Synapses présynaptique silencieux étudiée en microscopie optique

Certaines terminaisons présynaptiques du système nerveux central semblent non fonctionnelles ou silencieuses. Nous présentons ici un protocole d’identification des terminaisons présynaptiques silencieuses. Ce protocole peut être appliqué à l’identification des traitements et des manipulations suspectés de faire taire ou de réveiller les terminaux.

Le protocole combine le marquage par colorant vital des vésicules synaptiques pendant la dépolarisation neuronale avec le marquage ultérieur des cellules fixées avec un anticorps qui marque toutes les terminaisons présynaptiques, à la fois silencieuses et actives. Synapsis. Co-marqués avec un colorant et des anticorps sont actifs. Les synapses marquées uniquement par des anticorps sont silencieuses.

Bonjour, je suis Amanda Taylor du laboratoire du Dr Steve Minick du Département de psychiatrie de la Faculté de médecine de l’Université de Washington. Je m’appelle Shahin et je travaille également au Manic Lab. Aujourd’hui, nous aimerions montrer votre procédure pour visualiser les terminaisons présynaptiques silencieuses à l’aide de neurones hippocampiques en culture.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier comment l’activité électrique et les autres voies de noling unique modulent la libération de neurotransmetteurs. Alors commençons. Dans une hotte à flux laminaire stérile, utilisez HIPA ne peut pas acheter du jour zéro postnatal à trois rats ou souris pour préparer des cultures cellulaires dissociées.

Selon notre protocole publié, nos cultures sont des cellules gliales mixtes Les cultures dérivées de la même dissection cellules doivent être plaquées dans des boîtes stériles de 35 millimètres. Chacun contenant une fiche de recouvrement numéro zéro qui a été recouverte de cinq milligrammes par millilitre de plaque de collagène. Les neurones à une densité approximative de 500 cellules par centimètre carré.

12 petits rats donneront généralement des paraboles de 30 à 35 millimètres. Laissez les cultures pousser dans un incubateur de cultures pendant 10 à 14 jours. Pour le développement synaptique et la maturation, ajoutez l’anti-mitotique a C pour arrêter la croissance gliale au quatrième jour in vitro.

Également le cinquième jour, in vitro, effectuez un échange de demi-milieu avec un milieu neurobasal plus un supplément de B 27 pour améliorer la survie neuronale pendant cette période de maturation. Introduire des traitements qui modifient le nombre de synapses présynaptiquement silencieuses. Nous constatons qu’un moyen pratique de réduire au silence un grand pourcentage des synapses de glutamate est un traitement de quatre heures avec 30 millimolaires de potassium.

Lorsque les cultures sont matures, les neurones doivent avoir une densité relativement faible avec des processus névrotiques bien séparés et étendus. Sortez les cultures de l’incubateur et apportez-les sur le banc. Remplacer le milieu de culture par une solution saline tamponnée contenant 45 millimolaires de chlorure de potassium et 10 micromolaires de FM 1 43 filière FX.

Cette solution doit également contenir NBQX et A PV pour éviter les signalisations récurrentes. Il est important que la solution mère et les expériences du FM 1 43 FX soient conservées dans l’obscurité pour éviter le photoblanchiment. Couvrez donc les boîtes de culture avec du papier d’aluminium pour toutes les étapes d’incubation ultérieures.

Incuber pendant exactement deux minutes à température ambiante. Retirez la solution de colorant et lavez pendant seulement trois à cinq secondes dans une solution saline tamponnée en tas avec un adversif de 500 micromolaires. Sept. Pour éliminer le colorant non spécifique, le moment de cette étape est essentiel.

Comme une exposition prolongée à adv adverse F seven supprimera tout l’étiquetage FM 43 FX. Ensuite, lavez les cellules et les tas de solution saline tamponnée sans adv défavorable. Sept pour cinq à deux minutes d’intervalle dans une hotte chimique.

Fixez les cultures dans du paraldéhyde à 4 % et du glutaraldéhyde à 0,2 % dans du PBS pendant 10 minutes. Lavez brièvement les cellules avec du PBS. Les cellules peuvent maintenant être retirées de la hotte.

