Mesurer la tension de membrane induite avec Di-8-ANEPPS

Pour un biologiste, la cellule est le bloc de base de la vie contenant un certain nombre d'organites différents, chacun accomplissant des tâches spécifiques et permettant ensemble à la cellule d'assurer ses fonctions vitales d'un point de vue électrique. Toutefois, la structure interne n'est pas très importante, et la cellule peut être considérée comme un cytoplasme conducteur entouré par une membrane isolante et baignant dans un milieu extérieur conducteur. Un léger déséquilibre des concentrations ioniques, avec un excès d'ions s'accumulant près de la membrane, donne lieu à un potentiel de membrane au repos.

Placer une cellule dans un champ électrique provoque une redistribution locale des charges de part et d'autre de la membrane. Le résultat est une tension membranaire induite, qui s'ajoute à la tension de repos et disparaît lorsque le champ est éteint. Pour des formes cellulaires simples, la tension membranaire induite peut être calculée analytiquement dans le cas d'une cellule sphérique.

Elle est donnée par l'équation de Schwan, qui établit que la tension est proportionnelle à l'intensité du champ et à la taille de la cellule, et suit la fonction cosinus le long de la membrane. Pour des formes cellulaires plus complexes, la tension induite peut s'écarter considérablement de la fonction cosinus et doit être déterminée soit numériquement à l'aide d'un ordinateur puissant, soit expérimentalement à l'aide d'un colorant métrique de potentiel. L'un des colorants métriques de potentiel couramment utilisés à cet effet est le diétate AIPs.

Un colorant rapide dont les spectres d'excitation et d'émission dépendent de la tension membranaire, les AIPs deviennent fortement fluorescents lorsqu'ils se lient à la membrane, la variation de l'intensité de fluorescence étant proportionnelle à la variation de la tension membranaire. Cette vidéo montre le protocole permettant de mesurer la tension membranaire induite en utilisant les AIPs. Dans cet exemple, des cellules d'ovaire de hamster chinois sont utilisées ; les cellules sont ensemencées dans des chambres à raison de 100 000 cellules par chambre.

Dans le milieu de culture HAMF 12, complété par du sérum de veau fœtal, du L-glutamine et des antibiotiques, incuber les cellules dans leur milieu de culture pendant deux à quatre heures afin d'obtenir des cellules sphériques adhérentes, ou pendant 16 à 20 heures pour obtenir des cellules uniques adhérentes de formes plus complexes. Préparer une solution mère de 10 millions d'unités MO de diet aaps dissoute dans le DMSO dans le flacon d'origine. Certaines lignées cellulaires peuvent nécessiter l'ajout d'onic pour faciliter l'incorporation du colorant dans la membrane. Transférer un millilitre de spinners, une modification du milieu minimum essentiel (SMEM), dans un tube EOL contenant 2,5 microlitres de 20 % d'onic et trois microlitres de diet aaps à 10 millimolaire.

Cela donne une solution de chargement contenant environ 30 micromolaire de aaps alimentaires et 0,05 % d'onic. Remplacez le milieu de culture dans la chambre par la solution de chargement. Placez la chambre au réfrigérateur pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius à cette température.

L'internalisation du colorant à travers la membrane plasmique est largement inhibée après la coloration ; rincez soigneusement plusieurs fois l'excès de colorant avec du SMEM pur. Enfin, laissez 1,5 millilitre de SMEM dans la chambre. Les cellules sont observées à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé d'un objectif à immersion dans l'huile, d'un monochromateur et d'une caméra CCD.

Dans le logiciel d'acquisition, régler la longueur d'onde d'excitation à 419 nanomètres et choisir un filtre passe-bande réglé approximativement à 605 nanomètres, bien que non appliqué ici. Diet aaps permet également des mesures ratiométriques de la tension membranaire. Placer la chambre contenant les cellules sur la platine du microscope, positionner les électrodes au fond de la chambre et les relier au générateur d'impulsions.

Dans cet exemple, une impulsion carrée d'une amplitude de 35 volts et d'une durée de 50 millisecondes est générée. À l'aide d'une alimentation en tension continue et d'un commutateur commandé par microprocesseur, l'impulsion est délivrée à une paire d'électrodes, créant un champ électrique entre celles-ci et induisant une tension membranaire. Le délivrage de l'impulsion doit être synchronisé avec l'acquisition d'images.

Localisez les cellules d'intérêt, appliquez une seule impulsion électrique ou une série d'impulsions pour chaque impulsion. Acquérez deux images de fluorescence : l'image témoin immédiatement avant l'impulsion et l'image d'impulsion pendant l'impulsion, en raison de la faible réponse du colorant. Les changements de fluorescence sont difficiles à distinguer et ne deviennent évidents qu'après traitement. Ouvrez les images pour chaque impulsion.

Soustrayez le fond dans l'image témoin et l'image d'impulsion. Choisissez une cellule et définissez la région d'intérêt de manière à ce qu'elle corresponde à la membrane. Mesurez la fluorescence le long de cette région dans l'image témoin et l'image d'impulsion, puis transférez les valeurs dans un tableur pour chaque impulsion.

Soustrayez les données du contrôle des données de l'impulsion et divisez le résultat par les données du contrôle afin d'obtenir les variations relatives de la fluorescence. Si une séquence d'impulsions est appliquée, les valeurs de variation relative déterminées pour chaque impulsion peuvent être moyennées. Pour obtenir une mesure plus fiable, transformez les variations relatives de la fluorescence en tension membranaire induite.

À l'aide d'une courbe d'étalonnage, une estimation approximative de cette courbe peut être obtenue à partir de la littérature, mais pour une plus grande précision, elle doit être mesurée pour chaque configuration particulière. Tracer la tension en fonction de la longueur d'arc relative. La courbe peut également être lissée à l'aide d'un filtre approprié pour les cellules sphériques.

Le graphique obtenu est proche d'une courbe en cosinus, en accord avec l'équation de Schwan. Pour des formes cellulaires plus complexes, la même procédure donne des distributions spatiales plus intricées du voltage membranaire.