Mesure du taux plasmatique des protéines membranaires par endocytique Biotinylation réversible

Ce protocole décrit une méthode générale permettant de mesurer la vitesse d'endocytose de la plupart des protéines membranaires plasmiques à l'aide de réactifs perméabilisants membranaires réductibles. Dans cette procédure, les protéines de surface cellulaire contenant des lysines extracellulaires ou marquées de façon covalente sont étiquetées à quatre degrés Celsius avec du sulfo-NHS-SS-biotine, représenté ici en vert. Ensuite, les cellules sont réchauffées à 37 degrés Celsius afin de permettre l'endocytose des protéines de surface. Les cellules sont ensuite replacées à quatre degrés Celsius pour interrompre le trafic membranaire, et le biotine résiduel présent à la surface est éliminé à l’aide d’un agent réducteur qui rompt la liaison disulfure.

Ainsi, les seules protéines biotinylées qui subsistent sont celles qui étaient à l'origine à la surface cellulaire, puis internalisées et protégées de la procédure de décrochage. Enfin, les cellules sont solubilisées et les protéines biotinylées sont isolées par chromatographie d'affinité à la streptavidine. Bonjour, je suis Luke Gabriel du laboratoire de Heli Milk Ian, au Département de psychiatrie de l'École de médecine de l'Université du Massachusetts.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de mesurer les taux d'endocytose ou d'internalisation à l'aide d'une technique de révélation de la biotine réversible. Nous utilisons cette procédure pour mesurer le taux d'internalisation du transporteur de la dopamine. Commençons donc.

Un jour avant l'expérience, préparez les cellules et les substrats à utiliser le jour suivant. Les types cellulaires et les milieux varieront, mais si les cellules expérimentales n'adhèrent pas fortement, utilisez un substrat d'adhérence cellulaire approprié, tel que des plaques de culture tissulaire revêtues de polylysine, sur chacune des six plaques. Sur deux plaques distinctes, étiquetez au total quatre puits.

Pour chaque protéine testée, deux puits sur la plaque témoin seront utilisés comme contrôles de la protéine de surface totale et du retrait. Préparer un puits sur la plaque expérimentale pour chaque condition d'internalisation testée. Ensemencer un fois dix puissance six cellules dans deux millilitres de milieu de culture de manière à ce que les cellules soient environ à 80 % de confluence le jour suivant.

Après la culture des cellules, préparez les solutions suivantes et conservez-les à quatre degrés Celsius pour une utilisation le jour deux. Le PBS deux plus est préparé à partir de solution saline tamponnée au phosphate à un pH de 7,4 et supplémenté avec 1,5 millimolaire de chlorure de magnésium et 0,2 millimolaire de chlorure de calcium. La solution d'arrêt de la tonation est préparée à l'aide du PBS deux plus supplémenté avec 100 millimolaire de glycine. Le tampon NT est composé de 150 millimolaire de chlorure de sodium, 1 millimolaire de EDTA, 0,2 % de BSA et 20 millimolaire de triss à un pH de 8,6. Le tampon Ripa est préparé à l'aide de 10 millimolaire de triss à un pH de 7,4, 150 millimolaire de chlorure de sodium, 1 millimolaire de EDTA, 0,1 % de SDS, 1 % de Triton X-101 et 1 % de désoxycholate de sodium.

Ensuite, préparez une solution mère de biotine SULF N-H-S-S-S en la dissolvant dans du SULFOXYDE ou du DMSO à une concentration de 200 milligrammes par millilitre. Préparez des aliquotes de 500 microlitres et conservez-les à moins 20 degrés Celsius. Les aliquotes peuvent subir plusieurs cycles de congélation-décongélation après ce tris.

Une solution mère de chlorhydrate de deux carboxyéthylphosphine ou TCEP est préparée à une concentration de 500 millimolaire, dissoute dans 50 millimolaires de tris, et le pH est ajusté à 7,4. Étant donné que le TCEP est fortement acide, le pH de la solution doit être ajusté à 7,4 avant de couvrir le TCEP et de l’envelopper dans du papier aluminium, puis de stocker à moins 20 degrés Celsius. Le deuxième jour, préparer le PBS deux plus supplémenté avec 0,18 % de glucose et 0,2 % d’albumine sérique bovine sans protéase IgG ou PBS deux plus GBSA, et préchauffer à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.

