Synapses présynaptique silencieux étudiée en microscopie optique

Certaines terminaisons pré-synaptiques dans le système nerveux central semblent non fonctionnelles ou silencieuses. Nous présentons ici un protocole permettant d'identifier les terminaisons pré-synaptiques silencieuses. Ce protocole peut être appliqué pour identifier des traitements et des manipulations suspectés d'induire le silence ou l'activation de terminaisons.

Le protocole combine le marquage par un colorant vital des vésicules synaptiques pendant la dépolarisation neuronale avec un marquage ultérieur des cellules fixées à l’aide d’un anticorps qui marque tous les terminaux présynaptiques, qu’ils soient silencieux ou actifs. Les synapses marquées à la fois par le colorant et l’anticorps sont actives. Les synapses marquées uniquement par l’anticorps sont silencieuses.

Bonjour, je suis Amanda Taylor du laboratoire du Dr Steve Minick, du département de psychiatrie de l'École de médecine de l'Université de Washington. Je suis Shahin, également du Laboratoire Manic. Aujourd'hui, nous aimerions vous présenter la procédure permettant de visualiser les terminaisons présynaptiques silencieuses à l'aide de neurones hippocampiques en culture.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier comment l'activité électrique et les autres voies de signalisation uniques modulent la libération de neurotransmetteurs. Commençons donc. Dans une hotte à flux laminaire stérile, utilisez HIPA pour obtenir des rats ou des souris de 0 à 3 jours après la naissance afin de préparer des cultures cellulaires dissociées.

Selon notre protocole publié, nos cultures sont des cultures gliales mixtes dérivées des mêmes cellules issues de la dissection qui doivent être ensemencées dans des boîtes stériles de 35 millimètres de diamètre, chacune contenant un lamelle de numéro zéro recouvert de collagène à une concentration de cinq milligrammes par millilitre. Les neurones doivent être ensemencés à une densité d'environ 500 cellules par centimètre carré.

12 rats nouveau-nés donneront généralement 30 à 35 boîtes de 35 millimètres. Laisser les cultures croître dans une étuve à culture pendant 10 à 14 jours. Pour le développement et la maturation synaptiques, ajouter l'anti-mitotique a C afin d'arrêter la croissance gliale au quatrième jour in vitro.

Également au cinquième jour in vitro, effectuez un changement partiel de milieu avec un milieu neurobasal enrichi du supplément B 27 afin d'améliorer la survie neuronale durant cette période de maturation. Introduisez des traitements modifiant le nombre de synapses silencieuses en position présynaptique. Nous avons constaté qu'une méthode pratique pour rendre silencieux un grand pourcentage de synapses glutamatergiques consiste en un traitement de quatre heures avec 30 millimolar de potassium.

Lorsque les cultures sont matures, les neurones doivent présenter une densité relativement faible avec des prolongements neuritiques bien séparés et étendus. Retirer les cultures de l'incubateur et les apporter sur le plan de travail. Remplacer le milieu de culture par une solution saline tamponnée contenant 45 millimolaire de chlorure de potassium et 10 micromolaire de colorant FM 1 43 FX.

Cette solution devrait également contenir du NBQX et de la PV afin d'empêcher la signalisation récurrente. Il est important de maintenir la solution mère de FM 1 43 FX et les expériences à l'abri de la lumière pour éviter la photodégradation. Recouvrez donc les boîtes de culture avec du papier d'aluminium pour toutes les étapes d'incubation ultérieures.

Incuber exactement deux minutes à température ambiante. Éliminer la solution de colorant et laver uniquement de trois à cinq secondes dans du chlorure de sodium tamponné contenant 500 micromolaire d'adversive.Seven. Pour éliminer le colorant non spécifique, le chronométrage à cette étape est critique.

Une exposition prolongée à l'adv adverse F7 éliminera tout le marquage FM 4-64 FX. Laver ensuite les cellules par deux intervalles de cinq minutes avec du tampon salin tamponné sans adv adverse. Sept dans une hotte chimique.

Fixer les cultures dans du paraformaldéhyde 4 % et du glutaraldéhyde 0,2 % dans du PBS pendant 10 minutes. Rincer brièvement les cellules avec du PBS. Les cellules peuvent désormais être déplacées hors de la hotte.

