Capturez extension d'amorce: Retrieval séquence ciblée à partir de sources d'ADN fortement dégradées

Ce vidéo explique la technique de capture par extension d'amorce, ou PECA, qui permet la récupération ciblée de séquences d'ADN à partir de sources d'ADN hautement fragmentées et présentes en très faible nombre de copies. Nous avons utilisé cette technique pour séquencer des génomes mitochondriaux complets à partir d'os de néandertaliens âgés de plus de 40 000 ans, et la méthode peut être employée pour la capture de n'importe quelles petites régions cibles ou de polymorphismes nucléotidiques simples, et ce chez de nombreux individus. Les principales étapes de cette procédure sont l'amplification par PCR d'une bibliothèque d'ADN primaire, la quantification de la bibliothèque amplifiée par PCR quantitative, l'extension primaire ciblée sur la bibliothèque amplifiée, la capture sur billes des produits d'extension primaire afin d'éliminer les fragments non ciblés, puis l'élution et le séquençage des cibles capturées et lavées.

Bonjour, je suis Adrian Briggs du laboratoire de Shanti Payable, au Département de génétique de l'Institut Max Planck d'anthropologie évolutionniste à Leipzig. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'isoler des séquences d'ADN spécifiques d'intérêt à partir d'une source d'ADN complexe et fortement dégradée, comme des ossements anciens. Nous avons utilisé cette procédure pour étudier la diversité génétique mitochondriale de Homo neanderthalensis, ou homme de Néandertal.

Commençons. L'ADN utilisé dans notre expérience provient d'os de Néandertaliens âgés de 40 000 à 70 000 ans, découverts sur plusieurs sites répartis dans l'aire géographique des Néandertaliens. Un os est d'abord exposé toute une nuit à la lumière UV afin de décontaminer la surface de tout ADN étranger.

Un foret fin est utilisé pour produire entre 100 et 500 milligrammes de poudre osseuse. L'ADN est extrait de la poudre osseuse à l'aide d'une procédure décrite dans l'article de 2007 intitulé « Comparison and Optimization of Ancient DNA Extraction » par Nadine Rockland et Michael Hof.Writer. L'extrait d'ADN est ensuite converti en une bibliothèque de séquençage par l'ajout de sites amorce universels aux extrémités de tous les fragments d'ADN, car une bibliothèque 454 générée à partir d'un os de Néandertalien ne contient que de très faibles quantités d'ADN, parfois seulement quelques picogrammes. Cette bibliothèque d'ADN primaire est d'abord amplifiée par PCR en utilisant des amorces de PCR en émulsion correspondant aux amorces universelles de la bibliothèque.

Pour préparer le mélange de PCR pour l'amplification de la banque, combinez les réactifs suivants dans un tube de PCR : utilisez 10 microlitres de tampon PCR 10 X GAMP, deux microlitres de chlorure de magnésium, deux microlitres de BSA, un microlitre de mélange de dNTP, trois microlitres chacun des amorces directe et inverse MPCR 4,54 µM, un microlitre de polymérase ADN amply gold, 25 microlitres de matrice de banque. Enfin, ajoutez 45 microlitres d'eau de qualité PCR pour obtenir un volume total de 100 microlitres. La polymérase ADN amply Tech gold est stable à température ambiante, il n'est donc pas nécessaire de travailler sur de la glace.

Après avoir préparé la réaction de PCR, placer le tube de PCR dans un thermocycleur en commençant par une étape de dénaturation à 95 degrés Celsius pendant 12 minutes, suivie de 14 cycles de 95 degrés Celsius pendant 30 secondes, 60 degrés Celsius pendant une minute et 72 degrés Celsius pendant une minute. À la fin de ces 14 cycles, effectuer une étape finale de 5 minutes à 72 degrés Celsius, après quoi le tube de PCR peut être maintenu indéfiniment à 10 degrés Celsius jusqu'à son utilisation, une fois l'amplification par PCR terminée, puis purifier le produit de PCR à l'aide d'une colonne spin Kyogen MinLu selon les instructions du fabricant, et éluer l'ADN de la colonne avec 50 microlitres de tampon EB fourni avec le kit MinLu avant l'extension primaire et la capture du produit.

Une PCR quantitative doit être réalisée sur des aliquotes des bibliothèques non amplifiées et amplifiées afin de quantifier et de vérifier la qualité du produit de la bibliothèque amplifiée. La bibliothèque amplifiée sur 14 cycles doit contenir plusieurs milliers de fois plus d'ADN que la bibliothèque primaire. Dans le cas contraire, les conditions d'amplification doivent être vérifiées et l'étape répétée.

