Observation directe d'ADN Enzymes réplication via un ADN simple molécule Stretching Assay

Ce vidéo montre un protocole permettant de visualiser la réplication de l'ADN par microscopie optique grand champ à l'aide d'ADN lambda linéarisé et chimiquement modifié. L'ADN est fixé sur un couvre-objet en verre fonctionnalisé. L'extrémité libre de l'ADN est marquée par une microbille et l'ADN est étiré par un écoulement laminaire.

Lorsque la réplication est initiée, le brin directeur commence à s'allonger tandis que le brin retardé se raccourcit en raison de l'enroulement. La grande différence de longueur entre l'ADN double brin et l'ADN simple brin à faible force permet une observation directe des conversions de l'ADN pendant la réplication. La longueur du fragment d'ADN est surveillée en suivant la position de la bille, ce qui permet de déterminer précisément la vitesse et le déroulement de la réplication de l'ADN.

Bonjour, je suis Ari Ulrich des laboratoires d'Anto one Vanian et de Charles Richardson, du Département de chimie biologique et de pharmacologie moléculaire de la faculté de médecine de Harvard. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'imagerie de la réplication de l'ADN au niveau moléculaire unique. Nous utilisons cette procédure dans nos laboratoires pour étudier les activités enzymatiques qui se produisent pendant la synthèse de l'ADN.

Commençons. Au début de cette procédure, l'ADN linéarisé du bactériophage Lambda est modifié par des oligonucléotides fléchis pour former une fourche de réplication, un bras de fourche complémentaire au lambda, un bras de fourche biotinylé et un amorçage de fourche. Le bras de fourche biotinylé contient une biotine t attachée à son extrémité 5', ce qui permet d'ancrer le modèle d'ADN à la surface de la cellule d'écoulement.

L'ADN lambda est ensuite modifié par hybridation avec un autre oligonucléotide contenant un groupement diggène qui sert de marqueur immuno-affine à haute affinité pour l'attachement d'une bille. Pour générer la fourche de réplication, procurez-vous de l'ADN lambda ainsi que plusieurs oligonucléotides dont les séquences sont disponibles dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo. Ces oligonucléotides comprennent un bras de fourche biotinylé, un bras de fourche complémentaire au lambda, un amorce de fourche, et un diggène complémentaire au lambda ; phosphorylez ensuite les extrémités cinq primes du bras de fourche complémentaire au lambda et de l'extrémité digogénine complémentaire au lambda à l'aide de la polynucléotide kinase T4.

Mélangez ensuite le bras de fourche complémentaire phosphorylé de lambda, le bras de fourche biotinylé, l'amorce de fourche et l'ADN lambda selon un rapport molaire de 10:10:100:1. Dans le tampon de la ligase ADN T4, chauffez une fois le mélange à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez lentement jusqu'à la température ambiante en éteignant le bloc chauffant afin de permettre un appariement adéquat des oligonucléotides et de la ligase ADN T4 au mélange, et incubez pendant deux heures. À température ambiante, la ligase ADN T4 catalysera la fermeture des nicks entre les oligonucléotides et l'ADN lambda.

L'ADN finit par s'hybrider avec le diggone complémentaire lambda et s'associe au modèle de réplication de l'ADN en ajoutant le diggone complémentaire lambda phosphorylé et en incubant le mélange dans un tampon de ligase T4 pendant 30 minutes à 45 degrés Celsius, puis refroidir lentement jusqu'à la température ambiante en éteignant le bloc chauffant. Lier le diggone complémentaire lambda phosphorylé et l'extrémité au modèle de réplication de l'ADN en ajoutant la ligase T4 de l'ADN au mélange et incuber pendant deux heures à température ambiante. Le modèle final de réplication de l'ADN est désormais prêt à l'emploi. Afin d'attacher les billes magnétiques activées par le t-sel au modèle de réplication de l'ADN, elles doivent être fonctionnalisées avec un fragment FAB spécifique de la digoxigénine.

Pour commencer ce processus, resuspendre la solution stock de billes et transférer 400 microlitres dans un tube einor. Placer le tube dans un séparateur magnétique et incuber jusqu'à ce que la solution devienne limpide. Ensuite, éliminer le surnageant par pipetage. Pour activer les groupes toal pour la couplage des anticorps, ajouter un millilitre de tampon boid et mélanger doucement par pipetage.

À nouveau, éliminer le surnageant à l’aide d’un séparateur magnétique. Ensuite, ajouter 240 microlitres de fragment FAB et resuspendre les billes dans 400 microlitres de tampon borate. Mélanger soigneusement et laisser incuber sur un agitateur rotatif pendant 16 à 24 heures à 37 degrés Celsius.

