Double Recordings somatiques de la gonadolibérine (GnRH) neurones identifiés par Green Fluorescent Protein (GFP) en tranches hypothalamiques

Cette vidéo décrit une procédure pour effectuer des enregistrements de cellules doubles à partir de neurones de l’hormone de libération des gonadotrophines. Les coupes de cerveau hypothalamique sont préparées en orientation coronale ou sagittale. Les coupes sont ensuite visualisées à l’aide d’un objectif d’immersion et des pipettes sont positionnées sur deux neurones.

Des joints à faible résistance sont formés en relâchant une pression positive, puis en appliquant une pression négative sur la cellule de la membrane somatique. Des enregistrements joints peuvent ensuite être réalisés. Bonjour, je m’appelle Kelly Suiter.

Bienvenue dans mon laboratoire du département de biologie de l’Université du Texas à San Antonio. Je suis Peter Heman du Suitor Lab. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour obtenir des enregistrements somatiques doubles à partir de neurones hormonaux libérant des gonadotrophines et des tranches hypothalamiques de souris.

Nous utilisons cette procédure dans mon laboratoire pour étudier le déchargement coordonné dans les neurones du BNB. Alors commençons. Commencez la procédure en retirant le cerveau d’une souris euthanasiée par décapitation sous anesthésie au fluor.

La souris utilisée dans la procédure d’aujourd’hui exprime une protéine fluorescente verte sous la régulation du promoteur peptidique GNRH, qui est exprimé exclusivement dans les neurones GNRH. Après l’ablation, placez le cerveau dans du liquide céphalo-rachidien artificiel froid ou un LCR A. Placez le cerveau sur sa surface dorsale pour exposer l’hypothalamus tout au long de la procédure de blocage.

Humidifiez continuellement le cerveau avec du LCR froid à l’aide d’une pipette en verre. Pour préparer une tranche sagittale, utilisez une lame de rasoir pour retirer le cervelet. Retirez ensuite les régions latérales du cerveau.

Les parties rostrales du cortex fournissent le support pour le tranchage du cerveau et pour le placement de fils d’argent pour sécuriser le cerveau. Dans l’enregistrement, placez ensuite une petite quantité de superglue sur la plate-forme de coupe. À l’aide d’une spatule, soulevez le cerveau, apportez une lingette Kim à la surface de la spatule et éloignez l’excès de LCR A du cerveau.

Ensuite, à l’aide d’une lame de rasoir, faites glisser doucement le cerveau vers l’avant sur la colle. Il est important d’éviter de toucher ou d’appuyer sur le cerveau pendant le transfert. Le poids du cerveau lui-même devrait être suffisant pour le fixer.

Fixez le cerveau et la plate-forme de coupe à un microtome vibrant et remplissez bien la coupe avec du LCR A froid. La solution froide raffermit le cerveau en le protégeant des dommages Pendant la procédure de coupe, coupez lentement les tranches. Chaque tranche doit flotter librement loin du cerveau.

Retirez les tranches de la chambre de coupe au fur et à mesure qu’elles sont coupées et placez-les dans une chambre d’incubation de tranches alimentée en continu en oxygène, en utilisant un mélange de 95 % d’oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone dans un bain d’eau chaude, à environ 32 degrés Celsius pendant une à deux heures. Continuez à couper les tranches et à les placer dans la chambre d’incubation. Si les tranches commencent à s’enrouler pendant la coupe, ralentissez la vitesse à laquelle la lame avance.

À l’aide d’un extracteur vertical, préparez des pipettes en verre. Une pointe uniformément effilée avec une ouverture de 0,1 millimètre est recommandée. Ensuite, à l’aide d’une deuxième couche de pipette, les pipettes avec Sard 180 4 pour réduire la capacité.

Ensuite, à l’aide d’un pistolet thermique, polymérisez les pointes protégées du seuil. Ajouter une petite quantité de jaune de Lucifer à une aliquote de 0,5 millilitre de solution intracellulaire décongelée et sonicate. La solution doit apparaître jaune.

Remplissez la pipette avec la solution intracellulaire jaune. Cela permettra de visualiser les pointes à l’aide d’un filtre GFP pendant la procédure d’enregistrement de la pince. Après avoir incubé des tranches pendant une à deux heures, retirez-en une de la chambre d’incubation et déplacez-la dans la chambre d’enregistrement.

Chargez les pipettes remplies d’intracellulaire jaune Lucifer dans les porte-pipettes de chaque étage de tête. Fixez ensuite une seringue vide de trois millilitres à chaque porte-pipette à l’aide d’un morceau de tube. Ceux-ci seront utilisés pour appliquer une pression positive afin d’éviter l’obstruction des pipettes pendant la procédure.

À l’aide du filtre GFP, visualisez les pointes de pipette. Assurez-vous que la tranche comporte plus de quatre neurones de qualité d’enregistrement. Un neurone de bonne qualité aura la forme d’une poire.

