Un rapide à haut débit Méthode de cartographie ribonucléoprotéines (RNP) sur l'homme pré-ARNm

Pour cartographier les sites de liaison des protéines nucléaires ribo sur les pré-ARNm, commencez par pavage à travers la région désignée du NNA prem d’intérêt dans 30 fenêtres nucléotidiques et synthétisez les oligos en mosaïque sur un réseau. Les oligonucléotides sont bouillis du réseau et précipités avec un RNP d’intérêt. Le pool de départ total est étiqueté avec SCI trois et le pool lié est étiqueté avec SCI cinq, et les deux sont appliqués au tableau de détection.

Le réseau est ensuite scanné et le logiciel d’extraction de caractéristiques est utilisé pour interpréter les résultats. Sels. Bonjour, je suis Kate Watkins du laboratoire du frère de Will Fair au département MCB de l’Université Brown. Aujourd’hui, je vais vous montrer une procédure rapide et peu coûteuse pour déterminer l’emplacement précis d’un complexe protéique d’ARN sur Prem RA en laboratoire, resynthétiser Prem A comme un pool d’oligonucléotides chevauchants.

Ce pool peut ensuite être séparé en une fraction liée et une fraction non liée par co-immunoprécipitation, puis analysé par une puce à ADN. Bien que cette procédure ait de nombreuses applications, nous l’utilisons pour étudier plusieurs facteurs d’épissage et leur rôle et l’épissage alternatif. Alors commençons.

Pour commencer cette procédure, utilisez le navigateur de génome uc SC pour télécharger des gènes particuliers, des jonctions d’épissage ou d’autres zones d’intérêt à partir desquelles concevoir le pool prem A. Sélectionnez les fenêtres qui vous intéressent, puis parcourez-les de manière computationnelle avec une longueur de lecture de 30 nucléotides et un chevauchement de 20 nucléotides de sorte que chaque oligo soit décalé de 10 nucléotides par rapport au précédent. Maintenant que les 30 oligos longs nucléotidiques sont définis en flanc, chacun avec des séquences d’amorces universelles.

Soumettez les oligonucléotides à Agilent pour impression sur une puce à oligonucléotides personnalisée. Une fois que la puce arrive, commencez à récupérer les oligonucléotides d’ADN de sa surface en plaçant la lame de couverture de la matrice dans une chambre d’hybridation de matrice et en pipetant doucement 500 microlitres d’eau déminéralisée sur la lame. Placez la lame de la micropuce face vers le bas sur la lame de couverture de manière à ce que les étiquettes de chaque lame se fassent face et veillez à éviter les bulles d’air qui peuvent perturber le processus de récupération des oligo-éléments.

Fermez la chambre d’hybridation et faites-la pivoter pendant la nuit à 99 degrés Celsius dans un four d’hybridation Le lendemain, retirez soigneusement le réseau de la chambre et retirez l’eau, qui contient maintenant les oligos libérés de la surface du réseau. Placez le pool d’oligo libéré dans un tube einor de 1,5 millilitre et sonicate pour briser les amas potentiels à 50 % d’amplitude trois fois pendant des impulsions de trois à cinq secondes à chaque fois. Ensuite, amplifiez le pool par PCR à cycle faible à l’aide d’amorces universelles avec un promoteur T ajouté à leur extrémité.

Le nombre de cycles requis peut varier en fonction de l’efficacité de la récupération des oligo-éléments. Évitez de trop amplifier, qui est visible sous la forme d’une bande tachée sur un gel d’acrylamide. Enfin, utilisez le kit de script mega short d’Amon pour transcrire l’ARN.

Terminez la réaction de transcription par l’extraction de l’ARN par le phényl chloroforme, suivie d’une précipitation à l’éthanol à l’aide d’acétate de sodium et de glyco bleu comme support. Resus suspend la pastille d’ARN dans 105 microlitres de tampon TE. Pour déterminer avec précision la concentration de l’ARN.

Utilisez le vert ribo pour générer une courbe standard. Mesurez ensuite à l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence. Le pool d’ARN est maintenant prêt pour la co-immunoprécipitation afin de commencer le retrait.

