Name: Un rapide à haut débit Méthode de cartographie ribonucléoprotéines (RNP) sur lhomme pré-ARNm (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-02T15:46:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Découvrez une méthode in vitro rapide pour cartographier les sites de liaison des ribonucléoprotéines sur les pré-ARNm humains. Cette approche utilise des oligonucléotides chevauchants et évite les biais de co-IP traditionnels.

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Lorsque vous effectuez cette procédure il est important de se rappeler que la création de la piscine est flexible et ouverte à la modification que ce soit au niveau de l&#39;ARN ou de protéines. Au niveau de l&#39;ARN régions orthologues, les mutations des maladies, des polymorphismes ou des mutations aléatoires peuvent être introduites dans la séquence oligonucléotidique. Au niveau protéique de l&#39;ARN facteur de liaison peut être modifiée par phosphorylation ou d&#39;autres modifications post traductionnelles. De pl...

un rapide à haut débit méthode de cartographie ribonucléoprotéines (rnp) sur l&#39;homme pré-arnm

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Séquençage ARN que la co-immunoprécipitation (co-IP) avec protéines liant l&#39;ARN a amélioré notre compréhension de l&#39;épissage en démontrant que l&#39;emplacement contraignante influence souvent fonction d&#39;un facteur d&#39;épissage. Cependant, comme toute stratégie d&#39;échantillonnage les chances d&#39;identifier un ARN lié à un facteur d&#39;épissage est proportionnelle à son abondance cellulaire. Nous avons développé une nouvelle approche in vitro pour l&#39;arpentage spécificité de liaison sur les autres transitoires pré-ARNm. Cette approche utilise un bassin spécialement conçu oligonucléotidiques que les carreaux dans les introns, des exons, jonctions d&#39;épissage, ou d&#39;autres pré-ARNm. La piscine est soumis à une sorte de sélection moléculaire. Ici, nous démontrons la méthode par séparation des oligonucléotides en une fraction liée et non liée et d&#39;utiliser une stratégie à deux couleurs ensemble pour enregistrer l&#39;enrichissement de chaque oligonucléotide dans la fraction liée. Les données du tableau génère cartes à haute résolution avec la possibilité d&#39;identifier des séquences spécifiques et structurelles des déterminants ribonucléoprotéines (RNP) liant pré-ARNm. Un avantage unique de cette méthode est sa capacité à éviter les biais d&#39;échantillonnage en direction ARNm associés à la PI et techniques actuelles SELEX, comme la piscine est spécifiquement conçu et synthétisé à partir de pré-ARNm séquence. La flexibilité de la piscine oligonucléotide est un autre avantage puisque l&#39;expérimentateur choisit les régions à l&#39;étude et la tuile à travers, en adaptant la piscine à leurs besoins individuels. En utilisant cette technique, on peut doser l&#39;effet des polymorphismes ou des mutations sur la liaison à grande échelle ou d&#39;un clone de la bibliothèque dans une journaliste épissage fonctionnels et d&#39;identifier des oligonucléotides qui sont enrichis dans la fraction incluse. Ce roman in vitro de haute résolution schéma de mappage offre un moyen unique d&#39;étudier les interactions avec les RNP transitoires pré-ARNm espèces, dont la faible abondance les rend difficiles à étudier avec cours techniques in vivo.

En raison de la nature transitoire de pré-ARNm, il peut être difficile d&#39;isoler et d&#39;étudier<em&gt; In vivo</em&gt;. Ici, nous présentons un roman<em&gt; In vitro</em&gt; Approche pour étudier les interactions ARN-protéine en utilisant un pool de synthèse oligo que les carreaux de toutes les régions sélectionnées du pré-ARNm.

Un rapide à haut débit Méthode de cartographie ribonucléoprotéines (RNP) sur l&#39;homme pré-ARNm

Le séquençage des ARN qui co-immunoprécipitent (co-IP) avec des protéines de liaison à l'ARN a permis d'approfondir notre compréhension de l'épissage en démontrant que la liaison...