Après l'incubation, séparez les billes à l'aide du séparateur magnétique et retirez le surnageant. Lavez les billes avec un millilitre de tampon de lavage et incubez pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis retirez le tampon à l'aide du séparateur magnétique. Ce lavage est répété deux fois.

Pour bloquer les groupes tosyle libres, ajouter un millilitre de BSA contenant un tampon tris et incuber pendant quatre heures à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, retirer le tampon des billes à l'aide d'un séparateur magnétique, laver deux fois avec du tampon et aliquoter. Pour l'utilisation, l'ADN à répliquer est fixé sur des lamelles de verre fonctionnalisées avec Amil lane.

Le groupe oxy de la voie Amil se lie au verre, laissant une amin disponible pour la liaison à des molécules de PEG biotinylées. Ce revêtement contribue à réduire la liaison non spécifique à la surface. Pour nettoyer soigneusement les lamelles de verre, placez-les dans des bocaux de coloration et remplissez les bocaux d'éthanol, puis soumettez-les à une sonication.

Pendant 30 minutes, rincez les bocaux et remplissez-les d’un sonicateur de potasse à une molaire pendant 30 minutes, puis répétez les deux lavages. Pour la première réaction de fonctionnalisation, toutes les traces d’eau doivent être éliminées. Remplissez les bocaux de coloration avec de l’acétone et soniquez pendant 10 minutes.

Videz les bocaux et remplissez-les à nouveau avec de l'acétone. Procédez ensuite à l'ajout du réactif sine dans les bocaux et agitez pendant deux minutes. Ensuite, arrêtez la réaction en ajoutant un grand excès d'eau.

Ensuite, séchez les lamelles en les faisant cuire à 110 degrés Celsius dans un four pendant 30 minutes. Préparez ensuite le mélange de PEG à environ 0,2 % poids par volume. Le PEG biotinylé, comprenant un espaceur en lamelle de verre, permettra de séparer les lamelles ; pipetez 100 microlitres sur une lamelle silylée sèche.

Placez un deuxième coverslip par-dessus. Incubez les coverslips dans la solution de PEG pendant trois heures. Puis séparez chaque paire de coverslips et lavez abondamment à l'eau.

Veillez à maintenir les lamelles avec leur face fonctionnalisée vers le haut, car un seul côté sera recouvert de PEG. Enfin, séchez les lamelles à l'air comprimé et stockez-les sous vide dans un dessiccateur ; les surfaces restent stables pendant au moins un mois. Ainsi, des dizaines de lamelles peuvent être préparées en une seule série et utilisées au fur et à mesure des besoins.

À présent que les lamelles sont prêtes, on peut monter la chambre d'écoulement pour l'expérience de molécule unique. L'expérience de molécule unique est réalisée à l'aide d'une chambre d'écoulement simple, constituée d'une lamelle fonctionnalisée, d'un ruban adhésif double face, d'une lame en quartz et de tubulures. Une chambre d'écoulement est préparée pour chaque expérience de molécule unique.

Commencez par mélanger cinq millilitres de tampon de blocage et 20 millilitres de tampon de travail, puis placez le mélange dans un dessiccateur afin d'éliminer toute bulle d'air pour les étapes ultérieures. Ensuite, étalez 100 microlitres d'une solution de travail de strp din dans du PBS sur la surface du coverslip fonctionnalisé au PEG, puis incubez pendant 20 minutes à température ambiante pour permettre au strp din de se lier à la biotine de surface. Pendant ce temps, découpez un morceau de ruban adhésif double face afin qu'il corresponde à la taille de la lame de quartz, puis marquez sur le ruban la position des trous pour le tube.

Délimitez la chambre d'écoulement en dessinant un canal central large de trois millimètres et des rectangles contenant les deux trous. Les chambres d'écoulement peuvent être conçues avec deux canaux d'entrée et deux canaux de sortie en forme de Y. Découpez maintenant le ruban marqué le long du contour dessiné, en effectuant des coupes droites et nettes afin de s'assurer qu'aucun adhésif ne dépasse dans le canal.

Nettoyez soigneusement la lame de quartz à l’aide d’acétone afin d’éliminer l’adhésif provenant de la construction de la cellule d’écoulement utilisée lors d’expériences précédentes. Trouvez le meilleur alignement du contour du canal. Retirez un côté du support adhésif et placez délicatement le ruban sur la lame.

Veillez à bien aligner le ruban afin que les orifices d'entrée et de sortie restent dégagés. Ensuite, préparez des morceaux de tube de 0,76 millimètre de diamètre intérieur pour l'entrée et la sortie de la cellule d'écoulement. Coupez l'extrémité du tube selon un angle d'environ 30 degrés afin que le tube ne s'aplatisse pas contre le fond de la chambre.

Suspendez le tube sur des porte-tubes afin de faciliter son raccordement à la cellule d'écoulement lors des prochaines étapes. À ce stade, l'incubation du coverslip devrait être terminée. Rincez soigneusement le coverslip à l'eau et séchez-le à l'aide d'air comprimé.

