Name: Voir historique et démonstration de physiologie à lJNM du muscle Opener écrevisses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Découvrez la dissection du muscle abducteur de l'écrevisse pour enregistrer les réponses synaptiques par électrophysiologie. Cette méthode historique permet d'étudier la facilitation à la jonction neuromusculaire.

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voir historique et démonstration de physiologie à l&#39;jnm du muscle opener écrevisses

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Nous présentons ici quelques-unes des découvertes clés importantes faites avec l&#39;ouvreur neuromusculaire (JNM) la préparation de crustacés et d&#39;illustrer qu&#39;il ya encore beaucoup à apprendre de cette préparation du modèle. En compréhension de l&#39;histoire, on peut comprendre pourquoi, même aujourd&#39;hui, cette JNM offre toujours un terrain de jeu riche pour répondre aux questions concernant la fonction de pré-et post-synaptique et la plasticité. La viabilité et la facilité d&#39;accès au terminal pour intracellulaire ainsi que extracellulaire électrophysiologie et d&#39;imagerie sont des avantages importants. Les mécanismes à l&#39;origine de la modulation de la cinétique et la fusion vésiculaire dans les bornes haute et basse-sortie sont la mendicité pour enquête. La préparation propose également un système modèle testable pour les évaluations de calcul et de manipulations d&#39;examiner les principales variables dans les modèles théoriques de la fonction synaptique, par exemple la dynamique de calcium pendant facilitation à court terme. La complexité synaptique de la zone active et la nature statistique de la libération quantique est aussi un espace ouvert pour la future enquête à la fois expérimentalement et numériquement.

Le muscle de la jambe ouvre écrevisses est présenté pour son importance historique et la polyvalence expérimentale dans le phénotype musculaire, la physiologie synaptique et la plasticité.

Voir historique et démonstration de physiologie à l&#39;JNM du muscle Opener écrevisses

Nous présentons ici certaines des découvertes fondamentales réalisées grâce à la préparation de la jonction neuromusculaire (JNM) des crustacés et illustrons le fait qu'il existe ...

