Observation directe d'ADN Enzymes réplication via un ADN simple molécule Stretching Assay

Cette vidéo présente un protocole de visualisation de la réplication de l’ADN par microscopie optique à champ large, lambda linéarisé et chimiquement modifié. L’ADN est attaché à une lamelle en verre fonctionnalisé. L’extrémité libre de l’ADN est marquée par des billes et l’ADN est étiré par un flux laminaire.

Lorsque la réplication est initiée, le brin avant commence à s’allonger et le brin retardé se raccourcit en raison de l’enroulement. La grande différence de longueur entre l’ADN double brin et l’ADN simple brin à faible force permet une observation directe des conversions d’ADN pendant la réplication. La longueur de la construction de l’ADN est surveillée en suivant la position de la bille, ce qui permet de déterminer avec précision le taux et le processus de réplication de l’ADN.

Bonjour, je suis Ari Ulrich des Laboratoires d’Anto one Vanian et Charles Richardson du Département de Chimie Biologique et de Pharmacologie Moléculaire de la Harvard Medical School. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’imagerie de la réplication de l’ADN au niveau moléculaire unique. Nous utilisons cette procédure dans nos laboratoires pour étudier les activités enzymatiques qui ont lieu lors de la synthèse de l’ADN.

Alors commençons : Au début de cette procédure. L’ADN Lambda du phage de bactéries linévarisées est modifié par des oligonucléotides agenouillés pour former une fourche de réplication, un bras de fourche complémentaire lambda, un bras de fourche biotinylé et une amorce de fourche. L’avant-bras de la fourche biotinylée contient un t de biotine attaché à ses cinq extrémités principales, ce qui permet l’attache de la matrice d’ADN à la surface de la cellule d’écoulement.

L’ADN lambda est en outre modifié par recuit, un autre oligonucléotide qui contient un diggen et une fraction servant d’immuno-marqueur de haute affinité pour la fixation d’une bille. Pour générer la fourche de réplication, il faut obtenir de l’ADN lambda en plus de plusieurs oligonucléotides dont on retrouve les séquences dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo. Ces oligonucléotides comprennent un bras de fourche biotinylé, un bras de fourche complémentaire lambda, une amorce de fourche et un diggen et une extrémité de diggen et d’extrémité de type de commutation de type lambda.

Mélangez ensuite le bras de fourche complémentaire lambda phosphorylé, le bras de fourche biotinylé, l’amorce de fourche et l’ADN lambda dans le rapport molaire de 10 à 10 à 100 pour un. Dans le tampon T quatre ADN ligase, chauffez le mélange à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes et refroidissez lentement à température ambiante en éteignant le bloc chauffant pour permettre un recuit correct des oligonucléotides et de l’ADN ligase T quatre au mélange et incubez pendant deux heures. À température ambiante, l’ADN ligase T quatre catalysera le scellement des entailles entre les oligonucléotides et le lambda.

Enfin, l’ADN ajoute la diggen complémentaire lambda et se termine à la matrice de réplication de l’ADN en ajoutant la diggen complémentaire lambda phosphorylée et se termine par un tampon T quatre Ligase, incube le mélange pendant 30 minutes à 45 degrés Celsius et à nouveau, refroidit lentement à température ambiante en désactivant le bloc thermique, ligature la Lambda complémentaire phosphorylée, dig oxygène et termine la matrice de réplication de l’ADN en ajoutant T quatre ADN ligase au mélange et Incuber pendant deux heures à température ambiante. Le modèle final de réplication de l’ADN est maintenant prêt à l’emploi. Afin de fixer les billes magnétiques activées par le gland à la matrice de réplication de l’ADN, elles doivent être fonctionnalisées avec un fragment FAB spécifique du digo genin.

Pour commencer ce processus, mettez à nouveau en suspension la solution mère de billes et transférez 400 microlitres dans un tube einor. Placez le tube dans un séparateur magnétique et incubez jusqu’à ce que la solution s’éclaircisse. Pour activer les groupes toal pour le couplage des anticorps, ajoutez un millilitre de tampon boïde et mélangez doucement par pipetage.

