Name: Rétro-orbitaire dinjection chez le poisson zèbre pour adultes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-07T18:43:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Apprenez l'injection rétro-orbitaire chez le poisson zèbre adulte pour étudier la transplantation de cellules souches hématopoïétiques. Cette technique permet de visualiser la dynamique des cellules sanguines en temps réel.

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Ce travail est soutenu par Howard Hughes Medical Institute et une subvention du NIH pour l&#39;étude de l&#39;hématopoïèse embryonnaire.

Partie 1. Préparation du matériel d'injection <ol><li> Tg (globine: GFP) cellules: </li><li> Purger poissons donneur adulte à l'aide pipette 10ul enduit d'héparine (1unit/ul) pour les poissons de ponction derrière branchies. </li><li> Aspirer les globules rouges et passer dans le tampon de la cellule (0.9x PBS + 5% de FBS + Pen 1% / Strep). </li><li> Suspension cellulaire filtre sur mailles 40uM et déterminer la concentration de cellules à l'aide hémocytomètre comme décrit précédemment par LeBlanc et al. </li><li> Isoler et remettre dans un tampon de cellule à concentration voulue telle que le volume d'injection final n'est pas plus 5ul. Ici, nous injecter des cellules de 1,5 à 2.000.000 / destinataire. </li><li> Pour le dextrane, le Texas Red ®, dissoudre le colorant dans DPBS pour une concentration d'injection final de 10-12 mg / mL. Régime d'injecter 4 uL par poisson. </li></ol> Partie 2. Injection <ol><li> Anesthetize poissons dans tricaïne (4,2 ml (4mg/ml) les poissons d'eau tricaine/100ml). </li><li> Lavez seringue Hamilton 3-4 fois avant l'injection à l'aide d'éthanol à 70%. Rincez 3-4 fois avec du DPBS 0.9x. </li><li> Placer le poisson face dorsale et face à droite sur une éponge humide. </li><li> Tenez la seringue Hamilton avec votre main droite et avec votre index sur le piston. Doucement à stabiliser le corps du poisson avec votre main gauche. </li><li> Position de l'aiguille avec le biseau vers le haut de telle sorte que, si l'œil du poisson s ont une horloge, l'aiguille pointant serait à la position 07h00 et à un angle de 45 degrés pour les poissons (figure 1). </li><li> Insérer délicatement l'aiguille 1-2 mm dans la position de 7:00 et lentement enfoncer le piston. </li><li> Laisser le poisson dans l'eau pour récupérer l'E3 frais. </li><li> Lavez l'aiguille, comme décrit ci-dessus, entre les injections de réactifs différents. </li><li> Solution cellulaire Flick pour resuspendre les cellules de quelques minutes pour empêcher l'agglutination des cellules. </li><li> Gardez le poisson hors de débit pour 1 semaine avec des changements d'eau chaque jour pour éviter l'infection. Nous gardons poisson dans l'eau aux soins intensifs pour cette période (Stress Coat 10ml + + 5mL pemafix melafix 5ml par 38 litres d'eau E3). </li></ol> Partie 3. Les résultats représentatifs Quand elle est réalisée correctement, il est possible de visualiser matériau injecté si elle a été étiquetée en quelque sorte. Par exemple, Tg (globine: GFP) des globules rouges devraient être considérés sous un microscope de dissection fluorescentes circulant dans les vaisseaux du destinataire casper poissons peu après l'injection, comme indiqué dans la figure 2. De même, l'injection d'un dextrane 70kDa, conjugué au Texas Red ® peuvent être visualisés dans le système vasculaire des poissons transparents, immédiatement après l'injection rétro-orbitaire (figure 3). Des cellules de rein de Tg fluorescent (β-actine: GFP) poissons donneur peut également être injecté rétro-orbital en poissons casper bénéficiaires irradiés. Ces cellules seront éventuellement à domicile à la moelle destinataire (figure 4a) et peut ensuite passer à repeupler le rein après plusieurs semaines (figure 4b). Si l'injection est trop faible ou l'angle de l'aiguille contourne la cavité rétro-orbitaires sinus veineux, matériau injecté peut être visualisée mutualisation autour de l'oeil ou qui coule hors de lui. Alternativement, si l'injection est trop profonde, les poissons peuvent éprouver des dommages aux tissus ou de saignements excessifs, mais ils peuvent toujours récupérer. Quand elle est réalisée correctement, la mortalité après l'injection rétro-orbitale doit être inférieure à 5% du total et les poissons injectés succès de livraison à la circulation sanguine doit être supérieure à 90% des poissons injectés au total. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Illustration de la technique d'injection rétro-orbitaire. L'œil droit du poisson est représenté comme une horloge analogique dans lequel la position sept heures correspond à l'endroit d'injection correcte. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: Tg (globine: GFP) des globules rouges circulant dans les vaisseaux de la queue d'un poisson de casper adulte, trois jours après l'injection rétro-orbitaire. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: injection réussie d'un dextrane 70kDa conjugué au Texas Red ® utilisé comme colorant produit vascularisation fluorescent dans le poisson adulte transparente, Casper et est facilement visualisé en utilisant la norme de microscopie par fluorescence ensemble des animaux. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4a.jpg" alt="Figure 4a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="la figure 4a"> Figure 4a: Trois jours après l'injection rétro-orbitale de l'ensemble des cellules de moelle rein de Tg (β-actine: GFP) poissons donateurs, les cellules peuvent être visualisées homing dans la moelle des reins des poissons adultes bénéficiaires irradiés Casper. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4b.jpg" alt="Figure 4b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figure 4b"> Figure4b: Quatre semaines après l'injection rétro-orbitale de l'ensemble des cellules de moelle rein de Tg (β-actine: GFP) de poissons des donateurs, le repeuplement du rein destinataire avec des bailleurs de fonds verts toute cellules de la moelle des reins peuvent être visualisés dans les poissons adultes bénéficiaires irradiés Casper.

