Name: Spinal Cord électrophysiologie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-18T16:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Apprenez la laminectomie ventrale pour isoler la moelle épinière de souris néonatale et enregistrer l'activité neuronale. Cette technique électrophysiologique permet d'étudier les signaux nerveux in vitro.

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Samuel L. Pfaff est un professeur dans les laboratoires de l&#39;expression génique au Salk Institute for Biological Studies et un chercheur à l&#39;Institut médical Howard Hughes. Ce travail a été soutenu par la Christopher Reeve et Dana Foundation. Joe Belcovson, Kent et Mike Sullivan Schnoeker de Ressources Multimédia à l&#39;Institut Salk a fourni une aide à la photographie et l&#39;édition.

1. Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) 1. Nous avons d'abord préparer un 2L d'un stock de 10X aCSF sans magnésium ou le calcium. Réactifs énumérés dans millimolaire. Numéros de catalogue se réfèrent à Sigma / Aldrich. <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="4"> 2 Litres 10X ACSF (sans Mg ou Ca) </td></tr><tr><td> Réactifs </td><td> mM </td><td> g/2L </td><td> Catalogue </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 40 </td><td> 5,96 </td><td> P-9333 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 1280 </td><td> 149,61 </td><td> S-7653 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 210 </td><td> 35,28 </td><td> S-6297 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 5 </td><td> 1,38 </td><td> S-9638 </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> 300 </td><td> 108,12 </td><td> D-9434 </td></tr><tr><td colspan="4"> Ajouter de l'eau distillée à 2L </td></tr></tbody></table> Nous allons également préparer des solutions 1M de MgSO 4 et CaCl 2 dans 50 ml d'eau pour permettre des ajustements en molarité d'une expérience à et pour assurer le calcium demeure en solution. <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="4"> Le calcium et les stocks de magnésium 1M </td></tr><tr><td> Réactifs </td><td> M </td><td> g/50mL </td><td> Catalogue </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 </td><td> 7,35 </td><td> C-5080 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 1 </td><td> 12,33 </td><td> M-5921 </td></tr></tbody></table> La solution doit être aCSF gazés avec carbogène (95% O2 / 5% de CO2) pour abaisser le pH avant d'ajouter du calcium ou le calcium précipité. <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 Litre aCSF </td></tr><tr><td> Réactifs </td><td> Volume </td></tr><tr><td> 10X aCSF </td><td> 100mL </td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 1 ml (dissection) 2mL (enregistrement) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter ~ 800 ml d'eau distillée, de gaz avec carbogène pendant 2 minutes avant d'ajouter du calcium </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter de l'eau distillée à 1L. </td></tr></tbody></table> Les pompes et les tubes et plats dissection doit être rincée avant et après utilisation. Dissection Alors que la dissection, 1 mM de calcium aCSF devrait être continuellement gazés avec carbogène. Le aCSF peut être siphonnée à partir d'une bouteille à l'antenne de dissection et pompée dans le plat à dissection pour la bouteille ou envoyés à des déchets. Nous utilisons un élastomère (Sylgard, Dow Corning) plat recouvert d'effectuer la dissection. La souris néonatales est rapidement décapité avec des ciseaux pointus et une incision faite avec des ciseaux à travers le thorax et l'abdomen ventral. L'animal est ensuite éviscéré. La souris éviscéré est rincé avec aCSF. L'animal est ensuite épinglé à disséquer le plat avec des épingles insectes inséré par les membres antérieurs et à la base de la queue. La colonne vertébrale est enlevé par l'exécution d'une laminectomie ventrale. La colonne vertébrale est tenue avec petits forceps et une lame de petits ciseaux est insérée immédiatement à l'arrière de la colonne vertébrale osseuse. Le limbe est coupé sur un côté puis de l'autre tout en soulevant doucement la colonne vertébrale osseuse. Ceci est effectué pour la longueur de la colonne vertébrale. La moelle épinière est enlevée par une coupe le long de chaque côté de la moelle épinière de couper les racines du nerf rachidien et couper les méninges entourant la moelle épinière. Nous avons coupé sur les côtés droit et gauche, puis on coupe les méninges attaché à la face dorsale de la moelle épinière pour le libérer. Le cordon isolé est ensuite épinglé à plat près de l'entrée aCSF pour assurer une bonne oxygénation, si d'autres animaux sont disséqués. Le cordon médullaire isolée est ensuite transféré dans une boîte d'enregistrement à l'aide d'une petite cuillère ou une spatule. Ici, nous perfuser la préparation avec du calcium oxygéné 2mM aCSF. La moelle épinière est épinglée sur le plat enduit d'élastomère et micromanipulateurs utilisés pour déplacer extracellulaire, l'ensemble des électrodes d'aspiration profondes près des racines. Lorsque l'extrémité de l'électrode est proche de la fin de la racine libre, aspiration douce est appliquée pour attirer la racine dans l'électrode d'aspiration. Ce processus peut être répété pour enregistrer simultanément plusieurs racines. <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Décapitation et éviscération. A. Rapidement décapiter la souris avec des ciseaux pointus. Contributions plus ou moins grande du tronc cérébral peut être réalisé selon le niveau de coupe. B. Lieu une lame des ciseaux dans l'ouverture de la cavité thoracique créé par la décapitation. Ouvrez le thorax et l'abdomen ventrale à la base de la queue. Retirer les viscères et les rincer à l'aCSF. <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Suppression de la colonne vertébrale. A. Insérez la lame gauche de la paire de ciseaux dans l'espace entre la colonne vertébrale et la moelle épinière à la droite de la moelle épinière et couper à travers les os pose ventrale de la moelle. Ensuite, insérez la lame droite de la paire de ciseaux dans l'espace entre la colonne vertébrale et la moelle épinière à la gauche de la moelle épinière et la coupe. B. Répétez ce processus tout en appliquant une légère traction sur la colonne vertébrale. Prenez soin de ne pas percer la moelle épinière en tenant les ciseaux à un angle faible. <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Enlèvement de la moelle épinière. A. Insérez la lame gauche de la paire de ciseaux dans l'espace entre la moelle épinière et les os à la droite de la moelle épinière et couper à travers les racines épinière et les méninges pose latérale de la moelle. Ensuite, insérez la lame droite de la paire de ciseaux dans l'espace entre la moelle épinière et les os à la gauche de la moelle épinière et couper à travers les racines épinière et les méninges pose latérale de la moelle. B. Enfin, soulevez doucement le cordon rostrale et couper les méninges de brancher le cordon dorsal pour les lames. Encore une fois prendre soin de ne pas percer la moelle épinière en tenant les ciseaux à un angle faible. Ne pas couper les racines trop proches de la moelle épinière.