Les amorces de capture d'extension primaire, qui seront utilisées pour capturer les séquences d'intérêt à partir de la bibliothèque amplifiée, doivent être conçues comme des amorces de PCR classiques afin de s'hybrider à une région cible souhaitée avec une température de fusion idéale de 60 degrés Celsius au niveau de l'extrémité 5' de chacune de ces séquences cibles, en tenant compte de cette séquence de queue de 12 bases, et doivent inclure un résidu de biotine à l'extrémité 5'. Jusqu'à 150 amorces PEC peuvent être utilisées ensemble dans un mélange multiplex préparé à partir de stocks à 200 micromolaire. Pour la réaction d'extension primaire, préparez un mélange de PCR dans un tube PCR approprié en ajoutant cinq microlitres de tampon PCR GAMP 10 X, deux microlitres de chlorure de magnésium, un microlitre de BSA, 0,5 microlitre de dNTP, cinq microlitres du mélange d'amorces de capture d'extension primaire, 0,5 microlitre de polymérase tack gold ADN, deux microlitres d'ADN de bibliothèque amplifié en 14 cycles, et enfin 31 microlitres d'eau de qualité PCR, pour un volume total de 50 microlitres.

Si le modèle de bibliothèque amplifié contient plus de 1 × 10¹² copies par microlitre, le modèle doit d'abord être dilué avec du tampon EB afin que pas plus de 2 × 10¹² copies soient ajoutées au mélange de réaction. Après avoir préparé le tube PCR, placez-le dans le thermocycleur et réglez-le pour un cycle de réaction unique. Commencez par une dénaturation de 12 minutes à 95 °C, suivie d'une minute à 60 °C, puis de cinq minutes à 72 °C pour l'extension primaire.

Et lorsque le cycle unique est terminé, maintenir le produit de PCR à 72 degrés Celsius jusqu'à l'étape suivante. Afin d'éviter l'appariement non spécifique des amorces et de capturer directement PEPPE, ajouter 150 microlitres de tampon PBI ou PB du kit de purification Kyogen Ute dans les tubes de réaction PCR, pendant que le mélange réactionnel reste dans le thermocycleur maintenu à 72 degrés Celsius. Cette manipulation inactive la polymérase, tandis que la température est trop élevée pour permettre une extension non spécifique des amorces cibles. Fermer les tubes, les agiter brièvement au vortex, puis centrifuger rapidement pour ramener le liquide au fond des tubes à l'aide d'une centrifugeuse de banc.

N'utilisez lors de cette étape que le tampon PBI ou PB, car d'autres tampons de liaison comme le PM Buffer de Qiagen peuvent interférer avec le processus de capture en aval. Ensuite, retirez le mélange du tube PCR et transférez-le vers une colonne de centrifugation Rogen MinLu pour purification selon les instructions du fabricant, comme précédemment, puis éluez l'ADN de la colonne avec 30 microlitres de tampon EB fourni avec un kit MinLu. Afin d'éliminer tous les fragments qui ne se sont pas hybridés aux amorces PEC, une étape de capture basée sur des billes est réalisée.

Tout d'abord, resuspendre une solution mère de M 270 strip divisé en billes par vortexage et prélever une quantité de billes équivalant à 25 microlitres par échantillon. Laver les billes deux fois avec 500 microlitres de tampon BW deux fois, puis resuspendre dans un volume égal de tampon BW deux fois par rapport au volume initial de billes prélevé. Préparer 25 microlitres de cette suspension.

Pour chaque échantillon, ajouter 25 microlitres de l'ADN purifié élué à 25 microlitres de la suspension de billes, en conservant les cinq microlitres restants pour une quantification ultérieure. Mélanger l'ADN et la suspension de billes en aspirant et en expulsant à l'aide d'une pipette, puis en agitant avec la pointe Perpet, et faire tourner lentement pendant 15 minutes à température ambiante sur un agitateur rotatif de laboratoire. Après le mélange, transférer le contenu dans un nouveau tube PCR de 1,5 millilitre.

Au cours de l'étape d'incubation de rotation précédente, un ADN non ciblé peut s'être fixé sur la paroi du tube. Ainsi, le transfert de la suspension de billes vers un nouveau tube évite que cet ADN non ciblé ne soit libéré dans les produits finaux. Pendant l'étape d'élution thermique, utilisez le collecteur de particules magnétiques pour regrouper les billes ; après 10 à 20 secondes, toutes les billes auront migré vers la paroi, laissant un surnageant clair qui doit être éliminé. Pour laver les billes, ajoutez 500 microlitres de tampon BW à une fois dans le tube et vortexez environ trois secondes à vitesse lente.

