Électrophorèse sur gel dénaturant Dégradé (DGGE)

D'accord. Bonjour, je m'appelle Celeste Peterson et je suis chercheuse à l'Université Harvard, où j'étudie les communautés microbiennes en biofilm. J'analyse les communautés bactériennes en examinant leur séquence de l'ARN 16S et la manière dont cette séquence évolue dans le temps et l'espace. Pour ce faire, j'utilise l'Électrophorèse en gradient de denaturant (DDGE).

Ceci n'est pas une électrophorèse acrylique normale de mon échantillon ; elle doit être maintenue à 60 degrés pendant son exécution, et le tampon doit être pompé en continu. Nous allons donc réchauffer le tampon pendant environ une heure, jusqu'à ce qu'il atteigne 60 degrés, puis nous pourrons exécuter l'analyse. Maintenant, je vais laver cette plaque avec une solution diluée de uc, en éliminant les impuretés, et allumer la lumière.

Tout ce qui ressemble à cela peut provoquer des régularités. Il est important d'essuyer toute l'eau. Ainsi, lorsque j'assemble le gel, je placerai cette puce à l'extérieur du gel.

Ainsi, le gel se trouvera entre ces deux morceaux de verre et la puce sera à l'extérieur, sans affecter le gel situé entre les deux. Je vais maintenant assembler le gel dans ces pinces, puis les rapprocher en les serrant par rotation vers la droite. Comme pour tout gel, il est important de s'assurer que le bas soit bien aligné.

Pour éviter la formation de bulles, nous retournons maintenant le gel et le plaçons ici afin de l’insérer avec le joint. Il est donc important, lorsque vous effectuez cette manipulation, que le gel et les plaques soient bien alignés avec le joint. Les boutons situés sur le côté s’insèrent ensuite et vous appuyez fermement pour créer l’étanchéité.

Il s'agit donc d'une seringue de 30 mil. Cette partie et cette partie sont fournies avec le kit bio red et se fixent simplement ainsi. Cela permet simplement d'éliminer l'excès d'eau dans les tubes.

Placez donc le tube sur le gel pour charger le gel. Insérez d'abord un embout dans le tube, puis une aiguille munie de ce petit embout, et placez-la exactement au centre du gel, juste en dessous du verre inférieur. Cet embout métallique s'insère ensuite dans le tube long, qui sera relié à deux seringues identiques contenant respectivement la solution de forte densité et celle de faible densité.

Il s'agit donc de solutions préparées au préalable. Dans la solution bleue, j'ai ajouté un colorant qui indique simplement qu'il s'agit de la solution la plus dénaturante, et de la solution de gradient la moins dense, la moins concentrée. Elles contiennent tous les composants nécessaires.

Et maintenant, je vais préparer, en fait, une quantité deux fois plus importante que la semaine dernière. Une fois que vous avez le mélange, vous avez environ cinq à sept minutes pour remplir le gel avant que le colon ne monte. Et maintenant, nous remplissons la seringue avec la solution.

Je vais donc le remplir avec environ 15 de la solution. Ensuite, pour éliminer les bulles d'air, je le retournerai et presserai doucement jusqu'à ce que la bulle d'air située en haut disparaisse. Maintenant, cette petite vis va être insérée dans cette rainure.

Cet adaptateur va s'aligner avec cette pince ici, et il sera fixé fermement avec une pince en C. Ensuite, ce tube sera raccordé à la seringue. La même opération est effectuée de l'autre côté avec la matrice à haute densité lorsque le moment de la délivrance est arrivé.

Je vais donc tourner cette roue d'un mouvement régulier dans le sens horaire. Tout d'abord, la solution bleue va sortir en premier car elle est la plus dense, et elle formera la partie inférieure du gel. Puis, après un certain temps, la solution claire commencera à remplir le gel et le gradient se formera.

Un instant, inclinez doucement selon un angle, et dès que vous avez terminé de verser le gel, rincez immédiatement vos tubes, car ils vont polymériser. Allez-y, c'est le groupe là-bas. Ensuite, appuyez fermement. Donc ce petit, et de l'autre côté, je fais la même chose. D'accord.

Bonjour, je m'appelle Celeste Peterson et je suis chercheuse à l'Université Harvard, où j'étudie les communautés microbiennes. J'analyse les communautés bactériennes en examinant leur séquence 16S rRNA et la manière dont cette séquence évolue dans le temps et dans l'espace. Pour ce faire, j'utilise l'electrophorèse en gradient de denaturant (DGGE).

Ainsi, l'EDGD est l'électrophorèse en gel avec dénaturant. L'idée fondamentale est qu'il existe un gradient et que l'ADN, lorsqu'il migre le long du gradient, se dénature. Par conséquent, différentes espèces de 16S s'arrêteront à des positions différentes le long du gradient.

Et cela finit donc par constituer une empreinte des différentes espèces de sexiness présentes dans la communauté. Le but de mon expérience est donc de déterminer qui est présent dans la communauté et comment cela évolue dans le temps et l'espace. Je peux alors réaliser un gel DDD de sexiness, découper les bandes et identifier les espèces représentées dans chaque communauté.

Ainsi, l'un des plus grands défis lorsqu'on réalise un gel A DDG consiste à déterminer le gradient le plus approprié. Il s'agit donc d'un paramètre qu'il faut ajuster empiriquement selon la communauté étudiée, afin de déterminer le type de gradient le plus adapté. Celui que j'utilise aujourd'hui est un gradient de 35 à 55 % d'urée.

Un des principaux problèmes pouvant survenir avec cette technique est l'apparition de traînées dans les profils. Et j'ai constaté que, pour une raison quelconque, l'une des meilleures solutions consiste à faire migrer les gels pendant une très longue durée, ce qui fait disparaître les traînées. Aujourd'hui, j'utilise cette méthode pour des communautés bactériennes générales, mais elle peut également être employée pour une famille spécifique de bactéries afin d'observer leurs variations dans le temps, et dans ce cas, les gels obtenus sont généralement très nets.

Vous pouvez également examiner les mutations dans des gènes individuels à l'aide de la DDGE.