Pour cartographier les sites de fixation des protéines ribonucléaires sur les ARN pré-messagers, commencez par couvrir la région désignée de l'ARN pré-messager d'intérêt à l'aide de fenêtres de 30 nucléotides et synthétisez les oligos en mosaïque sur une matrice. Les oligos sont éliminés par ébullition de la matrice puis co-précipités avec un RNP d'intérêt. Le pool initial total est marqué avec SCI trois et le pool lié est marqué avec SCI cinq ; les deux sont ensuite appliqués sur la matrice de détection.Le réseau est ensuite analysé et un logiciel d'extraction des caractéristiques est utilisé pour interpréter les résultats. Sels. Bonjour, je suis Kate Watkins du laboratoire de Will Fair brother du département de biologie cellulaire et moléculaire de l'Université Brown. Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure rapide et peu coûteuse permettant de déterminer l'emplacement précis d'un complexe ARN-protéine sur un ARN pré-messager en laboratoire, en re-synthétisant l'ARN pré-messager sous forme d'un pool d'oligonucléotides chevauchants.Ce pool peut ensuite être séparé en une fraction liée et une fraction non liée par co-immunoprécipitation, puis analysé par une puces à ADN. Bien que cette procédure ait de nombreuses applications, nous l'utilisons pour étudier plusieurs facteurs d'épissage et leur rôle dans l'épissage alternatif. Commençons donc.Pour commencer cette procédure, utilisez le navigateur génomique uc SC afin de télécharger des gènes spécifiques, des jonctions d'épissage ou d'autres régions d'intérêt à partir desquelles concevoir le pool de pré-ARNm. Sélectionnez les fenêtres d'intérêt, puis recouvrez-les de manière calculatoire avec une longueur de lecture de 30 nucléotides et un chevauchement de 20 nucléotides, de sorte que chaque oligonucléotide soit décalé de 10 nucléotides par rapport au précédent. Une fois les oligonucléotides définis sur une longueur de 30 nucléotides, flanquez chacun d'entre eux par des séquences amorce universelles.Soumettez les oligos à Agilent pour impression sur une matrice de microciblages d'oligonucléotides personnalisée. Une fois la matrice reçue, commencez à récupérer les oligos d'ADN à partir de sa surface en plaçant la lame de couverture de la matrice dans une chambre d'hybridation et en pipetant délicatement 500 microlitres d'eau déionisée sur la lame. Placez la lame de la matrice face vers le bas, au-dessus de la lame de couverture, de sorte que les étiquettes de chaque lame soient face à face, en prenant soin d'éviter les bulles d'air qui pourraient perturber le processus de récupération des oligos.Fermez la chambre d'hybridation et faites-la tourner toute la nuit à 99 degrés Celsius dans un four d'hybridation. Le jour suivant, retirez soigneusement la matrice de la chambre et éliminez l'eau, qui contient désormais les oligonucléotides libérés de la surface de la matrice. Placez le pool d'oligonucléotides libérés dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre et soniquez pour briser les éventuels agrégats à 50 % d'amplitude, trois fois, avec des impulsions de trois à cinq secondes chacune. Ensuite, amplifiez le pool par PCR à faible nombre de cycles en utilisant des amorces universelles comportant un promoteur T ajouté à leur extrémité.Le nombre de cycles requis peut varier selon l'efficacité de la récupération des oligonucléotides. Évitez une amplification excessive, qui se manifeste par une bande floue sur un gel d'acrylamide. Enfin, utilisez le kit Mega Short Script d'Amon pour la transcription de l'ARN.Arrêter la réaction de transcription par une extraction au chloroforme phénylique de l'ARN, suivie d'une précipitation à l'éthanol en utilisant de l'acétate de sodium et du glyco bleu comme agent porteur. Resuspendre le culot d'ARN dans 105 microlitres de tampon TE. Pour déterminer précisément la concentration de l'ARN.Utilisez le Ribogreen pour générer une courbe standard. Ensuite, effectuez la mesure à l'aide d'un lecteur de plaque à fluorescence. Le pool d'ARN est désormais prêt pour une co-immunoprécipitation afin de commencer la récupération.Tout d'abord, préparez les billes magnétiques en mélangeant des billes Dyna contenant la protéine A et la protéine G selon un rapport