Surveillance de la fonction cardiaque chez les larves Drosophila melanogaster Pour les études physiologiques

Les drosophiles sont génétiquement intéressantes pour l'étude du développement et du fonctionnement du cœur ainsi que de l'activité sous-jacente du pacemaker. Ce protocole montre comment préparer des larves intactes et disséquées et comment surveiller la fréquence cardiaque. La préparation disséquée permet également l'enregistrement de potentiels extracellulaires ou intracellulaires afin d'étudier davantage la fonction des canaux ioniques.

Bonjour, je suis Robin Cooper, membre du corps professoral du département de biologie à l'Université du Kentucky. Aujourd'hui, mes étudiants, Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward et Easter Boku, vous montreront différentes procédures permettant de surveiller la fréquence cardiaque chez les larves de Drosophila. La méthode suivante, non contraignante, est appelée « ferme de fourmis » parce que les larves sont visualisées dans un seul plan focal.

Pour une visualisation optimale des larves, utilisez un microscope stéréoscopique équipé d'un objectif de base à deux x et d'un objectif de tube à 0,5 x afin d'obtenir la meilleure résolution spatiale et un grossissement adéquat sur un rectangle d'un centimètre sur 0,5 centimètre. Des photographies et des vidéos peuvent être enregistrées à l'aide d'une caméra montée sur l'oculaire. Pour commencer cette méthode, placez une larve entre deux lames de verre en la sandwichant avec une fine couche de nourriture.

Les lames sont maintenues à une distance de 1 à 1,5 millimètre à l’aide d’espaces en plastique sur les quatre côtés. Inclinez la préparation entre 20 et 45 degrés pendant quelques minutes afin d’encourager la larve à garder la tête dirigée vers le bas. Réglez le miroir du microscope pour obtenir un contraste optimal du cœur ou des deux trachées afin d’observer les battements cardiaques.

La méthode de collage est une monture permanente permettant de maintenir les larves sur une lame en verre. Pour commencer la méthode de collage, placez une lamelle propre sur une lame en verre. Déposez une petite goutte de colle superglue sur un coin de la lamelle.

Ensuite, rincez les larves à l'eau. Pour éliminer l'excès de nourriture, absorbez le liquide à l'aide d'un mouchoir en papier ou du coin d'une serviette en papier. Une fois la larve bien rincée, prenez-la délicatement avec des pinces propres et placez-la sur la lame, à l'écart de la lamelle sous le microscope, en orientant la larve sur le ventre.

L'estomac présentera de faibles sillons horizontaux parcourus par de fins poils noirs. Le dos des larves doit être orienté vers le haut et présente deux bandes parallèles, qui correspondent aux trachées. À l'aide d'une deuxième paire de pinces réservée exclusivement à la manipulation de la colle, prélevez une petite quantité sur la goutte située à l'extrémité du support et déposez-la dans l'angle opposé.

Utilisez une toute petite quantité, juste assez pour recouvrir la pointe de la pince. Prenez l'animal et placez-le sur la colle en veillant à ce qu'il reste en place, côté ventral vers le bas, avec la bouche noire.

Les crochets doivent se situer au niveau ou près du bord de la lame couvre-objet, au niveau des crochets buccaux et de la spirale brune. Ils ne doivent pas toucher la colle. Appuyez doucement sur les larves pour les aplatir.

Pour appliquer une substance test, il est préférable de déposer de petites gouttes à l’aide d’une seringue près de la tête de la larve. Observez la fréquence cardiaque en comptant le nombre de pulsations des spiracles pendant une minute. Pour des observations plus longues, les larves peuvent être nourries sur place et humidifiées afin d’éviter la déshydratation. Pour préparer une lame de dissection utilisable au microscope, utilisez un scalpel pour découper un trou de deux centimètres de diamètre au centre d’un morceau de ruban magnétique, puis collez-le sur une lame en verre.

Utilisez des épingles de dissection qui ont été courbées et collées sur des trombones pour faciliter l'épinglage. Pendant la dissection, placez une larve de troisième stade intacte sur la plaque de dissection. Le côté dorsal vers le haut, la trachée doit être visible à travers la cuticule.

Placez deux épingles dans les larves de chaque côté des crochets buccaux, et deux autres épingles de chaque côté des spiracles. Ensuite, ajoutez du sérum physiologique pour maintenir les larves humides. Puis effectuez une incision horizontale au niveau de l'extrémité postérieure, suivie d'une incision longitudinale qui doit se prolonger le long des spiracles en direction de la tête de l'animal.