Tout d’abord, préparez les billes magnétiques en combinant des billes de dyna de protéine A et de protéine G dans un rapport de un à un pour un volume final de 50 microlitres par réaction. Concentrez les billes en un seul endroit à l’aide d’un support de séparation magnétique afin d’éliminer le surnageant. Ensuite, lavez deux fois avec un volume égal de froid un XPBS après le deuxième lavage.

Resus, suspendez les billes dans un volume égal de XPBS froid et ajoutez deux nanogrammes de l’anticorps périon. Cette quantité peut varier en fonction de l’anticorps, de sorte que des expériences peuvent être nécessaires pour trouver les conditions optimales pour lier l’anticorps aux billes. Incuber le mélange pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur une plate-forme rotative.

Le matin, ajoutez deux microgrammes par réaction d’ARN total de levure soniquée pour bloquer la liaison non spécifique et tournez pendant 30 minutes supplémentaires à quatre degrés Celsius. Une fois l’étape de blocage terminée, utilisez à nouveau la grille magnétique pour retirer le surnageant. Ensuite, lavez les billes deux fois avec une à froid XPBS en laissant le PBS du deuxième lavage dans le tube aliquote 50 microlitres du mélange de billes dans de nouveaux tubes.

Un tube pour chaque réaction co-IP. Les perles sont maintenant prêtes pour la co-ip. Ensuite, préparez le mélange maître en combinant le pool d’oligo-ARN avec de l’extrait de cellule nucléaire.

En tant que source RNP, prenez une aliquote de 50 microlitres du mélange maître comme protection totale de l’échantillon Les amorces, qui sont des versions ARN des amorces universelles, peuvent être ajoutées pour empêcher la liaison des protéines à la séquence d’amorces ou l’introduction d’une structure secondaire à l’ARN. Pour démarrer la co-immunoprécipitation, retirez le surnageant des aliquotes de billes et remettez les billes en suspension dans 120 microlitres du mélange maître restant. Secouez les réactions à quatre degrés Celsius pendant une à deux heures.

À la fin de l’incubation, un petit Eloqua, y compris les billes, peut être retiré de chaque co-ip. Pour un test supplémentaire de l’efficacité de liaison ou de la spécificité, placez le reste des réactions sur l’aimant et retirez le surnageant. Suivi d’un à deux lavages avec un à froid XPDS.

L’ARN lié à l’anticorps sur les billes par le biais du RNP est l’échantillon IP. Remettre en suspension les billes IP dans 50 microlitres de 1 % SDS dans un tampon 0.1 XTE et chauffer les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pour éluer l’ARN, retirer le surnageant, qui contient maintenant l’ARN qui était auparavant lié aux billes et nettoyer par extraction au phényl chloroforme, suivie d’une précipitation à l’éthanol, remettre la pastille en suspension dans 50 microlitres de tampon 0,1 XT.

Ensuite, transcrivez les échantillons à l’aide des amorces universelles inversées. Ensuite, la PCR amplifie les échantillons avec les amorces universelles, dont l’une doit contenir un promoteur T sept. Le nombre de cycles nécessaires pour amplifier le pool dépendra de l’efficacité de la co-ip.

À l’aide du kit de script mega shorts d’ambion, transcrivez à nouveau les échantillons, mais cette fois ajoutez deux microlitres d’allèle aminé UTP au lieu des sept UTP T fournis avec le kit. L’allèle aminé UTP sera utilisé plus tard pour marquer l’ARN avec les yeux latéraux. Lorsque la transcription est terminée.

L’extrait de phénylchloroforme et l’éthanol précipitent les échantillons. N’utilisez pas de glyco-bleu ou d’acétate d’ammonium, qui pourraient interférer avec l’hybridation des échantillons à la matrice. Resus suspend le granulé dans 4,5 microlitres de carbonate de sodium 0,1 molaire.

Pour étiqueter les échantillons en premier, ajoutez 2,5 microlitres d’eau sans nucléases à l’échantillon total. Ajouter trois microlitres de S3 et à l’échantillon IP à trois microlitres de SCI cinq. Incuber dans l’obscurité pendant une heure.

