Enregistrement optique de l'activité électrique en Guinée-cochon Réseaux entérique en utilisant la tension colorants sensibles

Ce vidéo montre la dissection et l'imagerie ultérieure de préparations du système nerveux entérique stimulées électriquement, en utilisant le colorant sensible au voltage natal styryl D four A-N-E-P-P-D-H-Q. Un petit segment d'intestin est prélevé sur un cobaye euthanasié, puis disséqué afin d'exposer d'abord la sous-muqueuse, puis finalement le plexus myentérique pour des enregistrements optiques. Des électrodes sont placées sur un tissu monté préalablement coloré avec D for A-N-E-P-P-D-H-Q, après qu'une image initiale à haute résolution ait été capturée.

Les changements optiques indiquant une activité électrique sont enregistrés à l’aide de la caméra haute vitesse. Pendant l’acquisition haute vitesse, une stimulation électrique est appliquée. L’image haute résolution est ensuite superposée à la carte de pixels de la caméra haute vitesse pour l’analyse à l’aide de neuro plex.

Bonjour, je suis Brian Salzberg, directeur du Laboratoire d'optique cellulaire ou loco, comme nous aimons l'appeler, au sein du Département des neurosciences à l'Université de Pennsylvanie. Je m'appelle Analia Obide. Je fais également partie du laboratoire d'optique cellulaire.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'enregistrer l'activité électrique de réseaux neuronaux mammaliens intacts à l'aide de colorants sensibles aux potentiels. Nous utilisons cette procédure pour étudier la connectivité neuronale au sein et entre les deux réseaux qui composent le système nerveux entérique, également appelé le deuxième cerveau ou le cerveau de l'intestin. Commençons donc.

Commencez la préparation des plexus myentériques et sous-muqueux en excisant l'intestin grêle d'un cobaye Hartley de 150 à 200 grammes ou âgé de deux à trois semaines, anesthésié par inhalation d'isoflurane et ensuite décapité. Ensuite, retirez le contenu de l'intestin en rinçant la lumière avec une solution M1 99 DM chaude et oxygénée. Coupez un segment intestinal de huit à dix centimètres de longueur en veillant à préserver la polarité.

Transférez-le dans une boîte en verre de 10 centimètres recouverte de Sylgard® et contenant du milieu M199 à température ambiante. Placez la boîte sous un microscope stéréoscopique avec éclairage en fond noir. Ensuite, à l’aide de ciseaux, ouvrez le bord mésentérique et utilisez des épingles à insectes pour monter le segment intestinal, la muqueuse orientée vers le haut.

Il est extrêmement important de maintenir une tension uniforme afin que, après fixation, le tissu présente une forme rectangulaire avec les rangées de villosités muqueuses régulièrement alignées, en tenant de fines pinces Dumont à extrémités droites dans une position presque horizontale. Détacher la muqueuse en saisissant la villosité à une extrémité du segment intestinal et en tirant le long de l'axe longitudinal du tissu. Poursuivre la séparation de bandes de muqueuse pour exposer la sous-muqueuse contenant les ganglions sous-muqueux et le réseau vasculaire sous-muqueux.

Ensuite, à l’aide de ciseaux très fins, effectuez une incision dans la couche sous-muqueuse en suivant l’orientation des fibres musculaires circulaires. Puis, soulevez très délicatement la sous-muqueuse avec la pince fine tout en repoussant le muscle circulaire vers le bas à l’aide des ciseaux, et incisez le long des bords longitudinaux.

Libérez la sous-muqueuse du reste du prélèvement au fur et à mesure que la séparation progresse. Effectuez maintenant une deuxième incision en suivant l'orientation des fibres musculaires circulaires, à une distance de 1,5 à trois centimètres de la première, afin de définir la taille finale du prélèvement sous-muqueux ; le segment sous-muqueux obtenu mesure 30 à 50 micromètres d'épaisseur et présente un aspect diaphane. Transférez-le dans une autre boîte de culture Sylgard contenant du M1 99 DM frais et fixez-le délicatement, sans tension.

Ensuite, placer la boîte dans une chambre oxygénée à température ambiante pour une utilisation ultérieure. Le segment intestinal d'origine doit maintenant être dépourvu de muqueuse et de sous-muqueuse, et le muscle circulaire doit être exposé. Ce segment est désormais utilisé pour obtenir une préparation du plexus myentérique afin de mettre en évidence le plexus myentérique.