<ol><li>Myers, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+input+is+required+during+embryonic+development+to+mediate+proper+assembly+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits.</a> Neuron. 46, 37-49 (2005).</li>
<li>Goulding, M., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+circuits+that+generate+simple+rhythmic+behaviors+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).</li>
<li>Gallarda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+axial+motor+and+sensory+pathways+via+heterotypic+trans-axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling.</a> Science. 320, (2008).</li>
<li>Gosgnach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V1+spinal+neurons+regulate+the+speed+of+vertebrate+locomotor+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs.</a> Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).</li>
<li>Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+spinal+interneurons+that+coordinate+left-right+locomotor+activity+necessary+for+walking+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements.</a> Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).</li>
<li>Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+functionally+mature+mouse+spinal+cord+preparation+for+the+study+of+spinal+motor+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks.</a> Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).</li>
<li>Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+dual+modulatory+actions+on+spontaneous+postsynaptic+currents+in+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons.</a> J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).</li>
<li>Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+activity-dependent+network+depression+in+the+expression+and+self-regulation+of+spontaneous+activity+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord.</a> J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).</li>
<li>Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride-sensitive+MEQ+fluorescence+in+chick+embryo+motoneurons+following+manipulations+of+chloride+and+during+spontaneous+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity.</a> J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).</li>
</ol>

SOINS DES ANIMAUX<br /&gt;<br /Expériences&gt; sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements stipulés par le Salk Institute for Biological Studies AIACUC.

