Un rapide à haut débit Méthode de cartographie ribonucléoprotéines (RNP) sur l'homme pré-ARNm

Pour cartographier les sites de fixation des protéines ribonucléaires sur les ARN pré-messagers, commencez par recouvrir la région désignée de l'ARN pré-messager d'intérêt avec des fenêtres de 30 nucléotides et synthétisez les oligos en mosaïque sur une matrice. Les oligos sont éliminés par ébullition de la matrice puis co-précipités avec un RNP d'intérêt. Le pool initial total est marqué avec SCI trois et le pool lié est marqué avec SCI cinq ; les deux sont ensuite appliqués sur la matrice de détection.

Le réseau est ensuite analysé et un logiciel d'extraction des caractéristiques est utilisé pour interpréter les résultats. Sels. Bonjour, je suis Kate Watkins du laboratoire de Will Fair brother du département de biologie cellulaire et moléculaire de l'Université Brown. Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure rapide et peu coûteuse permettant de déterminer l'emplacement précis d'un complexe ARN-protéine sur un ARN pré-messager, en re-synthétisant l'ARN pré-messager sous forme d'un pool d'oligonucléotides chevauchants.

Ce pool peut ensuite être séparé en une fraction liée et une fraction non liée par co-immunoprécipitation, puis analysé par une puces à ADN. Bien que cette procédure ait de nombreuses applications, nous l'utilisons pour étudier plusieurs facteurs d'épissage et leur rôle dans l'épissage alternatif. Commençons donc.

Pour commencer cette procédure, utilisez le navigateur génomique uc SC afin de télécharger des gènes spécifiques, des jonctions d'épissage ou d'autres régions d'intérêt à partir desquelles concevoir le pool de pré-ARNm. Sélectionnez les fenêtres d'intérêt, puis recouvrez-les de manière calculatoire avec une longueur de lecture de 30 nucléotides et un chevauchement de 20 nucléotides, de sorte que chaque oligonucléotide soit décalé de 10 nucléotides par rapport au précédent. Une fois les oligonucléotides définis sur une longueur de 30 nucléotides, flanquez chacun d'entre eux par des séquences amorce universelles.

Soumettez les oligos à Agilent pour impression sur une matrice de microciblages d'oligonucléotides personnalisée. Une fois la matrice reçue, commencez à récupérer les oligos d'ADN à partir de sa surface en plaçant la lame de couverture de la matrice dans une chambre d'hybridation et en pipetant délicatement 500 microlitres d'eau déionisée sur la lame. Placez la lame de la matrice face vers le bas, au-dessus de la lame de couverture, de sorte que les étiquettes de chaque lame soient face à face, en prenant soin d'éviter les bulles d'air qui pourraient perturber le processus de récupération des oligos.

Fermez la chambre d'hybridation et faites-la tourner toute la nuit à 99 degrés Celsius dans un four d'hybridation. Le jour suivant, retirez soigneusement la matrice de la chambre et éliminez l'eau, qui contient désormais les oligonucléotides libérés de la surface de la matrice. Placez le pool d'oligonucléotides libérés dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre et soniquez pour briser les éventuels agrégats à 50 % d'amplitude, trois fois, avec des impulsions de trois à cinq secondes chacune. Ensuite, amplifiez le pool par PCR à faible nombre de cycles en utilisant des amorces universelles dotées d'un promoteur T ajouté à leur extrémité.

Le nombre de cycles requis peut varier selon l'efficacité de la récupération des oligonucléotides. Évitez une amplification excessive, qui se manifeste par une bande floue sur un gel d'acrylamide. Enfin, utilisez le kit de transcription d'ARN Mega Short Script d'Amon.

Terminer la réaction de transcription par une extraction de l'ARN au chloroforme phénylique, suivie d'une précipitation à l'éthanol en utilisant de l'acétate de sodium et du glyco bleu comme agent porteur. Resuspendre le culot d'ARN dans 105 microlitres de tampon TE. Pour déterminer précisément la concentration de l'ARN.

Utilisez le Ribogreen pour générer une courbe standard. Ensuite, effectuez la mesure à l'aide d'un lecteur de plaque à fluorescence. Le pool d'ARN est désormais prêt pour une co-immunoprécipitation afin de commencer la récupération.