Éliminez autant que possible la couche musculaire circulaire en utilisant une pince fine à pointe droite pour retirer les faisceaux de fibres de chaque côté du prélèvement. Le plexus myentérique exposé ne peut pas être séparé de la couche musculaire longitudinale et du CI sous-jacent. Transférez le prélèvement de plexus myentérique vers une nouvelle boîte de Pétri revêtue de sard contenant du M1 99 M oxygéné. Épinglez ensuite légèrement l'échantillon contenant du muscle viable. Quelques minutes avant l'expérience optique, transférez le prélèvement vers une nouvelle boîte de Pétri plus petite, revêtue de sylgard et déjà remplie de M1 99 DM contenant deux micromoles de néfé pour prévenir la contraction musculaire, en le montant fermement en plaçant soigneusement plusieurs épingles très fines tout autour du périmètre.

Veillez à ce que la tension soit uniformément répartie et que le tissu repose complètement à plat contre le fond du garde-sil. Le prélèvement tissulaire est désormais prêt pour les expériences physiologiques. Préparez une solution stock de cinq à cinquante microgrammes par millilitre de DAI quatre A-N-E-P-P-D HQ dans du M1 99 M contenant deux micromoles de nifédipine dans un flacon en verre et recouvrez-le de papier d'aluminium.

L'éthanol provenant de la solution mère doit représenter moins de 0,5 % de la solution au M1 99 DM avec du nifédipine qui recouvrait la préparation, et doit être remplacé par la solution de colorant préparée. Utiliser un volume suffisant de la solution de colorant pour recouvrir complètement le tissu, puis incuber à température ambiante pendant 10 à 30 minutes. Après l'incubation, laver la préparation avec du M1 99 M supplémenté en NEFE et oxygéné, en remplaçant entièrement le contenu de la chambre.

L'enregistrement optique de l'activité neuronale dans des préparations stimulées électriquement est réalisé à l'aide d'un système composé d'un microscope à épifluorescence droit équipé d'un séparateur d'image, d'une caméra haute vitesse de faible résolution, d'une caméra noir et blanc haute résolution, d'un générateur de stimulus contrôlé par ordinateur et d'un micromanipulateur. L'ensemble de l'appareil est monté sur une table active d'isolation vibratoire et entouré de lourds rideaux acoustiques ainsi que d'un toit en Mylar afin de minimiser les vibrations aériennes. Bien que l'acquisition d'images à partir des deux caméras puisse être effectuée à l'aide d'un seul ordinateur exécutant simultanément Neuro Plex et Global Lab Image Two ou tout autre logiciel d'acquisition d'images, le dispositif présenté ici utilise deux ordinateurs, chacun contrôlant une caméra distincte, pour démarrer les expériences optiques.

Placer la chambre contenant l'échantillon coloré et fixé sur la platine du microscope. Étant donné que D four A et EPPD HQ est un colorant membranaire impermanent qui fluoresce uniquement en milieu lipidique, les neurones sains issus d'une préparation entérique colorée doivent présenter l'aspect de ballons vides à tout grossissement supérieur à 20 x lors de l'observation. Utiliser les filtres HQ 5 35 50 pour l'excitation, HQ 5 72 LP four pour l'émission et un miroir dichroïque de 5 65 nanomètres.

Ensuite, à l'aide des commandes du micromanipulateur, positionnez une électrode en matrice linéaire multibarillet à l'extrémité orale du tissu, en veillant à ce que l'électrode soit éloignée de l'objectif du microscope. Une matrice linéaire composée de 10 électrodes au tungstène réparties sur une longueur d'un centimètre permet d'exciter plusieurs voies neuronales indépendantes et convient bien à l'étude des circuits ganglionnaires interconnectés. Toutefois, pour les données représentatives, nous avons utilisé une électrode de stimulation maison à deux broches.

Utilisez de la cire adhésive pour placer une électrode de masse à l'extrémité opposée de la chambre avant d'effectuer un enregistrement fonctionnel, puis acquérez une image en noir et blanc à haute résolution de la région dont l'activité électrique sera enregistrée afin d'en faciliter la visualisation. Le contraste peut être inversé de manière à ce que la fluorescence apparaisse sombre. Pour appliquer une stimulation électrique à l'aide du générateur de stimuli contrôlé par ordinateur, programmez d'abord l'appareil en sélectionnant l'intensité, la durée, la fréquence et le nombre de stimuli appropriés, ainsi que le délai par rapport au début de l'acquisition des données optiques.

