Détermination microvolume concentration de protéines en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop 2000c

La technologie NanoDrop combine la fibre optique et la tension superficielle pour maintenir et mesurer de petites quantités d’échantillons tels que des acides nucléiques et des protéines. Une petite gouttelette d’échantillon est pipetée directement sur le socle inférieur. Un socle optique supérieur engage ensuite l’échantillon pour former une colonne.

Le socle se déplace automatiquement pour s’ajuster à une longueur de trajectoire optimale. Le raccourcissement de la longueur du trajet élimine le besoin d’effectuer des dilutions pour la plupart des échantillons de protéines, la mesure se fait en quelques secondes et les résultats du spectre de visibilité sont affichés. Bonjour, je m’appelle Lynn Kalhorn et je travaille aux laboratoires NanoDrop de Thermo Fisher Scientific.

Aujourd’hui, nous allons montrer une procédure pour déterminer la concentration en protéines à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume innovant. Le spectrophotomètre NanoDrop 2000 C utilise un système innovant de rétention d’échantillons qui s’appuie sur la tension superficielle des liquides pour maintenir et mesurer des échantillons de micro-volume entre deux socles optiques sans utiliser de cuvettes ou de capillaires. L’échantillon de micros est placé directement sur la surface de détection, et une colonne de liquide est créée entre les extrémités des fibres optiques par la tension superficielle.

Cette colonne de liquide forme un chemin optique vertical. Une lampe flash au xénon fournit la source lumineuse et un spectromètre utilisant un réseau CCD linéaire est utilisé pour analyser la lumière qui traverse l’échantillon. Le retrait des dispositifs de confinement traditionnels tels que les cuvettes du système présente plusieurs avantages.

De très petites quantités d’échantillon sont nécessaires pour la mesure. Le nettoyage d’un à deux microlitres nécessite simplement d’essuyer les surfaces optiques avec une lingette de laboratoire et la longueur du trajet change automatiquement en temps réel pendant la mesure. De plus, le raccourcissement de la longueur du trajet permet de mesurer des concentrations plus élevées, ce qui élimine efficacement la nécessité d’effectuer une dilution pour la plupart des échantillons de protéines.

Dans les cas où un vétérinaire est justifié, comme les études cinétiques, le NanoDrop 2000 C offre une option vétérinaire dans le même spectrophotomètre. Pour ce protocole, nous utiliserons l’option du piédestal de micro-volume pour déterminer la concentration en protéines. La méthode de la protéine A deux 80 est applicable aux protéines purifiées qui contiennent des résidus de tryptophane, de tyrosine et de phénylalanine ou des liaisons disulfure de cystéine et de cystéine et présentent une absorbance à 280 nanomètres.

Pour commencer cette procédure, sélectionnez l’application de la protéine A deux 80 dans le menu principal. Si la fenêtre de vérification de la longueur d’onde apparaît, assurez-vous que le bras est abaissé, sélectionnez le type d’échantillon à mesurer dans la liste déroulante. Le réglage par défaut est recommandé pour la plupart des mélanges de protéines inconnus dans lesquels une ABSORBENCE équivaut à un milligramme par millilitre.

Si l’on mesure une protéine purifiée précédemment caractérisée, le coefficient d’extinction de masse ou le coefficient d’extinction molaire peut être saisi. Pour déterminer plus précisément la concentration en protéines, choisissez les unités de concentration dans la liste déroulante adjacente à la case de code couleur. Ensuite, établissez un blanc.

À l’aide d’un tampon approprié, il est important d’utiliser le tampon dans lequel la protéine est en suspension. Le tampon utilisé doit avoir le même pH et une force ionique similaire à celle de la solution de l’échantillon. En raison de la variabilité de la tension superficielle entre les différentes protéines, nous recommandons de charger deux microlitres d’échantillons pour assurer une bonne formation de la colonne.

Pour charger, touchez la pointe de la pipette à faible rétention sur la surface du socle inférieur tout en expulsant la solution pour empêcher la solution d’adhérer à l’extérieur de la pointe de la pipette, expulsez moins que la quantité totale d’échantillon pour éviter l’éclatement et l’introduction de bulles dans l’échantillon. Une fois l’échantillon chargé, abaissez le bras, cliquez sur blanc. Une fois le masquage terminé, essuyez la solution vierge des socles inférieur et supérieur.

À l’aide d’une lingette sèche de laboratoire avant de prélever une aliquote pour la mesure, il est important de s’assurer que l’échantillon est homogène. Mélangez l’échantillon doucement mais soigneusement en tourbillonnant doucement à l’aide d’un régime moyen pour éviter d’introduire des microbulles dans le fluide. Entrez un exemple d’ID dans le champ approprié.

Chargez deux microlitres du premier échantillon comme indiqué précédemment pour le blanc, abaissez le bras et cliquez sur la mesure Une fois la mesure terminée, essuyez l’échantillon des socles inférieur et supérieur. À l’aide d’une lingette sèche de laboratoire, mesurez tous les autres échantillons de la même manière en utilisant une aliquote fraîche de deux microlitres d’échantillon pour chaque mesure. Une lingette de laboratoire non pelucheuse ordinaire est souvent suffisante pour nettoyer les socles optiques entre les mesures.

