Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

La première étape consiste à prendre une culture T 25 confluente de umsl. Je vais simplement laver avec du PBS, puis ajouter quelques gouttes de TR et laisser agir pendant quelques minutes. Je peux observer que les cellules se détachent de la plaque. Elles sont donc presque prêtes.

Très bien, maintenant je vais collecter les cellules oculaires traitées à la trypsine et il est conseillé de secouer doucement les cellules oculaires traitées à la trypsine pendant un bref instant afin de dissocier les colonies, puis de les déposer sur la plaque UN. Celle-ci restera ensuite dans l'incubateur pendant environ 30 à 45 minutes. À présent, je vais centrifuger ces cellules pour les récupérer, puis je vais simplement les aspirer.

Donc, je vais simplement resuspendre dans quelques minutes afin de pouvoir effectuer ce comptage. J'ai donc resuspendu et maintenant j'ai compté, puis je prélève un aliquot que je vais ajuster à 50 mL, ce qui me donnera la concentration appropriée pour obtenir une centaine de cellules par goutte, afin de vérifier que les cellules sont en bon état. Nous disposons maintenant d'un réservoir.

Secouez légèrement ces échantillons une fois de plus, puis versez-les dans notre réservoir. Très bien, le programme est déjà configuré. Voilà, c'est parti.

À présent, c'est assez droit. Retournez-le et mettez-le de côté. Tous les deux ou trois plateaux, inclinez-le légèrement pour que le liquide bouge un peu.

Très bien, ce sont donc cinq plaques. Je vais maintenant les placer dans l'incubateur. Ce sont nos gouttes suspendues que nous avons préparées il y a deux jours.

Pour recueillir les gouttelettes, il suffit donc d'agiter doucement les plaques afin de les rassembler. Je vais donc récupérer tout le contenu, en essayant de procéder délicatement pour ne pas trop perturber les VES ; je vais simplement prélever cinq ou six fois du PBS et rincer les plaques. Ensuite, nous laissons reposer pendant au moins 10 minutes, et les VES sédimenteront par gravité.

Une fois que vous avez vérifié visuellement que vos EBS se sont déposés, vous retirez alors la majeure partie du surnageant, mais pas entièrement, car vous ne voulez pas les perturber. Bon, maintenant, on les agite jusqu'au jour six. Ce sont des corps embryonnaires préparés il y a six jours à partir de cellules souches embryonnaires murines, et habituellement, on les récupère en faisant tourner légèrement les plaques.

Lorsque vous agitez doucement les plaques, les eds se regroupent au centre de la boîte, ce qui facilite un peu leur correction. Vous laissez alors les eds se déposer par gravité au fond du tube, puis vous retirez le milieu et effectuez un lavage avec 10 à 12 mL de PBS. Très bien, laissez-les reposer maintenant, attendez une minute.

Donc maintenant, je vais simplement retirer le P. Nous ajoutons 250 microlitres de notre mélange enzymatique, puis nous ajoutons un millilitre, et nous plaçons ensuite les échantillons dans un bain-marie à 37 degrés. De temps en temps, peut-être deux ou trois fois, je passerai pour les agiter légèrement afin de bien les mélanger, car les ED se sont déposés. Nous disposons maintenant de ce tampon de dissociation cellulaire, sans enzyme, que nous obtenons simplement de gpro.

Nous allons ajouter environ huit millilitres de ce produit dans chaque tube. Ensuite, nous allons simplement effectuer plusieurs aspirations et dispensations avec une pipette de cinq millilitres pour dissocier les tissus ; au fur et à mesure que vous répétez cette opération, la suspension deviendra très trouble. Cela constitue un indicateur visuel indiquant que les cellules se dispersent dans le milieu, le rendant très opaque. Maintenant, je vais dénombrer les cellules par exclusion au trypan ; si vous souhaitez réaliser une infection ou calculer un indice de multiplicité (MOI), il est très important de faire ce dénombrement.

Je vais donc simplement préparer un grand lot de virus, plus du milieu, plus des cellules à la concentration appropriée, plus du sulfate de protéine. Et ensuite, je m'assure toujours que les cellules – encore une fois, je suis paranoïaque concernant la mise en suspension des cellules. Je suis donc constamment vigilant, et j'utilise aussi un petit volume, en essayant d'être prudent pour éviter les éclaboussures lors de la centrifugation à 2 500 tr/min.

Je récupère donc nos cellules du jour 10, pour lesquelles j'ai conservé tous les lavages. J'utilisais auparavant du PI (iodure de propidium), mais le sept n'est pas aussi brillant. Il s'infiltre donc moins de canaux, ce qui le rend plus propre.

Donc, maintenant, nous récupérons simplement l'échantillon, ce qui constitue une bonne méthode pour éviter la perte dans l'aiguille en raison du volume. Je suis Shannon McKinney Freeman. Je suis chercheuse postdoctorale au sein du laboratoire de George Families Life Attorney à l'hôpital pour enfants de Boston.

Aujourd'hui, nous allons détailler la méthode permettant d'obtenir une population de cellules transplantables à partir de cellules souches embryonnaires murines, capables de reconstituer le système hématopoïétique. Pourquoi réalisons-nous cette expérience ? En effet, nous savons qu'avec ce système, nous pouvons obtenir – tout d'abord, le protocole définitif a été mis au point afin d'isoler une population de cellules à partir de cellules souches embryonnaires possédant une activité de cellules souches hématopoïétiques, c'est-à-dire capables de sauver des souris d'une irradiation létale, de reconstituer leur système hématopoïétique de manière durable, pendant toute la durée de vie de l'organisme, et dans toutes les lignées sanguines périphériques.