Encore une fois, retirez le surnageant à l’aide d’un séparateur magnétique. Ensuite, ajoutez 240 microlitres de fragment de FAB et remettez les billes en suspension dans 400 microlitres de tampon de borate. Bien mélanger et laisser incuber sur un rotateur pendant 16 à 24 heures à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, séparez les billes à l’aide du séparateur magnétique et retirez le surnageant. Lavez les billes avec un millilitre de tampon de lavage et incubez pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, retirez le tampon à l’aide du séparateur magnétique. Ce lavage est répété deux fois.

Pour bloquer les groupes tosil libres, ajoutez un millilitre de BSA contenant du tampon tris et incubez pendant quatre heures à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, retirer le tampon des billes à l’aide d’un séparateur magnétique, laver deux fois avec un tampon et un aliquote. Pour l’utilisation, l’ADN à répliquer est attaché à des lamelles en verre fonctionnalisées avec Amil lane.

Le groupe oxy de la voie Amil se lie au verre, laissant un amin disponible pour la liaison aux molécules de cheville biotinylées. Ce revêtement aide à réduire les liaisons non spécifiques à la surface. Pour bien nettoyer les lamelles en verre, placez-les dans des bocaux tachés et remplissez les bocaux de sonicate d’éthanol.

Pendant 30 minutes, rincez les bocaux et remplissez-les d’une molaire d’hydroxyde de potassium sonicate pendant 30 minutes et répétez les deux lavages. Pour la première réaction de fonctionnalisation, toutes les traces d’eau doivent être éliminées. Remplissez les pots de coloration d’acétone et de sonicate pendant 10 minutes.

Videz les bocaux et remplissez-les à nouveau d’acétone. Procédez à l’ajout du réactif sinus dans les bocaux et agitez pendant deux minutes. Ensuite, trempez avec un grand excès d’eau.

Séchez ensuite les lamelles en les faisant cuire à 110 degrés Celsius au four pendant 30 minutes. Ensuite, préparez le mélange de chevilles à environ 0,2 % de poids par volume. Une cheville biotinylée, y compris une entretoise en verre, permettra de séparer les lamelles de couverture, pipette 100 microlitres sur une lamelle sèche siloisée.

Placez une deuxième lamelle sur le dessus. Incuber les lamelles dans la solution PEG pendant trois heures. Ensuite, séparez chaque paire de lamelles et lavez-les abondamment à l’eau.

Veillez à garder les lamelles fonctionnalisées vers le haut car un seul côté sera recouvert d’une cheville. Enfin, séchez les lamelles à l’air comprimé et stockez-les sous vide Dans un dessiccation, les surfaces restent stables pendant au moins un mois. Ainsi, des dizaines de lamelles peuvent être fabriquées en un lot et utilisées au besoin.

Maintenant que les lamelles sont prêtes, on peut assembler la chambre d’écoulement pour l’expérience sur une molécule unique. L’expérience sur une seule molécule est réalisée à l’aide d’une simple chambre d’écoulement construite avec une lamelle fonctionnalisée, du ruban adhésif double face, une diapositive d’un quart et un tube. Une chambre d’écoulement est préparée pour chaque expérience moléculaire.

Commencez par mélanger cinq millilitres de tampon de blocage et 20 millilitres de tampon de travail et placez le mélange dans un dessiccation pour éliminer toutes les bulles d’air pour les étapes ultérieures. Ensuite, étalez 100 microlitres d’une solution de travail de strp din dans PBS sur la surface de la cheville fonctionnalisée Cover slip incuber pendant 20 minutes à température ambiante pour permettre à strp din de lier la biotine de surface. Pendant ce temps, coupez un morceau de ruban adhésif double face pour correspondre à la taille de la glissière de quartz, marquez la position des trous de tube sur le ruban.