Les neurones très ronds, ainsi que les neurones ratatinés sont généralement en train de mourir. Sélectionnez deux neurones pour l’enregistrement, les neurones sélectionnés se trouvent souvent à des niveaux différents de la tranche. À l’aide du logiciel de l’ordinateur, réglez la pince Axo pour qu’elle soit un amplificateur afin de transmettre les impulsions d’injection de courant.

Puis, à l’aide d’une position de manipulateur microm, la première pipette sur la plus grande surface du neurone, c’est-à-dire la plus profonde en position de tranche, la deuxième pipette sur le neurone plus superficiel. Cela évitera que le positionnement de la deuxième pipette ne décale le positionnement de la première pipette. Comme la tranche se déplacera légèrement dans le plan vertical sous forme de pipettes, entrez ensuite dans la tranche, abaissez la première pipette sur le premier neurone et appliquez immédiatement une pression positive à l’aide de la seringue.

La pression positive induira une petite fossette à la surface de la cellule. Une fois la première pipette placée, revenez en haut de la chambre d’enregistrement et abaissez à nouveau la deuxième pipette d’enregistrement en position en appliquant une pression positive à l’aide de la seringue. Une fois les deux pipettes placées, scellez le premier neurone en retirant la seringue pour libérer la pression positive.

Les membranes des neurones sains adhèrent à la pipette. Ensuite, en utilisant une petite quantité d’aspiration buccale, appliquez du négatif pour former un joint avec la résistance appropriée. Si un joint n’est pas réussi à être généré entre la pipette et le neurone, soulevez l’objectif du microscope et la pipette loin de la surface de la tranche vers le haut de la perfusion.

Eh bien, remplacez la pipette usagée par une pipette propre. Une fois la pipette changée, retournez dans la tranche et générez un joint à l’aide de la nouvelle pipette. Une fois qu’un joint lâche a été établi en fonction de la résistance, terminez les impulsions d’injection de courant de la pince Axo pour être amplifiées.

Placez la pince Axo à amplifier en série avec l’amplificateur AM systems 3000 de sorte que la sortie de l’amplificateur OC clamp deux B serve d’entrée pour l’amplificateur AM systems 3000. Ce dernier amplificateur fournit le signal pour l’acquisition de données. Ensuite, établissez un joint pour le deuxième neurone et reconfigurez les amplificateurs.

Une fois que les joints ont été établis avec les deux pipettes, commencez à mesurer directement les potentiels d’action par acquisition de données. Le jaune de Lucifer a été utilisé uniquement pour augmenter la visualisation afin de démontrer la technique du double enregistrement. Cependant, le jaune de Lucifer est toxique pour les neurones et modifie l’inactivation des courants sodiques, qui sous-tendent le potentiel d’action si l’on rompt les scellés pour remplir les neurones.

Ainsi, dans notre méthode, Alexa 5 68 est utilisé dans des expériences suite à l’enregistrement, le sceau peut être rompu, permettant aux neurones d’être remplis d’Alexa 5 68 pour l’histologie ultérieure. La méthode d’enregistrement cellulaire présentée dans cette vidéo a été validée par l’enregistrement traditionnel simultané de cellules entières et l’enregistrement cellulaire des neurones de l’hormone de libération des gonadotrophines. Comme le montre ici, il y a un accord complet entre les potentiels d’action dans l’enregistrement attaché à la cellule et l’enregistrement de la cellule entière pendant le tir spontané lent et le tir répétitif.

Dans le panneau de gauche, les réponses dans la configuration d’enregistrement de la cellule attachée et de la cellule entière à l’application d’une faible fréquence d’activation simulée du récepteur de type AMPA sont illustrées. Notez que chaque potentiel d’action dans la configuration d’enregistrement attaché à la cellule est associé à un potentiel d’action correspondant dans l’ensemble de l’enregistrement de cellule. Le panneau de droite montre la réponse du neurone à une rafale à haute fréquence d’activation simulée d’un récepteur de type AMPA indiquée par la ligne pointillée.

Notez l’augmentation de la fréquence du potentiel d’action détectée à la fois dans la configuration d’enregistrement attachée à la cellule en réponse à la rafale stimulée de l’entrée et dans la configuration d’enregistrement de cellule entière, la trace G élargit l’échelle de temps de la partie de l’enregistrement montrée en D sous cette ligne pointillée lorsque la fréquence d’activation des récepteurs de type AMPA simulés est augmentée. Enfin, il y a accord entre l’enregistrement de la cellule attachée et l’enregistrement de la cellule entière. Lorsqu’une impulsion d’injection de courant dépolarisant est appliquée pour amener le neurone à décharger des potentiels d’action.

Ce panneau montre la réponse du neurone A-G-N-R-H à une impulsion d’injection de courant dans la configuration d’enregistrement attachée à la cellule et dans l’enregistrement de la cellule entière. L’encart dans la trace centrale élargit la forme d’onde du potentiel d’action détecté. Notez que chaque potentiel d’action détecté dans la configuration attachée à la cellule a un potentiel d’action correspondant détecté dans l’ensemble de la configuration d’enregistrement de cellule.

Nous venons de vous montrer comment faire des enregistrements somatiques doubles en tranches hypothalamiques lors de cette procédure. Il est important de se rappeler que cela demande de la pratique. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.