Encapsulation Cellulaire dans les hydrogels 3D pour l'ingénierie tissulaire

Le processus progressif d'encapsulation des cellules commence par la préparation et la stérilisation des moules en hydrogel et des autres matériaux, suivie de l'isolement des cellules en populations individuelles, réparties dans des tubes pour chaque jeu de gel. La polymérisation est ensuite réalisée en présence des cellules, suivie d'une période d'incubation in vitro ou in vivo. L'analyse en aval du comportement cellulaire peut inclure des tests de viabilité, de morphologie, de prolifération et de différenciation.

Bonjour, je suis Amidio Kahan du laboratoire du Dr Jason Burdick, du département de bioingénierie de l'Université de Pennsylvanie. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'encapsulation cellulaire dans des hydrogels tridimensionnels pour l'ingénierie tissulaire. Nous utilisons cette procédure pour étudier les effets de la composition et de la structure de l'hydrogel sur le comportement des cellules encapsulées.

Commençons. Pour débuter cette procédure, préparez une solution à 0,5 % en poids du photoinitiateur air cure 2 9 5 9 ou I 2 9 5 9 dans du PBS. Mélangez et incubez pendant deux à trois jours à l’obscurité à 37 degrés Celsius.

Lorsque prêt, utilisez un filtre à seringue pour stériliser la solution et conservez-la à température ambiante. Ensuite, utilisez un programme de feuille de calcul tel que Microsoft Excel pour calculer la quantité de polymère et d'agent de réticulation nécessaire, comme illustré. Voici de l'acide hyaluronique fonctionnalisé avec des groupes réactifs acrylates.

Calculez également la quantité du peptide pénant contenant le domaine adhésif fonctionnel avec les acides aminés cystine, arginine, glycine et aspartate. La cystine sert d'ancrage au polymère. Maintenant que les quantités requises de réticulateur polymère et de pent ont été déterminées, pesez-les et placez chacun dans un tube einor.

Ajustez la feuille de calcul en conséquence. Pour la masse réelle de polymère obtenue, procédez à la préparation des moules pour gel. Utilisez une lame de rasoir pour couper les extrémités des objets stériles emballés individuellement.

Seringues jetables d'un millilitre. Veillez à effectuer une coupe plate pour les moules destinés à être utilisés pour le motif photo des gels. Enfin, stérilisez les moules de seringue et les tubes EOR avec leurs bouchons ouverts, ainsi que tout autre matériel nécessaire, en les plaçant sous une source lumineuse germicide intégrée dans la hotte de sécurité biologique pendant 30 minutes.

Une fois la stérilisation terminée, procédez à la préparation des cellules après la stérilisation du matériel expérimental. Travaillez dans le hotte et ajoutez du TEA stérile au polymère utilisé pour la réticulation de type mical et du PBS stérile au polymère utilisé pour la réticulation par radicaux libres. AJOUTEZ le tampon correspondant aux tubes contenant les groupements latéraux et vortexez.

Pour que le groupement latéral se lie à l'acide hyaluronique alkylé via un groupement thiol d'un groupe INE sur le peptide afin d'attacher le groupement latéral au polymère, ajoutez-le à la solution polymérique et scellez avec du parafilm. Mélangez brièvement par vortex et incubez à 37 degrés Celsius sous agitation. Pendant la préparation des cellules, alors que le groupement latéral s'attache, préparez les cellules à encapsuler, à savoir des cellules souches mésenchymateuses humaines ou HMC, en les lavant avec du PBS.

Ensuite, incuber avec la trypsine pendant une minute à température ambiante, retirer la trypsine et incuber cinq minutes supplémentaires à 37 degrés. Puis ajouter le milieu de croissance HMSC pour neutraliser la trypsine et détacher les cellules de la surface de la plaque. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Séparez les cellules comptées en portions contenant le nombre approprié de cellules pour chaque série de gels. Pour un ensemble de trois gels de 50 microlitres à une densité de 10 millions de cellules par millilitre, séparez 1,5 million de cellules dans un tube conique individuel. Ne préparez pas plus de quatre gels dans une même série en raison des contraintes de timing liées à l'activation.

Ensuite, centrifuger les cellules à 500 RCF pendant six minutes. À température ambiante, pendant que les cellules sédimentent, préparer le mélange de polymérisation pour la réticulation par mical édition. Ajouter du tampon au réticulant pour obtenir la concentration appropriée.

Pour la réticulation radicalaire initiée par la lumière, ajoutez la solution de I 2 9 5 9 préparée précédemment à la solution polymère. À 10 % du volume total du gel fixé, afin d'obtenir une concentration finale d'initiateur de 0,05 % en poids. Les cellules et le mélange de polymérisation sont désormais prêts à être encapsulés dans l'hydrogel.