Délimitez la chambre d’écoulement en dessinant un canal central de trois millimètres de large et des rectangles contenant les deux trous. Les chambres d’écoulement peuvent être conçues avec deux canaux d’entrée et deux canaux de sortie en forme de Y. Coupez maintenant le ruban marqué le long du contour dessiné, en faisant des coupes droites et nettes pour être sûr qu’aucun adhésif ne dépasse dans le canal.

Nettoyez soigneusement la lame de quartz à l’aide d’acétone pour enlever l’adhésif de la construction des cellules d’écoulement utilisée dans les expériences précédentes. Trouvez le meilleur alignement du contour du canal. Retirez un côté du support adhésif et placez soigneusement le ruban adhésif sur la glissière du terrain.

Veillez à bien aligner le ruban car les trous d’entrée et de sortie doivent rester débloqués. Ensuite, préparez les longueurs de coupe de tube de 0,76 millimètre de diamètre intérieur pour l’entrée et la sortie de la cellule d’écoulement. Coupez l’extrémité du tube à un angle d’environ 30 degrés afin que le tube n’appuie pas à plat contre le fond de la chambre.

Suspendez le tube sur des supports de tubes à essai pour une fixation facile à la cellule d’écoulement dans les étapes suivantes. À présent, l’incubation de la lamelle de couverture devrait être terminée. Rincez la housse, glissez-la abondamment à l’eau et séchez-la à l’air comprimé.

Attention à ne pas retourner la cale car un seul côté est fonctionnalisé avec une cheville. Terminez l’assemblage de la chambre d’écoulement en retirant l’autre côté du support du ruban et en plaçant la glissière de quartz sur la lamelle de recouvrement Appuyez légèrement sur la lamelle pour expulser tout air emprisonné dans l’adhésif. Cela aidera à empêcher les bulles d’air de pénétrer dans le canal d’écoulement.

Scellez les côtés de la chambre avec de l’époxy. Insérez le tube coupé dans les trous du quartz et scellez-le en place avec l’époxy. Laissez sécher quelques minutes.

Une fois sec, utilisez une aiguille de calibre 21 pour tirer une partie du tampon de blocage DGA à travers l’un des tubes afin de bloquer la surface de la chambre. Rincez plusieurs fois pour éliminer les bulles d’air et laissez la chambre incuber pendant au moins 30 minutes avant de passer à l’expérience de réplication d’une molécule unique. Une fois que les billes fonctionnalisées de la matrice d’ADN et la chambre d’écoulement ont été préparées, une expérience sur une seule molécule peut être réalisée.

Pour commencer, placez la cellule d’écoulement sur la platine du microscope. Maintenez la chambre en place à l’aide de clips de platine et assurez-vous que le canal d’écoulement est positionné dans l’alignement de la caméra CCD. Connectez-vous à l’air préalablement construit qui ressort à la pompe à seringue et aux tubes de sortie de la cellule d’écoulement.

À l’aide d’un tube de connecteur de plus grand diamètre, placez les tubes d’entrée de la cellule d’écoulement dans le tampon de blocage et tirez sur la seringue pour éliminer toutes les bulles d’air des tubes, effleurez doucement les tubes de sortie pour éliminer les bulles d’air emprisonnées dans la cellule d’écoulement. Une fois que toutes les bulles d’air ont été éliminées, bouchez l’un des tubes d’entrée avec une aiguille et scellez l’un des tubes de sortie en le pliant à 180 degrés et en le fixant avec du ruban adhésif Avant d’ajouter de l’ADN à la cellule, diluez le modèle d’ADN de base à 10 picomolaires dans un millilitre de DGA un tampon de blocage. Faire couler la matrice dans la chambre à un débit modéré pour permettre une bonne couverture de surface de l’ADN.

Diluez la solution mère de billes à entre deux et quatre fois 10 des sixièmes billes par millilitre. Dans un millilitre de DGA, un x tampon de blocage. Ensuite, agitez le mélange et sonicez pendant 20 secondes.