À température ambiante, terminez la réaction en ajoutant six microlitres de quatre molaires d’hydroxyl lamine HCL à chaque échantillon, mélangez soigneusement et essorez. Incuber brièvement pendant 15 minutes À température ambiante, purifier les échantillons marqués par extraction au phényl chloroforme, suivie d’une précipitation à l’éthanol. La majeure partie de la couleur est tirée vers le bas dans la phase organique avec les nucléotides libres, de sorte que les granulés peuvent ne pas être visiblement colorés.

Resus suspend chaque granulé dans 50 microlitres de 0,1 XTE. Suivez les instructions du kit d’hybridation de puce Agilent pour préparer l’échantillon de puce à ADN avec l’exception suivante. Ne pas fragmenter l’ARN Après avoir ajouté le tampon de fragmentation, ajoutez immédiatement le tampon d’hybridation afin d’arrêter la fragmentation.

Placez les échantillons sur le réseau et hybridez-les à 50 degrés Celsius pendant trois heures pendant que le réseau tourne. Préparez les solutions suivantes de 50 millilitres dans des tubes coniques de 50 millilitres. Un tube de deux tampons SC en excès, deux tubes d’un tampon de mer en excès et un tube d’eau déminéralisée.

Après l’incubation de trois heures, débrouillez soigneusement le sandwich de lames du réseau et placez-le dans les deux tampons XSSC. À l’aide d’une pince à épiler. Séparez délicatement le tableau de la glissière de couverture.

Retirez délicatement la glissière du couvercle, en prenant soin de ne pas toucher le réseau. Lorsque la glissière est retirée, fermez le cône et retournez-le doucement pendant 60 secondes. À l’aide de la pince à épiler, transférez la matrice vers la solution XSSC.

Fermez le tube et retournez-le doucement pendant une minute. Transférez ensuite le réseau dans la seconde solution XSSC et à nouveau, inversez doucement pendant une autre minute. Enfin, transférez le réseau dans le tube d’eau déminéralisée et inversez doucement pendant 30 secondes.

Séchez le tableau en plaçant les bords de la lame sur une lingette kim. Continuez à faire pivoter le réseau sur la lingette, en veillant à ne pas perturber le côté contenant les oligos. Placez le réseau dans un tube conique vide et procédez au balayage du réseau.

Procédez au balayage de la matrice. Voici un tableau représentatif. Chaque caractéristique ou oligo est coloré en vert pour le pool non enrichi total ou en rouge pour le pool enrichi en IP.

Le signal à chaque caractéristique est normalisé à l’intensité totale à ce canal. Le résultat final est le rapport logarithmique du canal rouge sur le canal vert. Pour chaque caractéristique du réseau, le score moyen à chaque coordonnée génomique est cartographié à l’emplacement donné.

Une illustration de cette étape de calcul de la moyenne est donnée pour trois oligos nucléotidiques superposés avec des scores de deux, quatre et 0,5, où le score d’enrichissement moyen pour chaque fenêtre de 10 nucléotides est indiqué. Voici un exemple de schéma de liaison pour la protéine de liaison polypérine suivie PTB au niveau du gène CLTA : les caractéristiques du gène sont données le long du fond et les scores moyens d’enrichissement logarithmique pour le S lié au PTP sont représentés par des barres verticales rouge foncé. Les barres rouge clair indiquent les zones non enrichies pour la liaison PTP.

Je viens de vous montrer comment créer rapidement et efficacement un pool d’oligonucléotides qui s’étend sur des régions d’intérêt, telles que des axones découpés alternativement. Nous analysons nos piscines par microarray, mais il est également possible de les séquencer soit par un séquençage illumineux, soit par séquençage Lexi, soit par séquençage Sanger plus traditionnel. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que la création du pool est ouverte à la modification au niveau de l’ARN ou de la protéine.

Au niveau de l’ARN, nous pouvons introduire des régions autologues, des mutations de maladie, des polymorphismes ou des mutations aléatoires dans la séquence oligonucléotidique. Au niveau protéique, le facteur de liaison à l’ARN peut être modifié par phosphorylation ou d’autres modifications post-traductionnelles. De plus, l’environnement de liaison peut être manipulé pour augmenter ou diminuer les niveaux de facteurs supplémentaires qui entrent en compétition ou interagissent avec la protéine de liaison à l’ARN d’intérêt.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.