Encapsulation Cellulaire dans les hydrogels 3D pour l'ingénierie tissulaire

Le processus d’encapsulation des cellules commence par la préparation et la stérilisation des moules d’hydrogel et d’autres matériaux, suivie de l’isolement des cellules en populations individuelles, dans des tubes pour chaque ensemble de gel. La mise est ensuite réalisée en présence de cellules, suivie d’une période d’incubation in vitro ou in vivo. L’analyse en aval du comportement cellulaire peut inclure des tests de viabilité, de morphologie, de prolifération et de différenciation.

Bonjour Amidio Kahan du laboratoire du Dr Jason Burdick au Département de bio-ingénierie de l’Université de Pennsylvanie. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’encapsulation cellulaire dans des hydrogels 3D pour l’ingénierie tissulaire. Nous utilisons cette procédure pour étudier les effets de la composition et de la structure de l’hydrogel sur le comportement des cellules encapsulées.

Alors commençons. Pour commencer cette procédure, préparez une solution à 0,5 % en poids du photo-initiateur de polymérisation à l’air 2 9 5 9 ou I 2 9 5 9 dans du PBS. Mélangez et incubez pendant deux à trois jours dans l’obscurité à 37 degrés Celsius.

Lorsque vous êtes prêt, utilisez un filtre à seringue pour stériliser la solution et conservez-la à température ambiante. Ensuite, utilisez un tableur tel que Microsoft Excel pour calculer la quantité de polymère et de réticulant nécessaire démontrée. Voici de l’acide hyaluronique fonctionnalisé avec des groupes réactifs acrylates.

Calculez également la quantité du peptide de penant contenant le domaine adhésif fonctionnel avec l’acide aminé cystine, l’arginine, la glycine et l’aspartate. La cystine sert à s’attacher au polymère. Maintenant que les quantités requises de réticulant et de penter en polymère ont été déterminées, pesez-les et placez-les chacun dans un tube einor.

Ajustez la feuille de calcul en conséquence. Pour la masse réelle de polymère obtenue, procédez à la préparation des moules en gel. Utilisez une lame de rasoir pour couper les pointes des stériles emballés individuellement.

Seringues jetables d’un millilitre. Assurez-vous qu’une coupe plate est faite pour les moules à utiliser pour le motif photo sur les gels. Enfin, stérilisez les moules de seringue, les tubes EOR avec leurs capuchons ouverts et tout autre matériel nécessaire en les plaçant sous une source de lumière germicide intégrée à l’enceinte de sécurité biologique pendant 30 minutes.

Une fois la stérilisation terminée, procéder à la préparation des cellules après la stérilisation de l’équipement expérimental. Travaillez dans la hotte et ajoutez du thé stérile au polymère utilisé dans la réticulation de type mique et du PBS stérile au polymère utilisé pour la réticulation des radicaux libres. AJOUTEZ un tampon assorti aux tubes de fraction suspendus et au vortex.

Pour dissoudre, la fraction pendante se lie à l’acide hyaluronique alkylé via un thiol d’un groupe INE sur le peptide pour attacher la fraction pendante au polymère, ajoutez-la à la solution polymère et scellez-la avec param. Brièvement, vortex et incuber à 37 degrés Celsius avec mélange. Pendant la préparation des cellules, pendant que la fraction pendante se fixe, préparez les cellules à encapsuler des tryis, des cellules souches mésenchymateuses humaines ou HMC en les lavant avec du PBS.

Ensuite, incubez avec de la trypsine pendant une minute à température ambiante, retirez la trypsine et incubez cinq minutes de plus à 37 degrés. Ajoutez ensuite un milieu de croissance HMSC pour neutraliser la trypsine et libérer les cellules de la surface de la plaque. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Séparez les cellules comptées en portions contenant le nombre approprié pour chaque ensemble de gels. Pour un ensemble de trois gels de 50 microlitres à une densité de 10 millions de cellules par millilitre, séparez 1,5 million de cellules dans un tube conique individuel. Ne préparez pas plus de quatre gels dans une série individuelle en raison du moment de la préparation.

Ensuite, centrifugez les cellules à 500 RCF pendant six minutes. À température ambiante, pendant que les cellules tournent, préparez le mélange de polymérisation pour la réticulation de l’édition chimique. Ajoutez un tampon à l’agent de réticulation pour obtenir la concentration appropriée.

Pour la réticulation radicalaire initiée par la lumière, ajouter la solution I 2 9 5 9 précédemment préparée à la solution polymère. À 10 % du volume total de l’ensemble de gel pour une concentration finale de l’initiateur de 0,05 % en poids. Les cellules et le mélange de polymérisation sont maintenant prêts pour l’encapsulation dans l’hydrogel.