<ol><li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+route+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Pinkerton, W., Webber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+injecting+small+laboratory+animals+by+the+ophthalmic+plexus+route%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Bio.+Med%22%5BJournal%5D)">A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route.</a> Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+whole+kidney+marrow+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
</ol>

Rétro-orbitaire d&#39;injection chez le poisson zèbre adulte donne le meilleur rendement de la livraison du matériel injecté dans le sang avec la plus faible incidence de la mortalité. En raison de la nature de la tache de l&#39;injection, la perforation semble guérir rapidement, réduire l&#39;incidence de l&#39;infection et la quantité de sang perdu. Le site pourrait même être injecté à plusieurs reprises pendant un temps court pour les injections quotidiennes de médicaments, par exemple. D...

<table><tbody><tr><td>Chlorure de sodium d'héparine provenant de la muqueuse intestinale porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>Vialle préalablement pesée de 300 unités USP</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical</td><td></td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Rouge&amp;#174;</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl&lt;br/&gt;0,17 mM KCl&lt;br/&gt;0,33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0,33 mM MgSO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Seringue microlitrique</td><td>Hamilton Co</td><td>80300</td><td>701N 10 µL SYR (26s/2&amp;#8221;/2)</td></tr></tbody></table>

rétro-orbitaire d&#39;injection chez le poisson zèbre pour adultes

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Le traitement médicamenteux des animaux entiers est un outil essentiel dans tout système modèle pour pharmacologique et chimique des études génétiques. Intraveineuse (IV) est souvent la forme la plus efficace et non invasive de la livraison d&#39;un agent d&#39;intérêt. Dans le poisson zèbre (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), L&#39;injection IV de médicaments a longtemps été un défi en raison du diamètre des petits vaisseaux. Cela a également été un obstacle important pour l&#39;injection de cellules lors de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques. Historiquement, les injections dans le sang ont été effectuées directement par le cœur. Cependant, cette procédure intra-cardiaque a un taux de mortalité très élevé comme le cœur est souvent percé lors de l&#39;injection en laissant le poisson vulnérables à l&#39;infection, la perte de sang massive ou des dommages aux organes fatale. S&#39;appuyant sur notre expérience avec la souris, nous avons développé une procédure nouvelle injection dans le poisson zèbre dans lequel le site d&#39;injection est derrière l&#39;œil et dans le sinus veineux rétro-orbitaire. Cette technique d&#39;injection rétro-orbitale (RO) a été employée avec succès dans les deux l&#39;injection de drogues chez les poissons adultes ainsi que la transplantation de l&#39;ensemble des cellules de moelle des reins. Injection de RO a un taux de mortalité beaucoup plus bas que les traditionnels d&#39;injection intra-cardiaque. Les poissons qui sont injectés rétro-orbital tendance à saigner d&#39;injection moins après et sont à un risque beaucoup plus faible de blessure à un organe majeur comme le cœur. Cellules plus, lorsqu&#39;elle est effectuée correctement, injecté et / ou de la drogue d&#39;entrer rapidement dans la circulation sanguine permettant composés pour exercer leur effet sur le poisson entier et des cellules de rein de facilement la maison de leur niche. Ainsi, cette technique d&#39;injection de nouveaux minimise la mortalité, tout en permettant la prestation efficace du matériel dans le sang des poissons adultes. Ici, nous illustrent cette technique en rétro-orbitaires injection de Tg (<em&gt; Globine</em&gt;: GFP) dans les cellules adultes<em&gt; Casper</em&gt; Poisson ainsi que l&#39;injection d&#39;un colorant fluorescent rouge (dextran, Texas Red<em&gt;</em&gt;) Dans les adultes<em&gt; Casper</em&gt; Poisson. Nous avons ensuite visualiser les injections succès par microscopie à fluorescence animaux ensemble.

Ici, nous montrons comment faire rétro-orbitaires d&#39;injection chez le poisson zèbre adulte.