Pour s'assurer que la stimulation se produise dans les limites de l'acquisition optique des données, configurez le générateur de stimulus comme un dispositif commandé par Neuro Plex. Ensuite, réglez les paramètres d'acquisition dans Neuro Plex en indiquant la fréquence d'images, le nombre d'images et le gain de la caméra. Pour obtenir une définition complète d'un potentiel d'action, la fréquence d'images doit être réglée à un minimum d'un kilohertz.

Étant donné que D four A et E-P-P-G-H-Q présentent une diminution de la fluorescence lors de la dépolarisation qui est linéairement liée au changement de tension, inversez l'affichage des signaux optiques dans neuro plex afin que les potentiels d'action n'apparaissent pas à l'envers. Commencez l'acquisition. N'oubliez pas d'acquérir une nouvelle image en noir et blanc à haute résolution pour chaque champ observé avant d'effectuer chacun des enregistrements fonctionnels.

Une fois l'acquisition terminée, utilisez Neuro Plex pour analyser les résultats hors ligne. Une zone de l'écran appelée affichage de la page montre l'image brute du prélèvement telle qu'elle a été capturée par la caméra haute vitesse de 80 par 80 en tant qu'image individuelle. Lorsque le mode de page est défini sur image absolue superposée, l'image haute résolution acquise avec la seconde caméra est superposée à la carte de pixels de l'image brute à l'aide des commandes d'affichage de Neuro Plex.

Cela nécessite de modifier le mode de page de « trace absolue » à « traces » et de sélectionner une image superposée dans la commande d'affichage. Utilisez la souris pour sélectionner soit des pixels individuels, soit des groupes de pixels sur l'image affichée dans la fenêtre de page. Les signaux issus de ces régions d'intérêt apparaîtront sous forme de courbes dans la fenêtre d'affichage des traces, révélant l'amplitude des variations optiques enregistrées par ces pixels en fonction du temps.

L'inversion de l'échelle de gris dans l'image haute résolution améliore la visualisation sur l'affichage de la page en mode trace et il est fortement recommandé d'afficher une sortie analogique du stimulateur. Sélectionnez le canal de sortie analogique à inclure dans la fenêtre d'affichage des tracés. Cette sortie indique le moment précis des stimuli appliqués pendant l'expérience.

Pour visualiser les données sous forme de film, utilisez les commandes de lecture dans Neuro Plex afin d'afficher des images consécutives au sein d'un jeu de données, à l'aide d'échelles de couleurs pseudo-colorées ajustées aux variations maximales et minimales de l'intensité de fluorescence. Un ganglion issu d'une préparation de plexus myentérique, marqué avec DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q, a été imagé à l'aide d'une caméra haute résolution et d'un objectif 60 x. Pendant l'acquisition des données, la préparation a été stimulée par une série de cinq impulsions à 40 hertz.

Avec chaque impulsion ayant une amplitude de 15 milliampères et une durée de 0,5 milliseconde, quatre régions d’intérêt ou ROI ont été identifiées et des tracés ont été générés pour afficher les données optiques moyennées sur les régions sélectionnées dans la séquence d’images en fausses couleurs. Les premières régions de réponse optique correspondant à la dépolarisation membranaire, indiquant une activité neuronale, apparaissent en jaune à rouge. Ces données indiquent que l’activité induite par la stimulation EV se produit dans des régions bien délimitées de chaque ganglion, principalement véhiculée par des axones de passage. Les ROI deux, trois et quatre identifient des neurones individuels situés à différentes distances de la ROI un.

La figure deux illustre, à un grossissement de 10 x, les voies anatomiques empruntées par la propagation de l'information ; les flèches indiquent la direction suivie par le stimulus pour activer le ganglion myentérique identifié. Nous venons de vous présenter les composants d'un dispositif optique permettant l'enregistrement de l'activité électrique à l'aide de colorants sensibles au voltage, ainsi que la manière dont cette technologie, appliquée au système nerveux entérique, ouvre la possibilité d'étudier la connectivité fonctionnelle au sein et entre deux réseaux mammaliens intacts sous le champ du microscope. Lors de l'utilisation de la technologie d'enregistrement optique, l'attention portée aux détails est extrêmement importante.

Les sources de bruit, optiques, mécaniques et électriques, doivent être soigneusement contrôlées, et la santé du prélèvement doit être méticuleusement préservée. Ainsi, la maîtrise de chacune des étapes individuelles de ce protocole est essentielle pour réussir l'enregistrement optique. Voilà donc.

Merci beaucoup d'avoir regardé et bonne chance pour vos expériences.