Commencez par aspirer le snat des cellules de centrifugation. Attendez que le liquide se dépose après l’aspiration initiale et aspirez à nouveau pour éliminer autant de fluide que possible sans perturber la granule cellulaire Resus. Suspendez la pastille cellulaire avec la solution polymère pour éviter les bulles d’air.

Pipetez lentement la solution de haut en bas environ 10 fois, ce qui devrait suffire à répartir uniformément les cellules. Pour la réaction d’addition de type mical, utiliser une pointe de pipette à large orifice pour ajouter le volume approprié de solution de réticulation à la cellule polymère. Réglez la pipette sur le volume de gel individuel souhaité.

Pipetez la solution de haut en bas pour homogénéiser et Eloqua dans les moules de l’embout de la seringue. Effectuez l’étape rapidement pour assurer une répartition uniforme des cellules et laissez incuber 10 à 30 minutes dans le capot de culture pour la réticulation. Pour la lumière, la réticulation des radicaux libres a été initiée.

Aliquote le volume approprié dans les moules de l’embout de la seringue. Exposez les seringues à la lumière UV pour une réticulation radicale une exposition de 10 minutes à 365 nanomètres. Une lumière UV de quatre milliwatts par centimètre carré est courante pour les polymères fonctionnalisés ACRL.

Effectuez l’étape rapidement pour minimiser la sédimentation des cellules avant l’exposition à la lumière UV. Après la réticulation, plongez les gels dans les puits d’une plaque de culture tissulaire contenant des milieux pour l’incubation et l’analyse. La réticulation de l’hydrogel peut également être effectuée de manière séquentielle.

Tout d’abord, ajoutez le colorant fonctionnalisé métholated rumine à une concentration finale de 20 nanomolaires dans le gel. Le colorant aide à visualiser le motif puisqu’il s’incorpore préférentiellement dans des régions radicalement réticulées du gel. Commençons ensuite par la réaction de polymérisation de type micro qui donne une fraction des réticulations théoriques pour ce qui suit.

Pour la réticulation radicalaire, il faudra utiliser un masque conçu dans un programme tel qu’Adobe Photoshop ou Illustrator et imprimé directement sur les masques de transparence. Les dimensions du masque doivent correspondre au haut rond de la seringue. À l’aide d’une pince à épiler stérilisée, appliquez un masque stérile directement sur la surface du gel et exposé à la lumière pour réticuler le gel.

On voit ci-dessous les HMC dans des hydrogels à base d’AH une heure après l’encapsulation. Parce que les hydrogels synthétisés sont généralement transparents, la morphologie des cellules peut être visualisée à l’aide de la microscopie optique. La viabilité des mêmes cellules a été visualisée 24 heures après l’encapsulation à l’aide d’un kit de coloration fluorescente des morts vivants.

Nous avons utilisé du calcium M pour détecter les cellules vivantes et de l’homodimère d’atérium pour les cellules mortes et avons observé une viabilité supérieure à 95 %. Nous avons également utilisé le test du bleu d’alamar pour déterminer le niveau de prolifération cellulaire mesuré par la façon dont les cellules métabolisent le réactif de test, ce qui entraîne un changement de couleur. La coloration cellulaire a été réalisée sur des HMC H sept jours après l’encapsulation dans un hydrogel à base d’AH dégradable et adhésif et en utilisant des procédures de fixation standard et de perméabilité.

L’acton cellulaire est visible à l’aide de phin marqué à la fluorescéine et de noyaux retenus par dpi. L’immunomarquage contre le cullin est utilisé pour la visualisation des adhérences focales dans la matrice d’hydrogel. La coloration histologique est réalisée après déshydratation, enrobage de paraffine et sectionnement des hydrogels à l’aide de protocoles standard d’hydrogels d’AH encapsulés dans du HMSC radicalement polymérisés.

Après une semaine de culture, ils ont été colorés avec de l’hémat-toïne marquant les noyaux et de l’ASIN marquant le tissu conjonctif A et des colorants bleus pour les glycosaminoglycanes. En temps réel. La PCR est utilisée pour quantifier la différenciation des cellules souches encapsulées Après soustraction du bruit de fond, le niveau d’expression d’un gène d’intérêt est déterminé par le numéro de cycle où le seuil de fluorescence a été atteint par rapport à un signal de référence passif, qui est un gène de ménage constitutivement actif. Nous venons donc de vous montrer comment encapsuler des cellules dans des hydrogels 3D et étudier le comportement des cellules dans des gels.

Lors de l’utilisation de ces procédures, il est important de s’assurer que les matériaux de stérilité sont complets, soit en conservant des solutions tampons et des réactifs stériles à long terme, soit en stérilisant avec la lampe UV germicide. Donc c’est tout. Merci pour le lavage et bonne chance dans vos expériences.