de un pour un, pour un volume final de 50 microlitres par réaction. Concentrez les billes en un seul endroit à l’aide d’un support de séparation magnétique afin d’éliminer le surnageant. Ensuite, effectuez deux lavages avec un volume égal de PBS 1X froid après le deuxième lavage.Resuspendez les billes dans un volume égal de PBS 1× froid et ajoutez deux nanogrammes d'anticorps par réaction. Cette quantité peut varier selon l'anticorps utilisé ; des expériences préliminaires peuvent donc être nécessaires pour déterminer les conditions optimales de liaison de l'anticorps aux billes. Incubez le mélange toute la nuit à quatre degrés Celsius sur une plateforme rotative.Le matin, ajouter deux microgrammes par réaction d'ARN total de levure soniqué pour bloquer la liaison non spécifique et incuber en rotation pendant 30 minutes supplémentaires à quatre degrés Celsius. Une fois l'étape de blocage terminée, utiliser à nouveau le support magnétique pour éliminer le surnageant. Puis laver les billes deux fois avec du PBS 1X froid, en laissant le PBS du deuxième lavage dans le tube, et aliquoter 50 microlitres du mélange de billes dans de nouveaux tubes.Un tube pour chaque réaction de co-IP. Les billes sont désormais prêtes pour la co-IP. Ensuite, préparez le mélange maître en combinant le pool d'oligos d'ARN avec l'extrait nucléaire de cellules.En tant que source d'ARNP, prélevez un aliquot de 50 microlitres du mélange maître comme échantillon total. Des amorces de protection, qui sont des versions ARN des amorces universelles, peuvent être ajoutées afin d'empêcher la liaison des protéines à la séquence d'amorce ou l'introduction d'une structure secondaire dans l'ARN. Pour démarrer la co-immunoprécipitation, retirez le surnageant des aliquots de billes et resuspendez les billes dans 120 microlitres du mélange maître restant. Agitez doucement les réactions à quatre degrés Celsius pendant une à deux heures.À la fin de l'incubation, un petit volume d'Eloqua, incluant les billes, peut être prélevé dans chaque immunoprécipitation. Pour des tests supplémentaires de l'efficacité ou de la spécificité de liaison, placer le reste des réactions sur l'aimant et retirer le surnageant. Procéder ensuite à un ou deux lavages avec du XPDS froid.L'ARN lié à l'anticorps sur les billes par l'intermédiaire du RNP constitue l'échantillon d'IP. Re-suspendre les billes d'IP dans 50 microlitres de SDS 1 % dans un tampon XTE 0,1 X et chauffer les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pour éluer l'ARN, prélever le surnageant, qui contient désormais l'ARN précédemment lié aux billes, puis purifier par extraction au phénol-chloroforme, suivie d'une précipitation à l'éthanol ; re-suspendre le culot dans 50 microlitres de tampon XT 0,1 X.Ensuite, effectuez la transcription inverse des échantillons à l'aide des amorces universelles inverses. Amplifiez ensuite les échantillons par PCR avec les amorces universelles, dont l'une doit contenir un promoteur T7. Le nombre de cycles requis pour amplifier le pool dépendra de l'efficacité de la co-immunoprécipitation.À l'aide du kit de script pour mega shorts d'ambion, transcrivez à nouveau les échantillons, mais cette fois ajoutez deux microlitres d'UTP amino allyle au lieu de l'UTP T7 fourni avec le kit. L'UTP amino allyle sera utilisé ultérieurement pour marquer l'ARN avec les side eyes. Une fois la transcription terminée.Extraire les échantillons par du chloroforme phénylé et précipiter avec de l'éthanol. N'utilisez pas de bleu glycogène ni d'acétate d'ammonium, car ils pourraient interférer avec l'hybridation des échantillons sur la matrice. Resuspendre le culot dans 4,5 microlitres de carbonate de sodium 0,1 molaire.Pour étiqueter d'abord les échantillons, ajoutez 2,5 microlitres d'eau sans nucléase à l'échantillon total. Ajoutez trois microlitres de S3 à l'échantillon d'IP et trois microlitres de SCI cinq. Incubez à l'obscurité pendant une heure.