Les études génétiques des protéines humaines réparation de l'ADN utilisant de la levure comme système modèle

Les plasmides WRN sont digérés avec l'endonucléase de restriction cell one et MLU one, et les fragments sont purifiés à partir d'un gel. Ces vecteurs d'expression digérés par cell one jusqu'aux fragments WN de MLU one sont ensuite ligaturés dans les sites de cell one à MLU one du vecteur levure. Le plasmide multicopie contient également un marqueur sélectionnable TRP one.

Les constructions W Rrn sont transformées dans la levure selon des protocoles standards, et les transformants sont sélectionnés sur un milieu synthétique complet au glucose dépourvu de tryptophane. Les transformants individuels sont ensuite étalés en stries sur un milieu synthétique complet au glucose sans tryptophane, et les plaques sont incubées à partir de la plaque maîtresse. Pour analyser la restauration du phénotype de croissance lente dans les SGS transformées par WRN, un des trois meilleurs transformants de souche double mutante est étalé en stries sur des plaques contenant du glucose ou du galactose.

Pour analyser l'effet de l'expression de WRN sur la sensibilité aux traitements par HU et MMS, un test de croissance par dépôt est réalisé afin de déterminer la distribution dans le cycle cellulaire des cellules de levure exprimant WRN. Une coloration par DAPI est effectuée. L'expression de WRN dans un hôte hétérologue est analysée par une analyse Western Blot.

Bonjour, je suis Robert Broch de la section sur les cas d'ADN Hela du laboratoire de gériatrie moléculaire du National Institute on Aging, l'un des instituts des National Institutes of Health. Bonjour, je suis Monica Agarwal, également de la section sur les cas d'ADN Hela du laboratoire de génétique moléculaire du National Institute on Aging. Comprendre les rôles des protéines humaines de réparation de l'ADN et des voies génétiques constitue un défi abordable pour de nombreux chercheurs.

Les études génétiques sur les systèmes mammaliens ont été limitées en raison du manque d'outils facilement disponibles, notamment des lignées cellulaires génétiquement modifiées, des systèmes d'expression régulés et des marqueurs sélectionnables appropriés. Aujourd'hui, nous allons vous présenter des protocoles utilisant la levure comme système modèle afin d'étudier les fonctions moléculaires et cellulaires d'une enzyme de déroulement de l'ADN, appelée hélicase, dans la prévention du vieillissement prématuré. Nous utilisons ces protocoles dans notre laboratoire pour caractériser génétiquement le rôle du produit du gène humain burner, qui est défectueux dans la réparation de l'ADN et le maintien de la stabilité génomique dans un trouble de vieillissement prématuré.

Le syndrome de Werner est l'un des cinq cas d'hélicases de la famille humaine req présents chez l'homme. Il existe un seul gène sgs nommé permettant d'étudier le rôle du gène humain Werner dans la réponse au stress de réplication. Nous avons examiné l'effet de l'expression de Werner dans un fond génétique mutant de l'homme sur divers paramètres biologiques.

Commençons donc. Étant donné que nous utiliserons la levure comme hôte hétérologue, notre première étape consistera à cloner le gène humain *Werner* ou sa variante dans un vecteur levure. Les plasmides *Werner* ont été digérés avec l'endonucléase de restriction Sal I et Mlu I, puis les fragments purifiés ont été ligaturés dans les sites Sal I et Mlu I du vecteur d'expression levure, sous la régulation d'un promoteur inducible par le galactose.

Le plasmide multicopie contient également un marqueur de sélection TRP1. Ces plasmides d'expression de Werner sont ensuite transformés dans les souches de levure tryptophane-trophes appropriées utilisées dans cette étude. Les transformants sont sélectionnés en étalant la suspension sur un milieu synthétique complet contenant du glucose.

En l'absence de tryptophane, incuber les boîtes à 30 degrés Celsius pendant trois à quatre jours jusqu'à l'apparition des colonies. Une fois les colonies développées, repiquer individuellement les transformants sur un milieu synthétique complet au glucose et incuber les boîtes à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours. Les souches mutantes de levure exprimant le gène humain *weer* et ses variants sont ensuite analysées pour leurs phénotypes cellulaires à l'aide des techniques décrites dans les sections suivantes.

Les trois mutants supérieurs présentent un défaut de croissance sévère. Toutefois, une mutation dans le gène SGS1 supprime le phénotype de croissance lente du mutant triple supérieur afin d'examiner l'effet de l'expression de Werner sur la croissance des souches de type sauvage SGS1 ou SGS1 triple supérieur. Étaler les souches correspondantes contenant le vecteur ou le plasmide d'expression de Werner sur des boîtes de milieu synthétique complet dépourvu de tryptophane, mais contenant soit 2 % de glucose soit 2 % de galactose comme contrôle positif. L'effet de l'expression de SGS1 a été déterminé en incubant les boîtes à 30 degrés pendant deux jours.