Les muscles ouvreurs obtenus à partir d'une patte marcheuse d'écrevisse, automisée à partir de l'animal. Une fois le muscle exposé, le patron d'innervation peut être mis en évidence par diverses méthodes de coloration. Les réponses synaptiques sous forme de facilitation à court terme sont facilement enregistrées à partir du muscle.Une électrode macro-focale par patch peut être placée directement au-dessus de varicosités identifiées le long des terminaisons nerveuses. Les réponses synaptiques sont ensuite enregistrées, ce qui permet de mesurer l'efficacité synaptique à un niveau qualitatif à partir d'un emplacement défini sur la terminaison. Bonjour, je m'appelle Ann Cooper, du laboratoire du Dr Robin Cooper, du Département de biologie de l'Université du Kentucky.Bonjour, je suis Robin Cooper. Mon étudiant et moi allons vous montrer une procédure permettant de disséquer le muscle ouvreur d'écrevisse et de l'utiliser pour enregistrer les réponses synaptiques selon différents paradigmes de stimulation. Nous utilisons ces protocoles dans notre laboratoire afin d'étudier l'efficacité synaptique ainsi que la relation entre l'ultrastructure synaptique et la fonction.Commençons donc. En 1879, le zoologiste TH Huxley a écrit un ouvrage intitulé The Crayfish, qui est encore considéré aujourd'hui comme un guide complet sur l'histoire de la vie, l'anatomie et la physiologie de ce crustacé. À cette époque, l'innovation du muscle ouvreur dans les pattes des écrevisses était en cours de caractérisation, et des études physiologiques étaient déjà menées sur les muscles de l'écrevisse.En fait, les expériences menées sur l'écrevisse pourraient bien être parmi les premières à avoir démontré la facilitation au niveau de la jonction neuromusculaire ou JNM. Le Dr Riche a publié ses travaux de recherche dans ses manuels médicaux, qu'il utilisait pour enseigner aux étudiants en médecine le fonctionnement musculaire. Au cours des décennies suivantes, les JNM des écrevisses ont été décrites anatomiquement et physiologiquement en ce qui concerne le développement de la tension et l'anatomie.En 1961, Doodle et Kler ont mis en évidence une facilitation au niveau du muscle ouvreur de l'écrevisse et ont montré pour la première fois les phénomènes d'inhibition présynaptique, tout en rapportant la nature qualitative de la transmission synaptique. En 1971, au niveau de cette JNM, Sherman et Edward ont réalisé la découverte fondamentale que la JNM ouvreuse de l'écrevisse présentait une facilitation à long terme, ou FLT, en plus de la facilitation à court terme, ou FCT.À partir de cette période, de nombreux chercheurs se sont concentrés sur les caractéristiques du SDF et du LTF en utilisant la jonction neuromusculaire du muscle ouvreur de l'écrevisse pour étudier les mécanismes cellulaires. Aujourd'hui, la préparation du muscle ouvreur de l'écrevisse est encore utilisée pour étudier les fondamentaux de la transmission synaptique, car elle est facile d'accès et très robuste par rapport à de nombreuses autres préparations. Pour obtenir la préparation synaptique à partir de la patte de l'écrevisse, une écrevisse mesurant de six à dix centimètres de longueur corporelle est incitée à automiser sa première ou deuxième patte marchante en pinçant fortement le segment podalique de l'ischium.Cette procédure ne tue pas l'écrevisse, qui est retournée dans son réservoir d'attente. Placez la patte de l'écrevisse sur un morceau de papier absorbant situé sur la platine du microscope. Tournez la patte jusqu'à ce que l'extérieur soit orienté vers le haut.C'est généralement le côté bombé vers le haut. Utilisez une lame de rasoir bien aiguisée pour graver la cuticule jusqu'à ce qu'elle soit juste entamée. Dans ce cas, veillez à ne pas couper trop loin en direction distale lors de l'incision de la face dorsale vers la face ventrale, près de l'articulation entre la capsule médullaire et la capsule cuivrée.Laissez la cuticule en place pour l'instant ; avec la lame de scalpel, gravez la cuticule selon le régime alimentaire approprié jusqu'à ce que la coupe traverse juste la cuticule, selon ce motif, pour le segment correspondant au régime alimentaire approprié d'un côté. Ensuite, répétez de l'autre côté, en raccordant les coupes proximales afin d'éviter de sectionner le muscle ouvreur ; maintenez la lame inclinée vers le muscle le plus proche. Lors de la section de la cuticule, laissez-la en place pour l'instant.Ensuite, plongez la patte dans une solution saline pour écrevisse contenue dans une boîte de dissection présentant au fond un revêtement de protection d'un centimètre d'épaisseur. Insérez une épingle dans le coin dorsal cordal situé à l'intérieur de l'ouverture pratiquée dans le mérite afin de maintenir la préparation immobile à l’aide de fines pincettes. Soulevez légèrement la cuticule à partir de l'extrémité distale, puis sectionnez au rasoir les fibres musculaires fléchisseuses en les détachant de la cuticule selon un sens disto-proximal.Ensuite, soulevez la fenêtre de cuticule. Une fois la cuticule soulevée, retirez délicatement le tendon de la cavité de la patte et sectionez l'AEM au niveau de l'articulation meite-CARite. Veillez à ne couper que le tendon et non le nerf principal de la patte, situé du côté interne du tendon.Pincez le tendon à l'endroit où il a été coupé avec une pince et retirez le muscle fléchisseur en le soulevant dans une direction cordeuse. Le nerf principal de la patte et le muscle extenseur sont désormais exposés. Passez au segment du régime approprié et sectionnez au niveau de l'articulation entre le régime approprié et le dactyle, au niveau de la couche lipidique.Tirer vers le bas et vers l'arrière le segment ventral du régime alimentaire approprié tous les trois mois afin que les muscles attachés à la région cordale soient visibles. Couper ces muscles avec le rasoir. Veiller à ne pas sectionner la branche