Rétro-orbitaire d&#39;injection chez le poisson zèbre pour adultes

Le traitement médicamenteux d'animaux entiers est un outil essentiel dans tout système modèle pour les études pharmacologiques et de génétique chimique. L'injection intraveineuse (IV) est...

Les globules rouges du donneur sont d'abord prélevés chez des poissons transgéniques exprimant la globine GFP en perforant le cœur de l'animal donneur et en aspirant les globules rouges. Une fois les cellules préparées, les poissons receveurs sont injectés par voie rétro-orbitaire, puis observés au moyen d'une microscopie de fluorescence standard sur organisme entier afin de vérifier l'injection réussie de cellules marquées par fluorescence. De manière similaire, un dextran coloré conjugué au Texas red est préparé, injecté par voie rétro-orbitaire, et l'animal injecté est ensuite observé pour confirmer l'injection réussie.Bonjour, je suis Emily Atch du laboratoire de Leonard Zan, du service d’hématologie et d’oncologie de l’hôpital pour enfants de Boston. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’injection rétro-orbitaire chez le poisson zèbre adulte. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la transplantation de cellules souches hématopoïétiques.Commençons. Nous allons démontrer les injections rétro-orbitaires de cellules transgéniques exprimant la globine GFP et d'un colorant rouge fluorescent, le dextran conjugué au Texas Red, chez des poissons Casper adultes, une souche transparente de poisson zèbre, afin de préparer des cellules transgéniques exprimant la globine GFP. Nous prélèverons les cellules sanguines des poissons donneurs adultes à l'aide d'une micropipette de 10 microlitres dont la pointe est enduite d'héparine, en perforant le poisson derrière les branchies, en aspirant les globules rouges, puis en les transférant dans un tampon cellulaire.Ensuite, filtrer la suspension cellulaire à l'aide d'un tamis de 40 micromètres. Après avoir déterminé la concentration des cellules à l'aide d'un hémocytomètre comme décrit précédemment par LeBlanc et al., centrifuger les cellules à 1500 tr/min pendant cinq minutes. Résuspender les cellules dans du tampon à cellules à une concentration souhaitée de sorte que le volume final d'injection ne dépasse pas cinq microlitres.Dans cette démonstration, nous injecterons de 1,5 à 2 millions de cellules par destinataire pour préparer le colorant fluorescent rouge, que nous dissoudrons dans du DPBS afin d'obtenir une concentration finale d'injection de 10 à 12 milligrammes par millilitre. Nous injecterons quatre microlitres par poisson, car la procédure d'injection est identique. Quel que soit le matériau injecté, nous ne démontrerons que l'injection du colorant fluorescent rouge.Avant d'injecter les poissons, laver la seringue Hamilton trois à quatre fois avec de l'éthanol à 70 %. Rincer trois à quatre fois avec du XDPS 0,9. Après avoir anesthésié le poisson dans du Trica, placer le poisson avec le côté dorsal vers le haut et tourné vers la droite sur une éponge humide.Tenez la seringue Hamilton chargée de la main droite, avec l'index sur le piston, et stabilisez délicatement le corps du poisson de la main gauche. Positionnez l'aiguille avec le biseau vers le haut, de sorte que si l'œil du poisson était une horloge, l'aiguille pointerait vers la position de sept heures. À un angle de 45 degrés par rapport au poisson, insérez doucement l'aiguille d'un à deux millimètres à la position de sept heures et appuyez lentement sur le piston.Laisser les poissons se rétablir dans de l'eau E3 fraîche. Garder les poissons hors courant pendant une semaine avec des changements d'eau quotidiens afin d'éviter toute infection ; nous conservons les poissons dans de l'eau ICU pendant cette période. Lorsque les injections rétro-orbitaires sont effectuées correctement, il est possible de visualiser le matériel injecté qui a été marqué.Par exemple, des globules rouges transgéniques exprimant la GFP peuvent être observés au microscope stéréoscopique à fluorescence en circulation dans la vascularisation de la queue d’un poisson Casper adulte receveur, trois jours après l’injection ; de même, l’injection réussie d’un dextran de 70 kilodaltons conjugué au Texas red produit immédiatement une vascularisation fluorescente. Chez le poisson Casper adulte transparent, facilement visualisable par microscopie de fluorescence sur l’animal entier, des cellules de moelle rénale marquées par fluorescence provenant d’un donneur transgénique exprimant la GFP sous le promoteur de l’actine bêta peuvent également être injectées par voie rétro-orale dans un poisson Casper receveur irradié. Ces cellules finissent par coloniser la moelle du receveur, comme illustré ici trois jours après l’injection ; quatre semaines plus tard, ces cellules donneuses vertes peuvent poursuivre la recolonisation du rein du receveur.Nous venons de vous montrer comment effectuer des injections rétro-orbitaires chez des zebrafish adultes. Lors de cette procédure, il est important de se souvenir d'injecter en maintenant l'aiguille à un angle de 45 degrés par rapport au plan du poisson. Voilà, c'est terminé.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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