Le cordon isolées néonatale épinière fournit une méthode souple d&#39;étudier développement1 système nerveux, 2. Au sein de la moelle épinière lombaire des rongeurs nouveau-nés, au centre de circuits générant modèle peut produire la locomotion fictive, en présence de neurotransmetteurs. Cette locomotion fictive consiste à augmenter l&#39;activité rythmique, des éclats, qui sont produites à 0,2 à 0,5 Hz. Ces éclats sont organisés pour produire une alternance gauche-droite le long de l&#39;alternance du cordon et fléchiss...

<table><tbody><tr><td>KCl</td><td></td><td>P-9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>S-7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>S-6297</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td>D-9434</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux grands</td><td>Fine Science Tools</td><td>14070-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Épingles à insectes</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 (Dow-Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiole jaugée de 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiole jaugée de 100 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spinal cord électrophysiologie

Spinal Cord Electrophysiology

Le cordon de souris néonatales épinière est un modèle pour étudier le développement des circuits de neurones et le mouvement locomoteur. Nous démontrons la dissection de la moelle épinière et la préparation du bain d&#39;enregistrement artificielle liquide céphalorachidien utilisés pour des études de locomotion. Une fois disséqué, les racines nerveuses moelle épinière ventrale peut être attaché à une électrode d&#39;enregistrement pour enregistrer les signaux électrophysiologiques des circuits générant motif central de la moelle lombaire.

Une démonstration de l&#39;isolement de la moelle épinière de souris néonatales pour des études électrophysiologiques.

Spinal Cord électrophysiologie

La moelle épinière de souris néonatale est un modèle pour l'étude du développement des circuits neuronaux et du mouvement locomoteur. Nous démontrons que la moelle épinière ...

D'accord. Bonjour, je m'appelle Alan Meyer et je suis assistant de recherche au laboratoire faf de l'Institut Salk. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment réaliser une laminectomie ventrale afin d'isoler la moelle épinière d'une souris. De plus, je vous montrerai comment fixer la moelle épinière sur une électrode. Pour enregistrer son activité neuronale, vous devrez préparer deux solutions pour la moelle épinière : une pour la dissection et une autre pour le bain d'enregistrement.La seule différence entre les deux solutions sera la concentration de chlorure de calcium. Vous devrez d'abord préparer une solution de 10 X-A-C-S-F. Cela nécessitera les réactifs énumérés ci-dessous.Commencez par ajouter 100 millilitres de la solution 10 X-A-C-S-F dans une fiole jaugée d’un litre. Ensuite, remplissez la fiole d’eau, mais laissez de l’espace pour éviter un débordement. Lors de l’embouage, gazéifiez les solutions avec un mélange gazeux à 5 % de CO2 et 95 % de O2.Pour abaisser le pH et oxygéner la solution, ajoutez un millilitre de sulfate de magnésium à une molaire. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de chlorure de calcium à une molaire à la solution de dissection, et ajoutez deux millilitres de chlorure de calcium à une molaire à la solution d’enregistrement. Des souris âgées de E 16,5 à P 4 peuvent être utilisées dans ces expériences.Commencez la dissection de la souris en la décapitant rapidement à l’aide de ciseaux bien aiguisés. Ensuite, incisez le long de la ligne médiane ventrale jusqu’à atteindre la queue. Puis, à l’aide de pinces, éviscérez la souris et rincez-la avec la solution A CSF.Utilisez la solution A de chlorure de calcium à un millimolaire pour effectuer la dissection. Placez la souris dans la boîte de dissection et fixez-la en position en insérant une épingle dans chacune de ses quatre pattes et une épingle à la base de la queue. Notre objectif pour cette étape consistera à isoler la moelle épinière en coupant le long de la ligne pointillée rouge, en séparant la colonne vertébrale de la lame qui entoure la moelle épinière.Cela vous permettra d'exposer la moelle épinière. Ensuite, suivez la ligne pour découper les méninges et les racines spinales, libérant ainsi la moelle épinière. Localisez la colonne vertébrale et utilisez une main avec une pince pour maintenir fermement la colonne vertébrale, tandis que l'autre main tient de petites ciseaux.Pour retirer la moelle épinière, maintenez les ciseaux à un angle faible. Afin d'éviter de percer la moelle avec les pointes des ciseaux, nous allons maintenant disséquer la moelle épinière. En suivant la ligne rouge, incisez les méninges et les racines spinales.Pour retirer la moelle épinière, vous pouvez couper le long de chaque côté du cordon, puis le long de la ligne médiane ventrale. Il est important de maintenir les ciseaux à un angle faible afin de ne pas percer la moelle épinière. Il est essentiel d'éviter de couper les racines trop près de la moelle épinière.Ensuite, transférez la moelle épinière dans le bain d'enregistrement et connectez les électrodes aux racines spinales. Positionnez l'électrode près de la racine. Puis, à l'aide d'une aspiration douce, aspirez délicatement le nerf dans l'électrode.Merci d'avoir regardé cette vidéo et j'espère qu'elle vous sera utile pour vos futurs expériences.