nerveuse motrice du muscle ouvreur.Le muscle ouvreur est désormais exposé à la solution saline. Revenez à la région la plus corde du segment méite, où le cordon nerveux de la patte contient habituellement deux faisceaux nerveux séparés. Sectionnez le faisceau dorsal à l’aide de ciseaux fins.Ensuite, saisissez l'extrémité coupée avec une pince et tirez doucement vers le distal jusqu'à atteindre environ la moitié de la longueur du segment méite. Cette longue branche nerveuse contient le nerf excitateCouper la préparation au niveau du segment mérite de manière diagonale afin qu'une épingle à insecte puisse être insérée par l'aspect dorsal du mérite. Cela positionne l'aspect ventral du muscle écarteur vers le haut, de sorte qu'il soit orienté vers l'observateur. Ensuite, retirer les fibres résiduelles du muscle rapprocheur qui obstruent la vue du muscle écarteur.En poussant les fibres contre la cuticule et hors de la cavité, le nerf principal de la patte, qui longe le muscle ouvreur et pénètre dans le lipide du dactyle, peut être délicatement tiré vers le haut à l’aide de fines pincettes, puis sectionné. Le muscle ouvreur est désormais exposé, sans aucun tissu gênant. Pour enregistrer les potentiels postsynaptiques excitateurs (PPSE) à l’aide d’une électrode intracellulaire ou d’une électrode de type macro-patch focal, placez la préparation du muscle ouvreur dans une chambre d’enregistrement équipée d’une électrode de succion en plastique.Le fait que l'électrode de stimulation soit intégrée à la chambre évite d'avoir à utiliser un micromanipulateur pour positionner une électrode de stimulation dans la préparation au fond de la cuve d'enregistrement et placer la branche du nerf contenant le nerf excitateu dans l'électrode de succion. Le muscle ouvreur est divisé en trois régions générales : distale, centrale et proximale. Bien que l'ensemble du muscle ouvreur soit innervé par un unique motoneurone, les jonctions neuromusculaires présentent des différences structurelles et des variations régionales spécifiques de l'efficacité synaptique.Étant donné que les fibres les plus distales sont facilement délimitées pour assurer une cohérence entre les préparations, nous utiliserons la région distale pour cette démonstration afin d'obtenir une réponse évoquée. L'axone excitateaur sera stimulé sélectivement à l'aide d'un stimulateur grass huit huit. La région distale du muscle ouvreur est piquée avec une électrode intracellulaire effilée remplie de chlorure de potassium à trois molaire.Un amplificateur modèle axon clamp deux B et une tête de stage A un XL lu sont utilisés pour l'enregistrement des PSEP intracellulaires. Une facilitation à court terme ou divers autres types de réponses souhaités peuvent être obtenus en faisant varier les conditions de stimulation. La FCT est obtenue en appliquant une série de 10 ou 20 impulsions à des intervalles de 10 ou 22 ms respectivement sur le nerf excitateur.La fréquence de stimulation au sein de la série peut être modifiée. La sortie du générateur est reliée à un isolateur de stimulus, dont la connexion est attachée au fil d'argent intégré dans l'électrode de succion en plastique. Une connexion est fixée à un fil d'argent placé dans le bain afin d'enregistrer directement les potentiels postsynaptiques excitateurs focaux (EPSP) au-dessus de régions identifiables de la terminaison nerveuse.Les varicosités synaptiques sont d'abord visualisées à l'aide d'un colorant fluorescent vital, le four dye two A SP. Une électrode de type macro-patch fabriquée en verre chix sera utilisée ici. La lumière de l'électrode est remplie d'un milieu salin de bain, et l'expérience est réalisée sous microscope à fluorescence. Placez la lumière d'une électrode de macro-patch directement au-dessus d'une varicosité isolée unique afin d'exciter la terminaison nerveuse. Le nerf moteur excitateur est stimulé comme indiqué précédemment.Des réponses « qual » spontanées ainsi que provoquées peuvent être enregistrées le long de la chaîne de varicosités visualisées en abaissant doucement la lumière de l'électrode puis en la relevant. Un décompte direct des événements « qual » est possible pour chaque varicosité en utilisant des fréquences de stimulation faibles pour chaque réponse provoquée. Le nombre d'événements « qual » peut être déterminé pour une série de réponses.Le nombre total d'événements qual est décompté afin d'estimer ensuite la teneur moyenne en qual à partir de ces décomptes directs. Une approche pour calculer la teneur moyenne en qual consiste à prendre le nombre total des types d'événements qual induits pendant la stimulation et à le diviser par le nombre total d'essais de stimulation en utilisant la formule suivante. On observe ici un ensemble d'essais répétitifs de stimulation de 30 impulsions à 40 hertz.Remarquez la facilitation pour chaque essai et la réponse moyenne si la stimulation a augmenté à 60 hertz. Une facilitation plus marquée est observée lors de l'enregistrement avec une électrode focale au-dessus d'une varicosité et lors d'une stimulation à un hertz. Les réponses qal évoquées sont observées.Nous venons de vous montrer comment disséquer le muscle ouvreur de l'écrevisse et l'utiliser pour enregistrer les réponses synaptiques à l'aide de divers paradigmes et techniques de stimulation. Lors de ces procédures, il est important de se rappeler de manipuler les neurones avec précaution, sans tirer trop fort ni les pincer. De plus, lorsque vous placez l'électrode de macro-patch focal sur les varicosités visualisées, posez délicatement l'électrode sur ces varicosités, puis soulevez-la doucement.Un autre point à retenir est qu'il ne faut pas exposer trop longtemps le prélèvement à la lumière au mercure, car cela pourrait également endommager la terminaison nerveuse. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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