Décongeler la solution mère de biotine SFO N-H-S-S-S à température ambiante. Préparer une solution fraîche de biotine soufrée N-H-S-S-S immédiatement avant utilisation en vortexant vigoureusement la solution pour solubiliser le DMSO.

Placez les deux plaques dans un bain de glace dans une pièce froide et rincez chaque puits trois fois avec deux millilitres de PBS glacé contenant deux plus, en maintenant les plaques légèrement inclinées pour assurer un drainage complet du tampon. Après le dernier lavage, ajoutez 0,75 millilitre par puits de la solution fraîche de sulfo-NHS-SS-biotine à chaque puits. Incubez pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius sur le bain de glace avec agitation vigoureuse sur un agitateur orbital, juste avant la fin de l'incubation.

Préparez une autre solution fraîche de biotine SUHO N-H-S-S-S et, au bout de 15 minutes, remplacez l'ancienne solution par la solution fraîche. Incubez encore 15 minutes à quatre degrés Celsius avec agitation vigoureuse sur un agitateur orbital. Après la deuxième incubation, lavez les cellules trois fois rapidement avec deux millilitres de solution d'arrêt afin de bloquer toutes les molécules de biotine NHS non réagies. Incubez ensuite dans deux millilitres de solution d'arrêt pendant 15 minutes.

Remplacer par une solution d'arrêt fraîche au bout de 15 minutes et incuber pendant 15 minutes supplémentaires. Garder les plaques à quatre degrés Celsius avec agitation douce sur un agitateur orbital pendant chaque incubation, tandis que la plaque témoin reste dans la solution d'arrêt sur la paillasse dans la chambre froide. Retirer la plaque expérimentale de la chambre froide et la placer sur un bain de glace à ce stade.

Si des traitements médicamenteux sont testés, ajoutez les concentrations appropriées de médicament au PBS préchauffé deux plus GBSA. Ici, nous utilisons soit un véhicule à l'éthanol, soit un micromolaire d'acétate de quatre balle Myra ou de PMA afin d'activer la voie PKC. Lavez chaque puits de la plaque expérimentale trois fois avec deux millilitres de PBS préchauffé deux plus GBSA, en ajoutant les traitements médicamenteux appropriés après le dernier lavage.

Ajoutez deux millilitres de la solution PBS deux plus GBSA correspondante et remplissez les puits vides avec du milieu préchauffé afin d'assurer une température uniforme sur toute la plaque. Transférez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes juste avant la fin de l'incubation. Préparez une solution de stripping fraîche en utilisant une solution de TCEP 50 millimolaire dans du tampon NT et conservez-la sur de la glace.

Préparez une quantité suffisante d’un millilitre par puits. Après l’incubation de 10 minutes, transférez rapidement la plaque expérimentale dans un bain de glace et ramenez-la en chambre froide. Lavez rapidement les puits expérimentaux trois fois avec deux millilitres par puits de tampon NT glacé pour arrêter l’endocytose.

Ensuite, laver le puits témoin de la révélation trois fois avec deux millilitres de tampon NT glacé. Laisser les puits témoins totaux dans la solution d'arrêt. Ajouter un millilitre de solution de révélation à chaque puits expérimental et au puits témoin de révélation, puis incuber sur glace pendant 15 minutes.

Quatre degrés Celsius avec agitation douce avant la fin de l'incubation. Préparez à nouveau le même volume de solution de décrochage fraîche qu'auparavant. Après 15 minutes, remplacez l'ancienne solution de décrochage par une solution fraîche et incubez encore 15 minutes à quatre degrés Celsius avec agitation douce pour lyser les cellules en premier lieu.

Laver toutes les puits ayant été exposés à la solution de décrochage trois fois avec deux millilitres de tampon NT. Puis laver tous les puits, y compris les témoins totaux, trois fois avec deux millilitres de PBS froid. Ajouter ensuite 300 microlitres de tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéases frais à chaque puits et lyser les cellules par agitation pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Transférez le lysat dans des microtubes de 1,5 millilitre et éliminez les débris cellulaires par centrifugation pendant 10 minutes à 18 000 ×g et à 4 °C. Utilisez un dosage protéique compatible avec vos conditions de lyse, par exemple le dosage des protéines par la méthode BCA de Pierce, pour déterminer la concentration en protéines du lysat par rapport à une courbe étalon d'albumine sérique bovine. Ensuite, préparez les lysats pour la strepte et la chromatographie d'affinité.