Les souches sauvages et la souche mutante sgs un transformée avec le vecteur ou Werner ne présentent aucune différence dans leur profil de croissance. Cependant, la souche double mutante sgs un top trois transformée avec Werner croît significativement plus lentement que la double mutante sgs un top trois transformée avec le vecteur, afin d'évaluer les exigences fonctionnelles de Werner pour restaurer le phénotype de croissance lente. Dans le fond génétique sgs un top trois, les souches sgs un top trois transformées avec des mutants du domaine catalytique de Werner sont étalées sur des plaques synthétiques complètes dépourvues de tryptophane et contenant soit 2 % de glucose soit 2 % de galactose, après deux jours.

L'incubation de la mutation de l'exonucléase Werner indiquée comme E 84 A restaure le phénotype de croissance lente comme Werner, montrant ainsi que l'activité exonucléasique n'est pas nécessaire à la restauration du phénotype de croissance lente des trois meilleurs. La mutation de l'hélicase Werner se développe bien, démontrant ainsi que l'activité hélicasique de Werner est requise pour la restauration du phénotype de croissance lente des trois meilleurs. Pour déterminer la capacité de Werner à affecter la vitesse de croissance de sgs.

Une souche parmi les trois meilleures, avec des niveaux inférieurs d'expression protéique, porte le gène SGS1. Transformer les trois souches parmi les meilleures avec le vecteur Werner ou SGS1 sur des plaques synthétiques complètes dépourvues de tryptophane, mais contenant des concentrations croissantes de galactose. Incuber toutes les plaques à 30 degrés Celsius pendant deux jours. La souche mutante de l'exonucléase Warner et Warner restaure le phénotype de pente parmi les trois meilleures à tous les niveaux de galactose.

Cependant, les mutants de l'hélicase Werner ne présentent pas ce phénomène. Il a été démontré que le double mutant SGS1 top3 est moins sensible que le mutant simple top3 à l'agent alkylant de l'ADN, le méthyl méthane sulfonate (MMS), ou à l'inhibiteur de la réplication, l'hydroxyurée (HU). Afin d'évaluer l'effet de l'expression de Werner sur la sensibilité au MMS et à l'HU des souches SGS1 ou SGS1 top3, faites croître des souches de levure transformées avec un vecteur ou avec le gène Werner, en milieu synthétique complémentaire contenant du raffinose et dépourvu de tryptophane, à 30 degrés Celsius comme témoin.

Utilisez une souche parentale de type sauvage transformée avec un vecteur pour réensemencer toutes les cultures dans un milieu synthétique complet contenant du raffinose et dépourvu de tryptophane, puis faites-les croître à 30 degrés Celsius jusqu'à la phase logarithmique précoce. Lorsque les cultures atteignent la phase logarithmique précoce, préparez des dilutions sérielles dix fois successives jusqu'à un facteur 10 000 de ces souches à l'aide d'un milieu synthétique complet dépourvu de tryptophane, déposez quatre microlitres de chaque dilution sur des boîtes de milieu synthétique complet GAL dépourvu de tryptophane contenant 10 millimolaire de HU ou 0,0025 % de MMS, puis incubez les boîtes à 30 degrés Celsius pendant quatre jours. Un mutant double SGS un top trois qui est transformé avec le gène sgs de type sauvage.

L'une est retardée en fin de phase SG2 du cycle cellulaire, ce qui entraîne une morphologie en forme de haltère. En revanche, les levures de type sauvage terminent la division cellulaire, laissant moins de cellules en forme d'haltère pour étudier la distribution du cycle cellulaire de la souche sgs one top three transformée Werner. Faites d'abord croître, de manière logarithmique, des cultures des souches suivantes dans un milieu synthétique complémentaire à base de RAF, dépourvu de tryptophane, à 30 degrés Celsius pendant la nuit.

SGS un des trois principaux transformés avec le vecteur Werner ou SGS un et le vecteur transformé de la souche parentale sauvage, réensemencer les cultures à une DO de 0,05. Une fois réensemencées, faire croître les cultures jusqu'à une DO de 0,5 et les récolter par centrifugation. L'expression de Werner est ensuite induite en ajoutant du gala lactose à une concentration de 2 %. Laisser les cultures croître à 30 degrés Celsius pendant six heures.

Après six heures, récoltez les cultures et récupérez les cellules par centrifugation. Transférez les cultures dans des tubes de microcentrifugeuse après la centrifugation, puis lavez les cellules une fois avec du PBS. Fixez ensuite les cellules dans de l’éthanol à 70 % pendant 20 minutes à température ambiante ; après avoir lavé deux fois les cellules fixées avec du PBS, resuspendez les cellules dans un volume de PBS.

Placer la suspension cellulaire sur une lame et ajouter du vector shield. Utiliser un milieu de montage contenant du DAPI à une concentration d'un microgramme par millilitre. Examiner les lames au microscope XI Saxo vert afin de rechercher des cellules présentant des noyaux en forme de haltère, caractéristique des cellules de levure en phase SG2 du cycle cellulaire.