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La moelle épinière électrophysiologie II: fabrication des électrodes extracellulaires d&#39;aspiration

La vidéo démontre la régénération fonctionnelle des connexions propriospinales à l’aide d’un test basé sur un réseau d’électrodes multiples (MEA). Les tranches de moelle épinière sont placées sur le MEA et sont laissées fusionner. Les tranches fusionnées sont séparées mécaniquement en créant une lésion, ce qui incite les neurones propriospinaux à se développer sur la lésion et à relier les tranches. L’activité électrique des tranches est évaluée afin d’identifier la régénération des connexions...

Étude de la régénération des connexions fonctionnelles entre des coupes de moelle épinière à l’aide d’un réseau de multi-électrodes

Cette vidéo présente des enregistrements électrophysiologiques issus de co-cultures organotypiques de coupes de moelle épinière, capturés à l’aide d’un réseau d’électrodes multiples ou d’un dispositif MEA. Ces enregistrements évaluent la régénération neuronale entre les tranches. L’activité électrique synchronisée observée confirme la réussite de la régénération neuronale.

Enregistrements électrophysiologiques pour l’évaluation des régénérations neuronales dans des coupes de moelle épinière co-cultivées

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Mesure vertébrale présynaptique inhibition chez la souris par la racine dorsale enregistrement potentiel<em&gt; In Vivo</em

La propulsion respiratoire centrale est située dans le tronc cérébral. La sortie motrice respiratoire spontanée d’un tronc cérébral-moelle épinière isolé est enregistrée en plaçant une électrode sur la quatrième racine ventrale. Cette approche expérimentale est précieuse pour les investigations pharmacologiques ou l’évaluation des défis respiratoires et des manipulations génétiques sur le comportement moteur rythmique.

Électrophysiologie sur isolés Cord Préparatifs du tronc cérébral-spinal de la naissance Rongeurs Permet Neural respiratoire Réseau d&#39;enregistrement de sortie

Ici, nous présentons un protocole qui est basée sur des tranches de moelle épinière en culture sur des réseaux multi-électrode à étudier la régénération fonctionnelle de connexions propriospinaux in vitro.

Enquêter Régénération fonctionnelle en organotypiques médullaires Co-cultures Cultivé sur des tableaux multi-électrodes

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Ce manuscrit décrit les méthodes pour les enregistrements électrophysiologiques de neurones spinaux des embryons de poisson zèbre et les larves. La préparation maintient les neurones in situ et implique souvent la dissection minimum. Ces méthodes permettent l'étude électrophysiologique d'une variété de neurones de la colonne vertébrale, de l'acquisition de l'excitabilité électrique initiale dans les premiers stades larvaires.

poisson zèbre<em&gt; In Situ</em&gt; Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

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