Soulevez une épingle dorsale et accrochez-la sous le cuticule. Utilisez l'épingle pour écarter. Ouvrez la cavité corporelle.

Répétez avec les trois autres épingles. Une fois que l'animal a été épinglé ouvert, retirez les viscères en prenant soin de ne pas endommager la trachée ni le cœur. Certaines structures, notamment le cerveau et certains corps adipeux, sont attachées au cœur et pourraient l'endommager lorsqu'elles sont retirées.

Laisser le prélèvement se reposer dans un bain saline HL3 pendant trois à cinq minutes après la dissection. Des enregistrements intracellulaires et extracellulaires sont réalisés sur ce prélèvement pendant l'application directe d'agents pharmacologiques au niveau du cœur. La durée totale de cette étape de dissection est de trois à six minutes. Pour effectuer un stimuler électrique, des électrodes focales doivent d'abord être préparées : faire glisser une électrode en verre au-dessus d'un élément chauffant afin de polir par fusion et de former une courbure progressive d'environ 45 degrés. Monter une électrode focale remplie de solution saline HL3 à température ambiante dans le manipulateur, avec la pointe orientée vers le bas.

Veillez à ce que le fil du stimulateur touche la solution saline à l'intérieur de l'électrode et que le stimulateur soit éteint. Fixez une préparation fraîche de dissection cardiaque sur le microscope. Placez le fil de mise à la terre dans la solution saline.

En prenant soin de ne pas toucher les broches ni de perturber la préparation. Maintenir le focus sur l'électrode tout en utilisant le manipulateur pour la descendre dans la solution saline. Une fois dans la solution saline, positionner l'extrémité de l'électrode avec le lumen à plat contre le cœur et le touchant légèrement.

Une fois l'électrode positionnée, réglez la fréquence du stimulateur à deux hertz avec la tension au réglage le plus bas. Allumez le stimulateur. Ajustez la fréquence à environ trois hertz et augmentez lentement la tension jusqu'à ce que le rythme cardiaque s'accélère pour s'aligner sur celui du stimulateur.

Le rythme peut désormais être modulé à l’aide du stimulateur. Des composés peuvent être ajoutés pour vérifier s’ils affectent la contraction ou la conduction électrique. Pour effectuer des enregistrements de potentiels de champ, remplissez une électrode d’enregistrement macro-patch avec le milieu de bain et fixez-la sur un manipulateur monté sur un microscope composé.

Connectez l'électrode à un amplificateur et à un dispositif d'enregistrement. Utilisez le manipulateur pour abaisser le lumen de l'électrode au-dessus du cœur d'une préparation de dissection fixée sur le microscope. Touchez très légèrement le cœur avec la pointe de l'électrode.

Des enregistrements in situ peuvent désormais être effectués pour enregistrer les potentiels de champ à partir d'une autre région du cœur. Relevez délicatement l'extrémité de l'électrode et déplacez-la vers une nouvelle zone à l'aide du manipulateur, puis abaissez à nouveau la pointe pour reprendre les enregistrements des potentiels de champ. Cela permet un suivi précis de la fréquence et de la durée des signaux électriques dans le cœur afin de mesurer les potentiels transmembranaires des myocytes larvaires.

Tout d'abord, assurez-vous que la lumière d'une microélectrode remplie de chlorure de potassium à trois molarités soit bien appliquée contre le cœur selon un angle d'environ 45 degrés par rapport à la verticale. Une fois correctement positionnée, touchez délicatement le cœur avec la pointe de l'électrode et enfoncez légèrement la pointe dans une cellule. L'électrode peut être réutilisée si elle n'est pas cassée.

Les enregistrements intracellulaires permettent de mesurer la base ionique du potentiel d'action et les formes caractéristiques des potentiels afin d'examiner les effets des mutations des canaux ioniques ou des modulateurs de canaux. Nous venons donc de vous montrer comment réaliser des enregistrements cardiaques ainsi que des potentiels intracellulaires et extracellulaires. Vous pouvez utiliser ces techniques pour étudier les modifications cardiaques ainsi que les manipulations pharmacologiques et les altérations génétiques.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas tirer sur une structure connexe attachée au cœur ni d'appuyer trop fort avec l'électrode focale. De même, avec la méthode de la colle, veillez à ne pas coller la bouche ou la sphère. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec leurs expériences.