Commencez par aspirer le surnageant des cellules centrifugées. Attendez que le liquide se stabilise après la première aspiration, puis réaspirer pour éliminer autant de milieu que possible sans perturber le culot cellulaire. Resuspendez le culot cellulaire dans la solution de polymère afin d'éviter la formation de bulles d'air.

Pipetez lentement la solution vers le haut et vers le bas environ 10 fois, ce qui devrait suffire à répartir uniformément les cellules. Pour la réaction d'addition de type mical, utilisez une pointe de pipette à orifice large pour ajouter le volume approprié de solution de réticulant au polymère cellulaire. Mélangez. Réglez la pipette au volume individuel de gel souhaité.

Agiter la solution par aspiration et distribution pour l’homogénéiser et la transférer dans les moules d’embouts de seringue. Effectuer cette étape rapidement afin d’assurer une répartition uniforme des cellules, puis laisser incuber 10 à 30 minutes dans la hotte de culture pour la réticulation. Pour la réticulation radicalaire initiée par la lumière.

Prélevez le volume approprié et répartissez-le dans des moules en forme de bouts de seringue. Exposez les seringues à la lumière UV pour une réticulation radicalaire pendant 10 minutes à une longueur d'onde de 365 nanomètres. Une lumière UV de 4 milliwatts par centimètre carré est couramment utilisée pour les polymères fonctionnalisés ACRL.

Effectuez rapidement l'étape afin de minimiser la décantation des cellules avant l'exposition à la lumière UV. Après la réticulation, plongez les gels dans les puits d'une plaque de culture contenant du milieu pour l'incubation et l'analyse. La réticulation de l'hydrogel peut également être effectuée de manière séquentielle.

Commencez par ajouter le colorant fonctionnalisé métholé rumine à une concentration finale de 20 nanomolaire dans le gel. Le colorant permet de visualiser le motif, car il s'incorpore préférentiellement dans les régions du gel réticulées de manière radicalaire. Ensuite, démarrez la réaction de polymérisation de type mic, produisant une fraction des réticulations théoriques pour ce qui suit.

Pour la réticulation par radicaux libres, il faudra utiliser un masque conçu dans un programme tel qu'Adobe Photoshop ou Illustrator et imprimé directement sur des masques transparents. Les dimensions du masque doivent correspondre à celles du sommet circulaire de la seringue. Utilisez des pinces stériles pour appliquer un masque stérile directement sur la surface du gel, puis exposez à la lumière pour réticuler le gel.

On observe également ici des CSH dans des hydrogels à base d'acide hyaluronique une heure après l'encapsulation. Étant donné que les hydrogels synthétisés sont généralement transparents, les cellules peuvent être visualisées en microscopie optique pour leur morphologie. Les mêmes cellules ont été analysées quant à leur viabilité 24 heures après l'encapsulation à l'aide d'un kit de coloration fluorescente « vivantes-mortes ».

Nous avons utilisé le calcium M pour détecter les cellules vivantes et l'homodimère d'atherium pour les cellules mortes, et observé une viabilité supérieure à 95 %. Nous avons également utilisé le test alamar blue pour déterminer le niveau de prolifération cellulaire, mesuré par la capacité des cellules à métaboliser le réactif du test, ce qui entraîne un changement de couleur. La coloration des cellules a été réalisée sur des H HMC sept jours après encapsulation dans un hydrogel à base d'HA dégradable et adhésif, en utilisant des procédures standards de fixation et de perméabilisation.

L'actine cellulaire est visible à l'aide de phalloïdine marquée à la fluorescéine et les noyaux sont contrastés avec du DAPI. Une immunomarquage dirigé contre la culline est utilisé pour visualiser les adhésions focales au sein de la matrice d'hydrogel. Une coloration histologique est réalisée après déshydratation, inclusion en paraffine et sectionnement des hydrogels selon des protocoles standards, à partir d'hydrogels d'acide hyaluronique encapsulant des CSMH polymérisés radicalement.

Après une semaine en culture, les échantillons ont été colorés à l'hémat oxyéine, qui marque les noyaux, à l'ASIN, qui marque le tissu conjonctif A, et par des colorants bleus spécifiques des glycosaminoglycanes. La PCR en temps réel est utilisée pour quantifier la différenciation des cellules souches encapsulées. Après soustraction du fond, le niveau d'expression d'un gène d'intérêt est déterminé par le nombre de cycles auquel la fluorescence seuil est atteinte, comparé à un signal de référence passif correspondant à un gène ménager constitutivement actif. Nous venons donc de vous montrer comment encapsuler des cellules dans des hydrogels tridimensionnels et étudier le comportement des cellules dans ces gels.

Lors de l'utilisation de ces procédures, il est important de garantir la stérilité complète du matériel, soit en conservant les solutions tampons et les réactifs stériles sur une longue période, soit en les stérilisant à l'aide d'une lampe UV germicide. Voilà, c'est tout. Merci pour le lavage et bonne chance avec vos expériences.