Tout d'abord, préparez les billes magnétiques en mélangeant des billes Dyna contenant la protéine A et la protéine G selon un rapport de un pour un, pour un volume final de 50 µL par réaction. Concentrez les billes en un seul endroit à l’aide d’un support de séparation magnétique afin d’éliminer le surnageant. Ensuite, effectuez deux lavages avec un volume égal de PBS 1X froid après le deuxième lavage.

Resuspendez les billes dans un volume égal de PBS 1× froid et ajoutez deux nanogrammes d'anticorps par réaction. Cette quantité peut varier selon l'anticorps utilisé ; des expériences peuvent donc être nécessaires pour déterminer les conditions optimales de liaison de l'anticorps aux billes. Incubez le mélange toute la nuit à quatre degrés Celsius sur une plateforme rotative.

Le matin, ajouter deux microgrammes par réaction d'ARN total de levure soniqué pour bloquer la liaison non spécifique et incuber en rotation pendant 30 minutes supplémentaires à quatre degrés Celsius. Une fois l'étape de blocage terminée, utiliser à nouveau le support magnétique pour éliminer le surnageant. Ensuite, laver les billes deux fois avec un millilitre froid de PBS 1X, en laissant le PBS du deuxième lavage dans le tube, puis aliquoter 50 microlitres du mélange de billes dans de nouveaux tubes.

Un tube pour chaque réaction de co-IP. Les billes sont désormais prêtes pour la co-IP. Ensuite, préparez le mélange maître en combinant le pool d'oligos d'ARN avec l'extrait nucléaire de cellules.

En tant que source d'ARNP, prélevez un aliquot de 50 microlitres du mélange maître comme échantillon total protégé. Des amorces, qui sont des versions ARN des amorces universelles, peuvent être ajoutées afin d'empêcher la liaison des protéines à la séquence d'amorce ou l'introduction d'une structure secondaire dans l'ARN. Pour démarrer la co-immunoprécipitation, retirez le surnageant des aliquots de billes et resuspendez les billes dans 120 microlitres du mélange maître restant. Agitez doucement les réactions à quatre degrés Celsius pendant une à deux heures.

À la fin de l'incubation, un petit volume d'Eloqua, incluant les billes, peut être prélevé de chaque co-immunoprécipitation. Pour des tests supplémentaires de l'efficacité ou de la spécificité de liaison, placer le reste des réactions sur l'aimant et retirer le surnageant. Procéder ensuite à un ou deux lavages avec du PDS 1X froid.

L'ARN lié à l'anticorps sur les billes par l'intermédiaire du RNP constitue l'échantillon d'IP. Re-suspendre les billes d'IP dans 50 microlitres de SDS 1 % dans un tampon XTE 0,1 X et incuber les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pour éluer l'ARN, prélever le surnageant, qui contient désormais l'ARN précédemment lié aux billes, puis purifier par extraction au phénol-chloroforme, suivie d'une précipitation à l'éthanol ; re-suspendre le culot dans 50 microlitres de tampon XT 0,1 X.

Ensuite, effectuez la transcription inverse des échantillons à l'aide des amorces universelles inverses. Amplifiez ensuite les échantillons par PCR avec les amorces universelles, dont l'une doit contenir un promoteur T7. Le nombre de cycles requis pour amplifier le pool dépendra de l'efficacité de la co-immunoprécipitation.

À l’aide du kit de script pour courtes séquences d’Ambion, transcrivez à nouveau les échantillons, mais cette fois ajoutez deux microlitres d’UTP d’acide aminé au lieu de l’UTP T7 fourni avec le kit. L’UTP d’acide aminé sera utilisé ultérieurement pour marquer l’ARN avec les side eyes. Une fois la transcription terminée.

Extraire les échantillons par chloroforme phénylé et précipiter avec de l'éthanol. N'utilisez pas de bleu glycogène ni d'acétate d'ammonium, car ils pourraient interférer avec l'hybridation des échantillons sur la matrice. Resuspendre le culot dans 4,5 microlitres de carbonate de sodium 0,1 molaire.

Pour étiqueter d'abord les échantillons, ajoutez 2,5 microlitres d'eau sans nucléase à l'échantillon total. Ajoutez trois microlitres de S3 à l'échantillon d'IP et trois microlitres de SCI cinq. Incubez à l'obscurité pendant une heure.