Le seul solvant incompatible et qui ne doit pas être utilisé est l’acide fluorhydrique, les solutions et les réactifs contenant des tensioactifs peuvent déconditionner les surfaces du socle de mesure au fil du temps, empêchant la formation de la colonne de liquide de l’échantillon. Un aplatissement de la gouttelette sur le socle inférieur est indicatif que la surface optique devient inapte à être reconditionnée. Les surfaces du socle sont soit polies vigoureusement à l’aide d’un chiffon de laboratoire, soit la méthode préférée consiste à utiliser le composé de reconditionnement de socle NanoDrop PR one comme indiqué.

S’il s’agit d’une solution protéique non caractérisée, d’un lysat cellulaire ou d’un extrait de protéine brute, nous vous recommandons d’utiliser l’une des méthodes colormétriques préconfigurées disponibles sur le NanoDrop 2000 C. Ces méthodes colormétriques incluent les dosages BCAP, 60 Bradford et Lowy. Le dosage de l’ACB sera démontré ici. Les réactifs requis pour le dosage de l’ACB sont contenus dans le kit compatible avec l’agent réducteur de perçage de Thermos scientific, le réactif A, B, C, A, le réactif B et les étalons d’albumine sérique bovine.

Nous utiliserons l’ensemble d’albumine pré-diluée de pierce, car nos normes se réfèrent à la littérature de pierce BCA pour déterminer quelles normes de dosage sont appropriées à votre situation. Pour préparer les réactifs, équilibrez d’abord toutes les protéines inconnues et les étalons de protéines à température ambiante et mélangez soigneusement par vortex doux. Utilisez un régime moyen pour éviter d’introduire des microbulles dans le liquide.

Étant donné que les bulles peuvent affecter négativement les lectures. Préparez suffisamment de réactif de travail frais pour que les étalons et les échantillons soient mesurés à l’aide d’un rapport de 50 pour un de réactif A à B.In cet exemple, nous préparerons trois millilitres de réactif de travail pour couvrir les cinq étalons de référence et six échantillons. Le test BCA régulier couvre une plage dynamique plus large et utilise un rapport réactif/protéine de 20 pour un, tandis que le test micro BCA est plus sensible et a une plage dynamique plus étroite en utilisant un rapport réactif/protéine un pour un.

Parce que nous effectuons le dosage régulier des BCA, nous préparerons un rapport de 20 pour un entre le réactif de travail et l’échantillon. Ajoutez 190 microlitres de réactif de travail dans chaque tube avec suffisamment de tubes pour couvrir tous les échantillons et étalons. Ensuite, ajoutez 10 microlitres d’étalon ou d’échantillon dans chacun des tubes contenant le réactif.

Bien mélanger par un léger vortex. Incuber les tubes à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, laissez les réactions s’équilibrer à la température ambiante pendant environ 10 minutes.

Contrairement à la méthode de la protéine A deux 80, la méthode de la protéine BCA exige qu’une courbe standard soit générée avant que les concentrations de protéines de l’échantillon puissent être mesurées. Pour générer une courbe standard, commencez par sélectionner la méthode BCA protéique dans le menu principal. Si la fenêtre de vérification de la longueur d’onde apparaît, assurez-vous que le bras est abaissé.

Entrez les valeurs de chaque concentration standard dans le tableau du volet de droite. Le logiciel permet la référence et jusqu’à sept normes supplémentaires. La référence et/ou les étalons peuvent être mesurés en répétitions.

Établissez un espace vide à l’aide de la mémoire tampon appropriée. Le blanc pour les tests métriques couleur est généralement désionisé. Pipette à eau deux microlitres d’eau sur le socle inférieur et abaisse le bras.

Cliquez sur blanc. Une seule ébauche est nécessaire pour couvrir toutes les mesures ultérieures de la référence et des étalons. Établissez la référence en pipetant un Eloqua de deux microlitres de réactif et de tampon sans protéines sur le socle inférieur.

Abaissez le bras et cliquez sur mesurer. Sous l’onglet normes, mettez en surbrillance l’étalon souhaité et pipetez deux microlitres de l’étalon souhaité sur le socle inférieur. Abaissez le bras et cliquez sur mesurer.

Répétez le processus pour toutes les normes. Pour afficher la courbe standard, cliquez sur Afficher la courbe standard. Une fois que tous les étalons ont été mesurés, cliquez sur le bouton des échantillons.

Entrez l’ID de l’échantillon, chargez deux microlitres d’échantillon sur le socle inférieur et cliquez sur mesurer. Une aliquote fraîche de deux microlitres d’échantillon doit être utilisée pour chaque mesure. Une fois la mesure terminée, essuyez l’échantillon des socles inférieur et supérieur à l’aide d’une lingette sèche de laboratoire.

Le résultat est ensuite obtenu car la concentration finale de l’échantillon est calculée automatiquement à l’aide de la courbe standard. Nous venons de montrer deux façons de déterminer la concentration en protéines, soit par une mesure directe de deux 80, soit par une méthode métrique indirecte en couleur, chacune utilisant le spectrophotomètre à micro-volume NanoDrop 2000 C. C’est tout.

Merci d’avoir regardé.