Ajouter une solution de blocage contenant 4 % de sérum de chèvre normal et 0,04 % de Triton X pour réduire le fond et permeabiliser les cellules en vue d'une immunomarquage. Incuber pendant 15 minutes. Marquer les cellules avec l'anticorps primaire vlu T dilué au 1/2000 dans la solution de blocage.

Incuber les cultures avec l'anticorps sous agitation douce pendant trois heures. Laver les cellules quatre fois avec du PBS. Incuber les cellules avec Alexa.

Anticorps anti-cochon d'Inde conjugué à 647 dilué au 1/500 dans la solution de blocage. Maintenir les cultures dans l'anticorps secondaire avec agitation douce pendant 30 minutes. Laver les cellules quatre fois supplémentaires avec du PBS.

Déposez une petite goutte de prélèvement au sol sur une lame en verre propre à l’aide de pinces. Prenez une lamelle et abaissez-la doucement sur la goutte de cellules de prélèvement au sol, face à la lame. Laissez sécher la lame toute la nuit.

Préparez un objectif à immersion huile 60 x sur un microscope confocal à balayage laser. Placez une lame sur la platine de sorte que le couvre-objet soit orienté vers l'objectif. Recherchez un champ de neurites qui ne soit pas trop dense et qui soit éloigné du soma, lequel peut retenir un colorant résiduel.

Zoomer sur un champ de 51 par 51 micromètres. À l’aide d’un logiciel d’acquisition d’image, acquérir une pile Z couvrant une profondeur de 7,8 micromètres en 27 pas de 0,3 micromètre chacun.

Effectuez d'abord une analyse avec l'anticorps VLU T one afin d'identifier toutes les synapses glutamatergiques présentes dans le champ. Ensuite, effectuez une nouvelle analyse pour la fluorescence de FM 1 43 FX afin d'analyser les images après leur acquisition. Utilisez un logiciel d'analyse pour convertir la pile Z en une image composite monoplan basée sur la lecture d'intensité maximale provenant de n'importe quel plan pour chaque seuil défini par pixel.

Pour réduire le bruit de fond, identifiez les terminaisons VGluT1 sans tenir compte de la coloration au FM 1-43. Marquez ensuite ces ponctuations comme régions d'intérêt. Nous sélectionnons généralement 10 ponctuations par champ.

Répétez le seuillage et la sélection des points sur l'image des effets FM 1 43 et superposez les images pour identifier les synapses silencieuses. Un critère absolu de pixels ou un critère de pourcentage de pixels peut être utilisé pour distinguer les synapses FM 1 43 positives actives des synapses FM 1 43 négatives inactives. Dans nos cultures, nous constatons que 70 à 80 % des synapses glutamatergiques définies par la coloration V glut un présentent une coloration FM 1 43 détectable sur les images superposées de la fluorescence verte FM 1 43 et de la coloration rouge V glut un.

Cela est évident par une abondance de synapses ponctuées jaunes avec des marqueurs colocalisés. Ceux-ci sont indiqués par les flèches. Environ 20 à 30 % des ponctuations positives pour la Vglut1 rouge n'auront pas de fluorescence verte au FM 1-43 supérieure au niveau de base.

Il s'agit des terminaisons présynaptiques inactives, et un exemple est indiqué par la flèche. Une troisième population de synapses sera également observée. Celles-ci sont positives pour la fluorescence verte du FM 1 43, mais dépourvues de la coloration rouge du B glut un.

Il s'agit de synapses GABAergiques actives, dont un exemple est indiqué par l'astérisque. Elles sont exclues de la plupart de nos analyses, mais peuvent être étudiées explicitement à l'aide d'un anticorps dirigé contre le transporteur vésiculaire de GABA. À la place de l'anticorps VLU T un, nous venons de vous montrer comment visualiser les synapses silencieuses présynaptiques en utilisant le FM 1 43 et l'immunomarquage de la VLU un.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que le FM 1 43 FX est sensible à la fois à la durée du lavage dans l'adver sub seven et à la concentration de X 100 traitant incluse dans la solution de blocage. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.