Name: Enregistrement optique de lactivité électrique en Guinée-cochon Réseaux entérique en utilisant la tension colorants sensibles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-04T17:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Découvrez l'enregistrement optique de l'activité électrique dans les réseaux entériques du cobaye en utilisant des colorants sensibles à la tension. Cette méthode permet d'étudier la connectivité neuronale avec une résolution ajustable.

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Nous tenons à remercier DA Coulter (CHOP) pour nous avoir permis d&#39;utiliser ses deux photons microscope pour acquérir les images 2-photons montré au début de la vidéo, et H. Takano pour le partage avec nous son expertise technique.

<ol><li>Johnson, L. eonard R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCosta%2C+Marcello+%22in+Physiology+of+the+Gastrointestinal+Tract%2C+edited+by+Leonard+R%22">in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R</a>. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).</li>
<li>Obaid, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+activity+in+an+intact+mammalian+network+with+single-cell+resolution%3A+optical+studies+of+nicotinic+activity+in+an+enteric+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus.</a> J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).</li>
<li>Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+naphthylstyryl-pyridinium+potentiometric+dyes+offer+advantages+for+neural+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis.</a> J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).</li>
<li>Hirst, G. D., McKirdy, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+potentials+recorded+from+neurones+of+the+submucous+plexus+of+guinea-pig+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine.</a> J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).</li>
<li>Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Methods+in+Cellular+Neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Current Methods in Cellular Neurobiology.</a> Barker, J., McKelvy, J. , John Wiley and Sons, Inc. New York. 139-139 (1983).</li>
<li>Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-stable+non-coherent+light+source+for+optical+measurements+in+neuroscience+and+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).</li>
<li>Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+studies+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subtypes+in+the+guinea-pig+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system.</a> J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).</li>
<li>Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+with+single+cell+resolution+from+a+simple+mammalian+nervous+system%3A+Electrical+activity+in+ganglia+from+the+submucous+plexus+of+the+guinea-pig+ileum%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum.</a> Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).</li>
<li>Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+impulses+in+individual+neurones+of+an+invertebrate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system.</a> Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).</li>
</ol>

Ce protocole a été écrit avec deux objectifs en tête. Le premier est de convaincre d&#39;autres chercheurs qui, grâce à des nombreux progrès technologiques de la dernière décennie, l&#39;enregistrement optique de l&#39;activité électrique en utilisant la tension colorants sensibles est devenu l&#39;un des plus puissants, des méthodologies fiables et abordables pour étudier les réseaux neuronaux intacts; effet , il pourrait être facilement mis en œuvre, même dans un laboratoire disposant de ressources modestes. Le deuxiè...

<table><tbody><tr><td>Milieu 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3769</td><td>Avec sels d'Earle&amp;rsquo;s, sans L-glutamine, rouge de phénol et bicarbonate de sodium</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>Kit d'élastomère de silicone 184</td><td></td></tr><tr><td>Épingles pour insectes utilisées pour la dissection</td><td>F.S.T.</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Dumont</td><td>F.S.T.</td><td>11203-23 ou 11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Moria MC19/B Pascheff-Wolff</td><td>F.S.T.</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>Épingles pour maintenir le tissu pendant l'expérience</td><td>Seirin Corp.</td><td>Seirin Spinex</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0773</td><td></td></tr><tr><td>Protéase IX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6141</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>10439-016</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 100X</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Nifédipine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-4-ANEPPDHQ</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D36802</td><td></td></tr><tr><td>Générateur de stimulus à 4 canaux</td><td>Multi Channel System MCS GmbH</td><td>Série 2000</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Rainin</td><td>Dinamax RP-1 à 2 canaux</td><td></td></tr><tr><td>Caméra haute vitesse</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>Démagnificateur 1:10 / lentille de relais</td><td>Optem, Qioptiq Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope droit</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61TRF</td><td></td></tr><tr><td>Scène fixe Gibraltar avec translateur X-Y motorisé</td><td>Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Québec, Canada</td><td>PSSG--BX2</td><td></td></tr><tr><td>Électrodes matricielles linéaires</td><td>FHC, Inc.</td><td>Sur mesure</td><td></td></tr><tr><td>Table d'isolation active des vibrations</td><td>Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA</td><td>Micro 60</td><td></td></tr><tr><td>Alimentation stabilisée à rétroaction ultra-basse ondulation</td><td>Kepco, Flushing, NY</td><td>ATE 75-15M</td><td></td></tr><tr><td>Filtre thermique</td><td>Schott AG</td><td>KG-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d'interférence à haute qualité</td><td>Chroma Inc.</td><td>HQ530/50</td><td></td></tr><tr><td>Miroir dichroïque</td><td>Chroma Inc.</td><td>565 nm (transmission à 50 %)</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-haut</td><td>Chroma Inc.</td><td>HQ572LP</td><td></td></tr><tr><td>Rideaux acoustiques</td><td>Acoustical Surfaces, Inc.</td><td>BSC-25</td><td></td></tr><tr><td>Neuroplex</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDL</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD haute résolution, avec son propre contrôleur de caméra</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capturateur d'images pour caméra haute résolution</td><td>Data Translation</td><td>DT3120K-1</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d'imagerie pour caméra haute résolution</td><td>Data Translation</td><td>Global Lab Image/2</td><td></td></tr></tbody></table>

enregistrement optique de l&#39;activité électrique en guinée-cochon réseaux entérique en utilisant la tension colorants sensibles

