèse capillaire automatisée

Enquêtes multiples, des modifications post-traductionnelles endogènes pour une protéine cible peuvent être extrêmement difficiles. Utilisent les techniques décrites ici un système tampon et de filtre de lyse optimisé développé avec PTM-ciblage spécifique, des matrices d’affinité afin de détecter les modifications de la phosphorylation acétylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 et de la tyrosine pour une cible protéine à l’aide d’un système unique et simplifié.

Utilisant un système d’enrichissement immunoprécipitation complète afin d’identifier un profil endogène Modification post-traductionnelle des protéines cibles

Ici, nous montrons comment utiliser un test de ligature de proximité (PLA) pour visualiser MST1/MST2 hétérodimérisation dans les cellules fixes à haute sensibilité.

Détection de hétérodimérisation des isoformes de protéines à l’aide d’un test in Situ proximité ligature

Nous présentons ici un biocapteur axée sur la luciférase afin de quantifier l’activité kinasique de suppresseur de tumeur grande (LAT)-une centrale kinase dans l’hippopotame voie de signalisation. Ce biocapteur a diverses applications en recherche fondamentale et translationnelle vise à déterminer l’Hippo voie régulateurs in vitro et in vivo.

Hippo, activité de voie à l’aide d’un biocapteur de suppresseur (LATS) axée sur la luciférase grande tumeur de signalisation de surveillance

La méthode BSelex pour identifier et récupérer les anticorps individuels spécifiques à l'antigène des cellules mononucléaires périphériques humaines combine la cytométrie du flux avec pcR à cellule unique et le clonage.

Méthode de dépistage à cellule unique pour la sélection et la récupération d'anticorps ayant les spécificités souhaitées des populations enrichies de cellules de la mémoire humaine B

Le protocole décrit la procédure de production du complexe protéique du domaine de liaison au récepteur HiBiT et son application pour la détection rapide et sensible des anticorps anti-SARS-CoV-2.

Détection de l’anticorps du domaine de liaison au récepteur du SARS-CoV-2 à l’aide d’un biorapporteur basé sur HiBiT

Apprenez le profilage anticorps par immunoprécipitation luciférase (LIPS) pour quantifier les anticorps dans des extraits bruts de cellules COS-1. Cette méthode efficace facilite le diagnostic et le suivi des maladies.

Profilage anticorps par immunoprécipitation Systèmes luciférase (LIPS)

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