Pour déterminer l'expression de la protéine Werner ou sa variante dans les souches de levure SGS un ou SGS un top trois transformées, commencez par cultiver les souches pendant six heures dans un milieu contenant du galactose afin d'induire l'expression de la protéine Werner. Après avoir récupéré les cellules par centrifugation, lavez-les avec du PBS et resuspendez-les.

Un tampon de lyse alcalin. Faire bouillir les cellules pendant cinq minutes, puis clarifier par centrifugation et neutraliser avec de l'acide chlorhydrique un molaire. Ces lysats sont désormais prêts à être analysés par électrophorèse sur des gels de SDS-polyacrylamide à 8 à 16 % afin de déterminer le niveau d'expression de la protéine Warner sous l'influence de concentrations variables de galactose.

Tout d'abord, induire les cultures avec des concentrations variables de galactose pendant six heures. Ensuite, récolter les cellules par centrifugation et les resuspendre dans un tampon contenant des inhibiteurs de protéases. Ajouter des billes de verre de 425 à 600 microns au mélange et lyser les cellules par vortexage à haute vitesse pendant une minute, suivi d'une pause sur glace d'une minute.

Répétez l'opération un total de huit fois. Ensuite, centrifugez l'homogénat obtenu pendant cinq minutes à 15 000 Gs et récupérez la fraction surnageante. Après avoir mesuré la quantité de protéine dans les fractions de lyse par la méthode de Bradford, séparez des concentrations équivalentes de protéines sur des gels SDS-Polyacrylamide de 8 à 16 %. L'expression de la protéine Werner est ensuite déterminée par immunotransfert (Western blot) dans les sgs.

Un TOP3 restaure le phénotype de croissance lente de top3, comme illustré sur ces photographies. Lorsque des souches sgs1 top3 sont transformées avec un vecteur codant pour Werner ou sgs1, elles sont étalées sur une plaque SC contenant du tryptophane et soit 2 % de glucose, soit 2 % de galactose. L'expression de Werner induite par le galactose provoque une croissance plus lente de la souche sgs1 top3.

En revanche, la souche parentale de type sauvage ou la souche sgs1 transformée avec Werner n'est pas affectée dans sa croissance, indiquant que la croissance lente conférée par Werner est spécifique au fond génétique sgs1Δ. Lorsque des souches sgs1Δ transformées avec des variants de Werner ont été étalées en stries sur des plaques SC sans tryptophane contenant soit 2 % de glucose soit 2 % de galactose uniquement.

La forme inactivée pour l'activité exonucléase de la protéine Werner était encore capable de restaurer le phénotype de croissance lente. Cela démontre que l'activité ATPase hélicase de Werner, mais non son activité exonucléase, est nécessaire pour restaurer le phénotype de croissance lente de top three. Dans un fond génétique SGS one top three, Werner a restauré le phénotype de croissance lente de SGS one top three sur l'ensemble de la gamme de concentrations de GAL.

Ces résultats indiquent que la restauration du phénotype de croissance lente dans le fonds muté sgs un top trois se produit à de faibles niveaux d'expression de la protéine Werner. Lorsque des cultures en croissance logarithmique de souches sgs un top trois transformées avec Werner ou ses variants ont été déposées en dilutions sérielles dix fois moindres sur des plaques SC contenant du tryptophane et du glucose ou du galactose, ainsi que du MMS ou de l'hydroxyurée (HU), nous avons observé que l'expression de Werner augmentait la sensibilité au MMS et à l'hydroxyurée de la souche sgs un top trois. En outre, cet effet sur la sensibilité au MMS et à l'hydroxyurée dans le fonds sgs un top trois nécessite l'activité d'hélicase de l'ATP de Werner, mais non son activité d'exonucléase.

Enfin, l'expression de Werner restaure également le délai caractéristique de deux SG du top three, comme l'indique l'augmentation de la population de grandes cellules accolées. Dans les cellules mutantes sgs un top three exprimant Werner. Par comparaison avec les cellules sgs, les cellules top three transformées avec le vecteur ont été colorées au Dabi.

Pour visualiser les noyaux, les flèches indiquent l'expression de Werner dans des noyaux non divisés. Dans les sgs transformés, une des trois cellules supérieures a été induite en ajoutant les concentrations indiquées de galactose, et les cellules ont été récoltées six heures après l'induction. Des quantités équivalentes de lysat total de cellules ont été chargées sur des gels SDS-PAGE de polyacrylamide 8 à 16 %, suivies d'une détection par immunotransfert utilisant un anticorps anti-Warner.

Nous vous avons montré comment étudier les phénotypes cellulaires associés à des fonds génétiques mutants définis de levure afin de préciser les fonctions cellulaires et moléculaires du gène humain learner, médiées par ses activités catalytiques et ses interactions protéiques. La levure peut être utilisée comme organisme modèle pour étudier les fonctions du gène dans des voies définies. Lors de la réalisation de ces protocoles, il est essentiel de choisir un fond génétique mutant de levure approprié pour distinguer le rôle du gène étudié dans des voies spécifiques.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.