Versez la solution de billes diluée dans la chambre. Une fois les billes ajoutées, coupez l’écoulement et laissez la chambre atteindre l’équilibre. Fermez ensuite les deux tubes de sortie.

Toute modification des tubes sans la chambre fermée provoquera des fluctuations de pression qui exerceront une forte force sur les billes et cisailleront les molécules d’ADN attachées. Branchez le tube d’entrée qui a été utilisé pour charger les billes avec une aiguille à l’aide du deuxième tube d’entrée. Commencez à laver la cellule d’écoulement avec DGA une solution x de lavage tampon de blocage de manière approfondie.

Agitez la scène en tapotant pour retirer les perles qui ne sont pas spécifiquement collées à la surface pour la vérifier. Les billes sont attachées à l’ADN. Essayez de changer la direction du flux.

Une fois que les billes libres sont suffisamment retirées, coupez l’écoulement et laissez la chambre atteindre l’équilibre. Préparez un mélange réactionnel frais contenant des protéines de réplication comme indiqué dans le protocole de texte. Fermez le tube de sortie ouvert et basculez le réservoir d’entrée sur le mélange réactionnel fraîchement préparé.

Ouvrir lentement la sortie pour éviter les changements rapides de pression afin de procéder à la réaction enzymatique. Tout d’abord, faites couler la solution protéique dans la chambre à un débit modéré pour permettre une liaison efficace à l’ADN. Coupez le débit et laissez la chambre atteindre l’équilibre.

Fermez les tubes de sortie et replacez le tube contenant le mélange réactionnel. Avec le tube composé d’un tampon de lavage DGA, laver la chambre pour éliminer les protéines libres après le lavage. Encore une fois, coupez le débit et laissez la chambre atteindre l’équilibre.

Fermez les tubes de sortie et replacez le tube contenant le tampon de lavage. Avec le tube contenant le tampon de réplication T sept, le tampon de réplication T sept contient du chlorure de magnésium qui déclenche le début de la réaction de réplication. Utilisez un débit de 0,012 millilitre par minute qui correspond à une force de traînée de trois pico Newin sur les attaches d’ADN dans les conditions décrites dans ce protocole.

Placez un aimant permanent de terres rares au-dessus de la cellule d’écoulement avant l’imagerie afin d’éviter les interactions non spécifiques entre les billes et la surface. Positionnez un illuminateur à fibre à un angle d’incidence compris entre 10 degrés et parallèle à la platine du microscope près du champ de vision du microscope avec un objectif 10 x et une caméra CCD. L’éclairage en fond sombre est utilisé pour augmenter le contraste dans la mise au point de l’imagerie à billes à l’aide d’une perle capturée.

Commencez l’acquisition de données pendant 20 à 30 minutes à une fréquence d’images lente. Dans une expérience réussie, 100 billes peuvent être observées simultanément. L’expérience devrait révéler de nombreuses traces présentant la synthèse de l’ADN du brin principal.

Afin de mesurer les vitesses et le processus de déroulement et de polymérisation de l’ADN, les positions précises des billes doivent être déterminées pour y parvenir. Ajustez ces positions avec des fonctions gaussiennes bidimensionnelles. Visualisez la trajectoire en suivant la position du talon dans chaque image à l’aide d’un logiciel de suivi.

Ensuite, tracez la position du cordon en fonction du temps à l’aide de n’importe quel logiciel graphique pour obtenir des données de taux. Ajustez les tracés avec une régression linéaire et calculez la pente pour processive. Déterminez la longueur totale de l’ADN du début à la fin d’un événement de raccourcissement.

Combinez toutes les mesures uniques et tracez les distributions de taux et de productivité pour ajuster les données à l’aide de fonctions gaussiennes et exponentielles simples, respectivement. Nous venons de vous montrer comment mesurer les taux et le processus de réplication de l’ADN au niveau d’une seule molécule. Lors de cette procédure, il est important de s’assurer que la force et certains des paris par le flux de lames n’affectent pas les activités enzymatiques des protéines de réplication.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et amusez-vous bien dans vos expériences.