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

Le système nerveux entérique (ENS) est un réseau autonome avec fonctions identifiées, capable de réaliser des comportements complexes dans l&#39;isolement. Ses neurones (10 à 25 um de diamètre) sont disposées en plexus qui se limitent à des plans distincts de la paroi intestinale<sup&gt; 1</sup&gt;, Le plexus myentérique peut être trouvé entre les couches musculaires longitudinales et circulaires, et la sous-muqueuse du plexus entre la couche musculaire circulaire et la muqueuse. Comme les systèmes effecteurs de ces plexus (transportant l&#39;épithélium, les cellules endocrines, les éléments immunitaire, les vaisseaux sanguins et des muscles lisses) sont également contenues dans la paroi intestinale, semi-intactes préparations peuvent être disséqués qui préservent les composants individuels de différentes voies réflexes. Le comportement des systèmes effecteurs est contrôlée par le plexus sous-muqueux et myentériques agissant de concert. Par conséquent, la connaissance détaillée des interactions synaptiques au sein et entre les ganglions, et de la communication entre le plexus, est essentielle pour comprendre la fonction normale gastro-intestinal. L&#39;ENS, comme un système nerveux intact, est un modèle expérimental unique dans lequel on peut corréler les événements moléculaires et cellulaires avec le comportement électrique du réseau neuronal et de ses résultats physiologiques. En raison de l&#39;organisation quasi-bidimensionnelle de son plexus, l&#39;ENS est particulièrement bien adapté pour l&#39;étude des réseaux de neurones à l&#39;aide de multiples techniques de site d&#39;enregistrement optiques qui emploient sensibles au voltage colorants<sup&gt; 2,7,8,9</sup&gt;. Nous allons illustrer ici l&#39;utilisation d&#39;un relativement nouveau naphthylstyryl-pyridinium colorant (di-4-ANEPPDHQ)<sup&gt; 3</sup&gt; Qui offre de multiples avantages par rapport à ses prédécesseurs, y compris la phototoxicité très faible, faible taux d&#39;internalisation et la stabilité chimique remarquable. Lorsqu&#39;il est utilisé en conjonction avec une caméra qui permet de sous-milliseconde le temps de résolution, ce colorant nous permet de surveiller l&#39;activité électrique de tous les neurones dans le champ de vision avec une résolution maximale spatiale de ~ 2,5 um à un grossissement de 100x. A faible grossissement (10x ou 20x), le sacrifice de simple cellule de résolution est compensée par un gain en perspective, révélant la complexité des circuits inter-ganglionnaires.

Ce protocole illustre comment la tension colorants sensibles pour permettre l&#39;enregistrement optique de l&#39;activité électrique de réseaux de neurones intacts tels que les réseaux de la Guinée-cochon système nerveux entérique, avec une résolution réglable allant de simples cellules à multi-ganglionnaires circuits.

Enregistrement optique de l&#39;activité électrique en Guinée-cochon Réseaux entérique en utilisant la tension colorants sensibles

Le système nerveux entérique (SNE) est un réseau autonome doté de fonctions identifiées, capable d'exécuter des comportements complexes de manière isolée. Ses neurones ...

Ce vidéo montre la dissection et l'imagerie ultérieure de préparations du système nerveux entérique stimulées électriquement, en utilisant le colorant sensible au voltage natal styryl D four A-N-E-P-P-D-H-Q. Un petit segment d'intestin est prélevé sur un cobaye euthanasié, puis disséqué afin d'exposer d'abord la sous-muqueuse, puis finalement le plexus myentérique pour des enregistrements optiques. Des électrodes sont placées sur un tissu monté, préalablement coloré avec D four A-N-E-P-P-D-H-Q, après qu'une image initiale à haute résolution ait été capturée.Les changements optiques indiquant une activité électrique sont enregistrés à l'aide d'une caméra haute vitesse. Pendant l'acquisition à haute vitesse, une stimulation électrique est appliquée. L'image haute résolution est ensuite superposée à la carte de pixels de la caméra haute vitesse pour l'analyse à l'aide de neuro plex.Bonjour, je suis Brian Salzberg, directeur du Laboratoire d'optique cellulaire ou loco, comme nous aimons l'appeler, au sein du Département des neurosciences de l'Université de Pennsylvanie. Je m'appelle Analia Obide. Je fais également partie du laboratoire d'optique cellulaire.Aujourd'hui, nous allons vous

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Nous présentons ici la méthodologie utilisée pour la résolution rapide et de haute fluorescentes sensibles au voltage d'imagerie de l'activité de teinture détaillée des neurones dans le ganglion stomatogastric crabe.