À température ambiante, arrêter la réaction en ajoutant six microlitres de chlorhydrate d'hydroxylamine 4 M à chaque échantillon, bien mélanger puis centrifuger. Incuber brièvement pendant 15 minutes à température ambiante, puis purifier les échantillons marqués par extraction au phénol-chloroforme, suivie d'une précipitation à l'éthanol. La majeure partie de la couleur est transférée dans la phase organique avec les nucléotides libres, de sorte que les culots peuvent ne pas être visiblement colorés.

Resuspendre chaque culot dans 50 microlitres de TE 0,1 X. Suivre les instructions du kit d'hybridation de puces Agilent pour préparer l'échantillon de puces, à l'exception suivante : ne pas fragmenter l'ARN. Après avoir ajouté le tampon de fragmentation, ajouter immédiatement le tampon d'hybridation afin d'interrompre la fragmentation.

Placez les échantillons sur la matrice et effectuez l'hybridation à 50 degrés Celsius pendant trois heures, la matrice étant en rotation. Préparez les solutions suivantes de 50 millilitres dans des tubes coniques de 50 millilitres : un tube de tampon SC en double excès, deux tubes de tampon de mer en simple excès et un tube d'eau déionisée.

Après une incubation de trois heures, desserrez soigneusement le dispositif en sandwich contenant la lame à puces et placez-le dans le tampon 2 XSSC. À l’aide d’une paire de pinces, séparez délicatement la puce de la lame de couverture.

Retirez délicatement la lame de couverture en prenant soin de ne pas toucher la matrice. Pendant que vous retirez la lame, fermez le tube conique et retournez-le doucement pendant 60 secondes. À l'aide de la pince, transférez la matrice dans la solution XSSC 1×.

Fermez le tube et retournez-le doucement pendant une minute. Transférez ensuite la lame dans la deuxième solution XSSC et retournez-la à nouveau doucement pendant une minute supplémentaire. Enfin, transférez la lame dans le tube d'eau déionisée et retournez-le doucement pendant 30 secondes.

Séchez la lame en plaçant ses bords sur une serviette en papier. Continuez à faire tourner la lame sur la serviette, en veillant à ne pas perturber le côté contenant les oligos. Placez la lame dans un tube conique vide et procédez au balayage de la lame.

Procédez au balayage de la matrice. Voici une matrice représentative. Chaque caractéristique ou oligonucléotide est colorée soit en vert pour le pool total non enrichi, soit en rouge pour le pool enrichi par immunoprécipitation.

Le signal de chaque caractéristique est normalisé par rapport à l'intensité totale de ce canal. Le résultat final correspond au logarithme du rapport du canal rouge sur le canal vert. Pour chaque caractéristique de la matrice, le score moyen à chaque coordonnée génomique est associé à l'emplacement donné.

Une illustration de cette étape de moyenne est donnée pour trois oligonucléotides de 30 nucléotides se chevauchant, ayant des scores de deux, quatre et 0,5, où le score moyen d'enrichissement pour chaque fenêtre de 10 nucléotides est indiqué. Voici un exemple de schéma de liaison de la protéine de liaison poly-périne PTB au niveau des caractéristiques du gène CLTA, présentées en bas, et les scores logarithmiques moyens d'enrichissement pour les fragments liés à la PTP sont représentés par des barres verticales rouge foncé. Les barres rose pâle indiquent les régions non enrichies pour la liaison à la PTP.

J'ai juste montré comment créer rapidement et efficacement un pool d'oligonucléotides recouvrant des régions d'intérêt, telles que des exons alternativement épissés. Nous analysons nos pools par puces à ADN, mais il est également possible de les séquencer soit par séquençage Illumina, soit par séquençage Sanger plus traditionnel. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que la création du pool peut être modifiée au niveau de l'ARN ou au niveau protéique.

Au niveau de l'ARN, nous pouvons introduire des régions autologues, des mutations pathologiques, des polymorphismes ou des mutations aléatoires dans la séquence d'oligonucléotides. Au niveau protéique, le facteur de liaison à l'ARN peut être modifié par phosphorylation ou d'autres modifications post-traductionnelles. De plus, l'environnement de liaison peut être manipulé afin d'augmenter ou de diminuer les concentrations de facteurs supplémentaires qui entrent en compétition avec la protéine de liaison à l'ARN d'intérêt ou interagissent avec celle-ci.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.