Ajouter une solution bloquante contenant 4 % de sérum de chèvre normal et 0,04 % de tritton X pour réduire le bruit de fond et perméer les cellules pour l’immunocoloration. Incuber pendant 15 minutes. Colorer les cellules avec un anticorps vlu T un dilué à un à 2000 dans une solution bloquante.

Incuber les cultures dans des anticorps avec un léger balancement pendant trois heures. Lavez les cellules quatre fois avec du PBS. Incuber les cellules avec Alexa.

6 47 anticorps conjugués anti-cobaye dilués à un à 500 dans une solution bloquante. Maintenez les cultures dans l’anticorps secondaire avec un léger balancement pendant 30 minutes. Lavez les cellules quatre fois de plus avec du PBS.

Placez une petite goutte de quantité de sol sur une lame de verre propre à l’aide d’une pince. Prenez une lamelle et abaissez-la doucement sur la chute des cellules du sol face à la lame. Laissez la lame sécher pendant la nuit.

Préparez un objectif à huile 60x sur un microscope confocal à balayage laser. Placez une diapositive sur la scène de manière à ce que le lamelle soit face à l’objectif. Trouvez un champ de neurites qui n’est pas trop dense et qui est éloigné du soma qui peut retenir le colorant résiduel.

Zoomez sur une taille de champ de 51 x 51 microns. À l’aide d’un logiciel d’acquisition d’images. Acquérez une pile ZS couvrant une profondeur de 7,8 microns sur 27 pas de 0,3 micron pour chaque étape.

Recherchez d’abord l’anticorps VLU T one pour identifier toutes les synapses glutamatergiques sur le terrain. Ensuite, recherchez à nouveau la fluorescence FM 1 43 FX pour analyser les images après l’acquisition. Utilisez un logiciel d’analyse pour convertir l’amure Z en une image composite à plan unique basée sur la lecture de l’intensité maximale de n’importe quel plan à chaque seuil de pixel défini.

Pour réduire l’arrière-plan, identifiez les bornes VG glu T one sans référence à la coloration à effets FM 1 43. Et marquez ces points comme des régions d’intérêt. Nous sélectionnons généralement 10 PUNTA par champ.

Répétez la sélection de seuillage et de puncta sur l’image d’effets FM 1 43 et superposez les images pour identifier les synapses silencieuses. Un critère de pixel absolu ou un critère de pourcentage de pixel peut être utilisé pour distinguer les synapses FM 1 43 positives actives des synapses négatives FM 1 43 inactives. Dans nos cultures, nous constatons que 70 à 80 % des synapses de glutamate définies par la coloration V glut one présentent une coloration FM 1 43 détectable dans les images superposées de fluorescence FM 1 43 verte et de coloration V glut one rouge.

Cela est évident comme une abondance de synapses puncta jaunes avec des marqueurs colocalisés. Ceux-ci sont indiqués par les flèches. Environ 20 à 30 % de la surabondance de V rouge un point positif ne parviendra pas à avoir une fluorescence FM 1 43 verte supérieure à la ligne de base.

Il s’agit des terminaisons présynaptiques inactives dont un exemple est indiqué par la pointe de la flèche. Une troisième population de synapses sera également observée. Ceux-ci sont positifs pour la fluorescence FM 1 43 verte, mais dépourvus de coloration rouge B glut un.

Il s’agit de synapses GABAergiques actives et un exemple est indiqué par l’astérisque. Ceux-ci sont exclus de la plupart de nos analyses, mais peuvent être explicitement étudiés à l’aide d’un anticorps vésiculaire transporteur de GABA. À la place de l’anticorps VLU T one, nous venons de vous montrer comment visualiser des synapses présynaptiquement silencieuses à l’aide de l’immunocoloration FM 1 43 et VLU one.

Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler que FM 1 43 FX est sensible à la fois au temps passé dans l’adver sub seven wash et à la concentration du traitement X 100 inclus dans la solution de blocage. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.