C'est pourquoi le protocole a été mis au point. Nous réalisons maintenant des expériences supplémentaires afin de comprendre le phénotype de la population de cellules au sein de cette population élargie que nous obtenons et qui exercent réellement cette activité de cellules souches hématopoïétiques. En effet, nous ne savons pas quelle est cette cellule ; nous savons que la population est très hétérogène, et nous savons que la cellule qui sauve effectivement les souris est extrêmement rare au sein de cette population cellulaire.

Nous essayons donc fondamentalement de définir son phénotype afin de pouvoir l'isoler à partir de ces cellules très hétérogènes. Ensuite, nous souhaitons surtout comprendre comment il se compare fonctionnellement à une cellule souche hématopoïétique authentique que l'on pourrait obtenir à partir de moelle osseuse entière. Possède-t-il une capacité de reconstitution équivalente sur le plan développemental ? Semble-t-il refléter une CSH de moelle osseuse adulte ?

Ou peut-être serait-ce plutôt une cellule souche hématopoïétique. On pourrait observer un développement précoce par exemple dans le GM ou le foie fœtal. C’est précisément ce que nous cherchons à comprendre, et nous souhaitons répondre à ces questions parce qu’au bout du compte, nous aimerions que ce protocole serve de guide pour des travaux similaires que nous souhaitons entreprendre avec des cellules souches embryonnaires humaines.

Et nous pensons que les informations que nous obtenons grâce au système mathématique bénéficieront grandement à ces futures expériences. Je crois qu'il y a plusieurs aspects. Tout d'abord, c'est simplement un bon modèle in vitro, un bon modèle in vitro du développement.

Nous essayons donc tout d'abord de comprendre le développement des cellules souches hématopoïétiques. C'est un système intéressant, très simple, permettant l'expression ectopique de gènes et l'analyse de l'influence de ces facteurs sur le développement des cellules souches hématopoïétiques. Ce système est donc très utile d'un point de vue de la recherche fondamentale.

Mais notre objectif ultime est de développer une thérapie cellulaire pouvant être utilisée cliniquement pour obtenir, par exemple, des cellules souches métaboliques transplantables à partir de cellules humaines. Toutefois, cela reste probablement encore lointain. En réalité, nous avons découvert que la partie la plus difficile ne réside pas tant dans l'obtention des cellules elles-mêmes, mais que, grâce à des expérimentations minutieuses, nous avons traversé une période durant laquelle nous avions des difficultés à faire en sorte que les cellules reconstruisent nos animaux receveurs.

Et ce que nous avons finalement découvert, c’est que nous devions accorder une attention très particulière à l’ablacion des receveurs, car ces cellules ne sont pas capables de le faire. En effet, habituellement, lorsque vous effectuez une greffe chez des souris avec des cellules souches hématopoïétiques issues de la moelle osseuse, vous appliquez une irradiation de 10 ou 11 grays pour aseptiser les souris, et les cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse sont tout à fait capables de sauver les animaux d’une telle dose. Or, il s’avère que cette population de cellules que nous amplifions n’est pas capable de sauver les animaux d’une dose aussi élevée de rayonnement ionisant.

Ce que nous avons dû faire, c'est ajuster très précisément la dose d'irradiation en tenant compte de la taille des animaux, car nous avons constaté que si les animaux étaient trop gros et que nous utilisions la même dose, l'ablation n'était pas efficace. Mais, une fois encore, si l'irradiation des animaux est insuffisante, les cellules ne sont pas capables de concurrencer des hôtes plus résistants.

En réalité, une fois que nous avons compris que c'était une variable majeure, rendant difficile l'observation de l'activité ab de ces cellules, et que nous avons essentiellement déterminé par titrage la dose d'irradiation, tout en réalisant également que l'âge et le poids de l'animal sont très importants, c'est à ce moment-là que nos expériences ont commencé à être très reproductibles. Ce que nous avons découvert, c'est que si vous utilisez des animaux d'environ 20 grammes, entre 15 et 20 grammes, et que vous les ablâtez avec 9,25 gray, cette dose semble être idéale, car elle donne à ces cellules l'avantage dont elles ont besoin pour reconstituer les souris. Oui, et je pense que c'était là l'une des variables les plus importantes.

L'autre chose importante serait le nombre de cellules que vous injectez. Nous avons également effectué un titrage en utilisant ces conditions particulières pour irradier notre organisme modèle. Nous avons également titré le nombre de ces cellules non fractionnées, provenant de cette population hétérogène, que nous injectons dans des souris.

Et nous avons essentiellement constaté qu'une dose minimale d'environ 2 à 5 millions de cellules est nécessaire pour sauver les animaux. Si vous en injectez moins, les animaux ne sont pas sauvés. Et je pense que cela indique probablement la rareté, vous savez, de la cellule qui intervient réellement dans le sauvetage au sein de ce compartiment hétérogène.

Je pense donc que les variables les plus importantes sont le nombre de cellules que vous injectez et le fait de s'assurer que, quel que soit le modèle de greffe utilisé, vous utilisez suffisamment le tube ou la lame pour donner aux cellules l'avantage dont elles ont besoin pour se rétablir, sans toutefois les endommager au point qu'elles soient incapables de survivre. Ce sont là les grandes variables, les variables majeures.