Une fois avec le tube en position verticale et une fois avec le tube inversé, aucun des billes ne doit rester collé à la paroi du tube. À l’aide d’une centrifugeuse de table, centrifuger la suspension pendant une à trois secondes, juste assez longtemps pour extraire tout le liquide des parois du tube. Replacer le tube dans le MPC et attendre de 10 à 20 secondes jusqu’à ce que toutes les billes soient regroupées sur le côté du tube.

Ensuite, retirez le surnageant SUP. Le premier lavage est maintenant terminé. Répétez cette procédure encore quatre fois après le dernier lavage BW et le retrait du surnageant.

Ajouter 500 microlitres de tampon de lavage chaud une fois. Mélanger la suspension par vortexage bref et centrifugation comme précédemment, puis agiter le tube pendant deux minutes à 65 degrés Celsius sur un agitateur bloc thermique à 1000 tr/min, après une brève centrifugation permettant d'éliminer les traces de surnageant dans la minute suivant le retrait du bloc thermique. Cette étape permet d'éliminer les fragments pouvant se lier aux amorces PEC, mais qui n'ont pas été allongés lors de l'étape d'extension d'amorce. Resuspendre le culot dans 30 microlitres de tampon EB et transférer le mélange dans un nouveau tube PCR de 1,5 millilitre.

Incuber le tube dans le thermocycleur à 95 degrés Celsius pendant trois minutes. Rassembler les billes dans le collecteur de particules magnétiques. Laisser 10 à 20 secondes pour que le surnageant devienne complètement limpide, puis prélever le surnageant S et le transférer dans un nouveau tube étiqueté.

Veillez à ne pas transférer les billes. Conservez le surnageant, qui contient le produit capturé de fragments d'ADN. Les billes peuvent être éliminées à ce stade.

Pour amplifier le produit capturé, préparez un mélange de PCR pour un volume total de 100 microlitres comme indiqué dans la partie deux, et effectuez les mêmes conditions de cyclage en PCR. Une fois de plus, après l'amplification par PCR du produit capturé, procédez à sa purification à l’aide d’une colonne de centrifugation Qiagen Ute comme précédemment décrit dans la section deux, puis éluésez l’ADN de la colonne avec 50 microlitres de tampon Eeb. Le produit est désormais prêt pour un séquençage à haut débit. Nous avons conçu 574 amorces PEC afin de recouvrir tout le génome mitochondrial néandertalien.

Nous les avons répartis en quatre mélanges multiplexés et deux séries consécutives de capture par extension primaire sur des bibliothèques provenant de cinq fossiles de Néandertaliens issus de quatre sites répartis en Eurasie, dont l'âge se situe entre 40 000 et 70 000 ans, générant entre 170 000 et 500 000 séquences par individu, puis nous avons aligné les résultats sur une séquence de référence mitochondriale. Nous avons constaté que la procédure de CEP avait fortement enrichi l'ADN mitochondrial, permettant une couverture complète de l'ADN mitochondrial pour chaque individu, avec une profondeur moyenne comprise entre 18 et 56,3 fois. Grâce à ces résultats, nous avons pu produire une séquence de génome mitochondrial complet de haute qualité pour chaque individu.

Nous avons ensuite effectué une comparaison phylogénétique de ces séquences avec un échantillon mondial d'humains actuels et nos parents vivants les plus proches, le chimpanzé et le bonobo. Ceci a confirmé les découvertes antérieures selon lesquelles l'ADN mitochondrial néandertalien est étroitement lié, mais clairement distinct de celui des humains modernes. En outre, la comparaison entre les séquences néandertaliennes elles-mêmes a révélé une diversité génétique extrêmement faible chez les Néandertaliens, inférieure à celle observée actuellement parmi les humains à l'échelle mondiale, et similaire à celle des Européens actuels.

Ces preuves, combinées à une analyse de l'évolution des protéines dans les séquences néandertaliennes, suggèrent que les Néandertaliens avaient une taille de population faible à long terme, ce qui est cohérent avec les preuves archéologiques indiquant que la densité de population néandertalienne n’a jamais atteint les niveaux observés chez les humains modernes. Nous venons de vous montrer comment réaliser une capture par extension chez les primates afin d'amplifier et de capturer des séquences cibles en vue d'un séquençage à haut débit. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de respecter scrupuleusement toutes les consignes de température sur le thermocycleur, tout en gardant à l'esprit que les amorces peuvent présenter des températures de fusion différentes ; vous devrez donc peut-être ajuster la température de fusion en fonction de vos amorces spécifiques, et faire preuve de vigilance lors de toutes les étapes de lavage afin d'éliminer autant que possible le liquide résiduel.

Merci donc d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.