Imagerie optique des neurones dans le ganglion de crabe Stomatogastric avec tension colorants sensibles

Transport rétrograde de colorant fluorescent marque une sous-population de neurones en fonction de projection anatomique. Axones marqués peuvent être ciblés...

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

Une technique d'imagerie pour le suivi de l'évolution du potentiel de membrane avec une résolution spatiale sous-micrométrique et sub-milliseconde temporelle est décrit. La technique, basée sur une excitation laser de la tension de colorants sensibles, permet de mesurer des signaux dans les axones et les collatéraux axone, des branches dendritiques et terminaux individuels épines dendritiques.

Enregistrement colorant sensible à la tension d&#39;axones, des dendrites et des épines dendritiques des neurones individuels dans des tranches de cerveau

Cette vidéo montre une procédure d’observation des changements dans l’activité neuronale d’une tranche de cerveau colorée avec un colorant sensible au voltage. Le colorant reflète les changements dans le potentiel membranaire du neurone en modifiant son intensité de fluorescence. Grâce à l’application de stimuli électriques et de techniques d’imagerie avancées, ce processus permet un suivi visuel des changements en temps réel du potentiel de la membrane neuronale en fonction de la fluorescence...

Enregistrement optique de l’activité neuronale dans des tranches de cerveau colorées avec un colorant sensible au voltage

Cette vidéo présente une méthode pour enregistrer l’activité des nerfs afférents du côlon colique dans un côlon de rat ex-vivo, canulé aux deux extrémités et infusé de solution saline pour augmenter la pression intraluminale. Lorsque la pression augmente, le signal nerveux augmente, indiquant sa stimulation.

Enregistrement électrophysiologique des nerfs afférents du côlon dans un côlon de rat ex vivo

Le système nerveux entérique (SNE) est un réseau de neurones et de glies situé dans la paroi intestinale qui contrôle les réflexes intestinaux. Ce protocole décrit des méthodes d’enregistrement de l’activité des neurones entériques et de la glie dans des préparations vivantes de SNE à l’aide de l’imagerie Ca2+.

De l&#39;imagerie in situ de Ca du système nerveux entérique

Nous introduisons une méthode d'enregistrement optique reproductible et stable pour les tranches de cerveau à l'aide de colorant sensible à la tension. L'article décrit la coloration de colorant tension-sensible et l'enregistrement des signaux optiques utilisant les préparations conventionnelles de tranche hippocampal.

Enregistrement optique à grand champ à un seul photon dans des tranches de cerveau à l'aide de teinture sensible à la tension

Nous présentons la méthodologie pour l'isolement des myocytes murines et comment obtenir des traces de tension ou de calcium simultanément avec des traces de raccourcissement sarcome à l'aide de la photométrie fluorescence avec des mesures numériques simultanées de géométrie cellulaire.

Imagerie optique des myocytes ventriculaires murines isolés

Ce protocole présente une méthode d’imagerie de l’activité de la population neuronale avec une résolution unicellulaire chez des espèces d’invertébrés non transgéniques à l’aide de colorants sensibles à la tension d’absorbance et d’un réseau de photodiodes. Cette approche permet un flux de travail rapide, dans lequel l’imagerie et l’analyse peuvent être poursuivies au cours d’une seule journée.

Imagerie optique basée sur des photodiodes pour l’enregistrement de la dynamique des réseaux avec une résolution mononeurone chez les invertébrés non transgéniques

Ici, nous présentons une méthode pour l’évaluation à long terme de la performance et de la sécurité des réseaux d’électrodes sous-durales souples dans un modèle mini-porc, décrivant la méthode et les outils chirurgicaux, l’imagerie par résonance magnétique postopératoire, l’électrophysiologie du cortex auditif, les propriétés électrochimiques de l’implant et l’immunochimie post-mortem.

Implantation d’un réseau d’électrocorticographie molle sous-durale (ECoG) et enregistrement cortical à long terme chez les miniporcs

Découvrez l'enregistrement optique de l'activité électrique dans les réseaux entériques du cobaye en utilisant des colorants sensibles à la tension. Cette méthode permet d'étudier la connectivité neuronale avec une résolution ajustable.

Enregistrement optique de l'activité électrique en Guinée-cochon Réseaux entérique en utilisant la tension colorants sensibles

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