Remplir des tubes microfuges de 1,5 millilitre avec des quantités équivalentes de protéines provenant de chaque échantillon. Dans cette expérience, nous isolons des protéines biotinylées à partir de lysats cellulaires de 50 microgrammes. Ajouter du tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéases jusqu'à un volume final de 200 microlitres pour chaque échantillon.

Ensuite, vortexer vigoureusement les billes streptavidine-agarose avant utilisation, puis prélever 20 microlitres de billes streptavidine-agarose à l’aide d’une pipette de 200 microlitres dont l’embout a été coupé, et les ajouter dans chaque tube. Vortexer les tubes et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur rotatif. Le jour suivant, récupérer les billes par centrifugation des échantillons à 18 000 ×g pendant deux minutes à température ambiante, puis aspirer le lysat en prenant soin de ne pas approcher le culot de billes avec l’aspirateur. Ajouter 0,75 millilitre de solution à température ambiante.

Recueillir le tampon dans chaque tube et vortexer à vitesse maximale pour laver les billes. Centrifuger à 18 000 ×g pendant deux minutes. À température ambiante, récupérer les billes et répéter ce cycle de lavage, vortex et centrifugation deux fois supplémentaires, pour un total de trois lavages après le dernier lavage.

Aspirez autant de tampon que possible sans perturber le culot de billes. Ensuite, ajoutez 20 à 25 microlitres de tampon réducteur 2 x à chaque tube. L'agent réducteur clivera la liaison disulfure biotine N-H-S-S-S, libérant les protéines isolées en solution.

Comme la plupart des protéines membranaires ne supportent pas l'ébullition, incubez les tubes sur un agitateur rotatif pendant 30 minutes à température ambiante après la réduction et la dénaturation des protéines. À l’aide d’un gel SDS-PAGE standard, transférez les protéines sur une membrane pour le transfert immuno et révélez-les avec un anticorps approprié. Dans cette expérience, nous utilisons un anticorps anti-DAT de rat provenant de Chécon numéro 3609 à une dilution de 1/2000, puis nous capturons les bandes immunoréactives à l’aide d’un système de documentation de gel équipé d’une caméra CCD, en veillant à ce qu’aucun pixel ne soit saturé. Dans cette expérience, nous utilisons un système d’imagerie BioRad VersaDoc avec le logiciel Quantity One pour quantifier la densité de chaque bande.

Un bloc immuno représentatif issu de la procédure de révélation réversible du transporteur de la dopamine est montré ici. Le signal le plus intense correspond à la quantité totale de protéine membranaire avant l'internalisation, observée dans la voie totale ou T. Le témoin de révélation, ou S, devrait idéalement être proche du blanc et indiquer une efficacité de révélation élevée. L'efficacité de révélation est calculée à l'aide des mesures de densité des bandes dans la formule suivante.

Cette bande dans cette expérience était efficace à 99,8 % ; les bandes dont l'efficacité est supérieure ou égale à 90 % sont optimales et les résultats inférieurs à ce seuil doivent être rejetés. Cet exemple de bande de pore montre une bande visible dans la piste de la bande, avec une efficacité de bande de 34 %. Ici, les bandes de moindre intensité correspondent aux pistes d'internalisation issues de la plaque expérimentale. Les cellules ont été traitées soit avec une solution véhicule, soit avec un micromolaire de PMA pendant une internalisation de 10 minutes, et les taux d'internalisation du transporteur de la dopamine ont été mesurés.

Le taux d'internalisation est calculé à l'aide de mesures de densité des bandes comme suit, tel qu'observé sur ce graphique : 10,4 % du DAT de surface est internalisé en 10 minutes dans des conditions traitées au véhicule. Cependant, le traitement par la PMA augmente les taux d'internalisation du DAT à 23,2 % du DAT total de surface. Vous venez donc de voir comment mesurer les taux d'internalisation des protéines de la membrane plasmique en utilisant une technique de biotinylation réversible.

Il est important de garder à l'esprit deux éléments : préparer fraîchement le réactif de bio-tonation ainsi que le TCP juste avant utilisation. Si vous constatez une perte importante de cellules au cours du protocole, utilisez un substrat d'adhésion cellulaire sur vos plaques. Voilà, c'est tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.