À température ambiante, arrêter la réaction en ajoutant six microlitres de chlorhydrate d'hydroxylamine 4 M à chaque échantillon, bien mélanger puis centrifuger. Incuber brièvement pendant 15 minutes à température ambiante, puis purifier les échantillons marqués par extraction au phénol-chloroforme, suivie d'une précipitation à l'éthanol. La majeure partie de la couleur est transférée dans la phase organique avec les nucléotides libres, de sorte que les culots peuvent ne pas être visiblement colorés.Resuspendre chaque culot dans 50 microlitres de TE 0,1 X. Suivre les instructions du kit d'hybridation de puces Agilent pour préparer l'échantillon de puces à ADN, à l'exception suivante. Ne pas fragmenter l'ARN ; après avoir ajouté le tampon de fragmentation, ajouter immédiatement le tampon d'hybridation afin d'arrêter la fragmentation.Placez les échantillons sur la matrice et effectuez l'hybridation à 50 degrés Celsius pendant trois heures, la matrice étant en rotation. Préparez les solutions suivantes de 50 millilitres dans des tubes coniques de 50 millilitres : un tube de tampon SC en double excès, deux tubes de tampon de mer en excès simple et un tube d'eau déionisée.Après une incubation de trois heures, desserrez délicatement le sandwich de la lame porteuse et placez-le dans le tampon 2XSSC. À l’aide d’une paire de pinces, séparez doucement la matrice de la lame de couverture.Retirez délicatement la lame de couverture en prenant soin de ne pas toucher la matrice. Lorsque la lame est extraite, fermez le tube conique et retournez-le doucement pendant 60 secondes. À l'aide de la pince, transférez la matrice dans la solution XSSC 1×.Fermez le tube et retournez-le doucement pendant une minute. Ensuite, transférez le réseau dans la seconde solution XSSC et retournez-le à nouveau doucement pendant une minute supplémentaire. Enfin, transférez le réseau dans le tube d'eau déionisée et retournez-le doucement pendant 30 secondes.Asséchez la matrice en plaçant les bords de la lame sur un essuie-tout. Continuez à faire pivoter la matrice sur l'essuie-tout, en veillant à ne pas perturber le côté contenant les oligos. Placez la matrice dans un tube conique vide et procédez au balayage de la matrice.Procédez au balayage de la matrice. Voici une matrice représentative. Chaque caractéristique ou oligonucléotide est colorée soit en vert pour le pool total non enrichi, soit en rouge pour le pool enrichi par immunoprécipitation.Le signal de chaque caractéristique est normalisé par rapport à l'intensité totale de ce canal. Le résultat final correspond au logarithme du rapport du canal rouge sur le canal vert. Pour chaque caractéristique de la matrice, le score moyen à chaque coordonnée génomique est associé à l'emplacement donné.Une illustration de cette étape de moyenne est donnée pour trois oligonucléotides de 30 nucléotides se chevauchant, ayant des scores de deux, quatre et 0,5, où le score moyen d'enrichissement pour chaque fenêtre de 10 nucléotides est indiqué. Voici un exemple de schéma de liaison de la protéine de liaison aux régions poly-périnéales PTB au niveau des caractéristiques du gène CLTA, présentées en bas, et les scores logarithmiques moyens d'enrichissement pour les fragments liés à la PTP sont représentés par des barres verticales rouges foncé. Les barres roses indiquent les régions non enrichies pour la liaison à la PTP.J'ai juste montré comment créer rapidement et efficacement un pool d'oligonucléotides recouvrant des régions d'intérêt, telles que des exons alternativement épissés. Nous analysons nos pools par puces à ADN, mais il est également possible de les séquencer soit par séquençage Illumina, soit par séquençage Sanger plus traditionnel. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler que la création du pool peut être modifiée au niveau de l'ARN ou de la protéine.Au niveau de l'ARN, nous pouvons introduire des régions autologues, des mutations pathologiques, des polymorphismes ou des mutations aléatoires dans la séquence d'oligonucléotides. Au niveau protéique, le facteur de liaison à l'ARN peut être modifié par phosphorylation ou d'autres modifications post-traductionnelles. De plus, l'environnement de liaison peut être modifié afin d'augmenter ou de diminuer les concentrations de facteurs supplémentaires qui entrent en compétition avec la protéine de liaison à l'ARN d'intérêt ou interagissent avec celle-ci.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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