Veillez à ne pas retourner la lamelle car un seul côté est fonctionnalisé avec du PEG. Terminez l'assemblage de la chambre d'écoulement en retirant l'autre partie du support du ruban adhésif et en plaçant la lame de quartz sur la lamelle. Appuyez doucement sur la lamelle pour chasser tout air piégé dans l'adhésif. Cela aidera à prévenir l'entrée de bulles d'air dans le canal d'écoulement.

Scellez les côtés de la chambre avec de l'époxy. Insérez le tube coupé dans les trous du quartz et fixez-le en place à l'aide de l'époxy. Laissez sécher quelques minutes.

Une fois sec, utiliser une aiguille de calibre 21 pour aspirer une partie du tampon de blocage DGA à travers l'un des tubes afin de bloquer la surface de la chambre. Rincer plusieurs fois pour éliminer les bulles d'air et laisser la chambre incuber pendant au moins 30 minutes avant de passer à l'expérience de réplication en molécule unique. Une fois que les billes fonctionnalisées avec le brin d'ADN et la chambre d'écoulement ont été préparées, une expérience en molécule unique peut être réalisée.

Pour commencer, placez la cellule d'écoulement sur la platine du microscope. Maintenez la chambre en place à l'aide de pinces de platine et assurez-vous que le canal d'écoulement soit aligné avec la caméra CCD. Connectez le système de ressort à air précédemment monté à la pompe à seringue et aux tubes de sortie de la cellule d'écoulement.

À l’aide de tubes de raccordement de diamètre plus grand, placer les tubes d’entrée de la cellule d’écoulement dans du tampon de blocage et tirer doucement sur la seringue pour éliminer toutes les bulles d’air présentes dans les tubes ; secouer légèrement les tubes de sortie afin d’éliminer les bulles d’air piégées dans la cellule d’écoulement. Une fois toutes les bulles d’air éliminées, boucher l’un des tubes d’entrée avec une aiguille et sceller l’un des tubes de sortie en le pliant à 180 degrés et en le fixant avec du ruban adhésif. Avant d’ajouter l’ADN à la cellule, diluer le modèle d’ADN stock à 10 picomolaire dans un millilitre de tampon de blocage DGA 1x. Faire circuler le modèle dans la chambre à un débit modéré afin d’obtenir une bonne couverture de surface de l’ADN.

Diluer la solution stock de billes entre deux et quatre fois 10 puissance six billes par millilitre. Dans un millilitre de DGAs, ajouter un volume de tampon de blocage 1 x. Ensuite, vortexer une fois le mélange homogène et soniquer pendant 20 secondes.

Faites circuler la solution de billes diluée dans la chambre. Une fois les billes ajoutées, arrêtez l'écoulement et laissez la chambre atteindre l'équilibre. Fermez ensuite les deux tubes de sortie.

Toute modification des tubes sans que la chambre soit fermée provoquera des fluctuations de pression qui exerceront une force importante sur les billes et rompront les molécules d'ADN fixées. Boucher le tube d'entrée utilisé pour charger les billes avec une aiguille en utilisant le deuxième tube d'entrée. Commencer à laver la cellule d'écoulement avec les DGAs à l'aide d'une solution de tampon de blocage, en effectuant un lavage approfondi.

Agitez la platine en tapotant pour éliminer les billes qui adhèrent non spécifiquement à la surface afin de la vérifier. Les billes sont liées à l'ADN. Essayez de changer le sens du flux.

Une fois que les billes libres ont été suffisamment éliminées, arrêtez le débit et laissez la chambre atteindre l'équilibre. Préparez un mélange de réaction frais contenant les protéines de réplication, comme indiqué dans le protocole écrit. Fermez le tube de sortie ouvert et changez le réservoir d'entrée pour le mélange de réaction fraîchement préparé.

Ouvrir lentement la sortie afin d'éviter des changements rapides de pression pendant la poursuite de la réaction enzymatique. Faire circuler d'abord la solution protéique dans la chambre à un débit modéré pour permettre une fixation efficace à l'ADN. Arrêter l'écoulement et laisser la chambre atteindre l'équilibre.

Fermez les tubes de sortie et remplacez le tube contenant une solution réactionnelle. À l’aide du tube contenant le tampon de lavage DGA, lavez la chambre afin d’éliminer les protéines libres après le lavage. Ensuite, arrêtez à nouveau l’écoulement et laissez la chambre atteindre l’équilibre.

Fermez les tubes de sortie et remplacez le tube contenant le tampon de lavage. Utilisez le tube contenant le tampon de réplication T7, car ce tampon contient du chlorure de magnésium qui déclenche le début de la réaction de réplication. Appliquez un débit de 0,012 millilitre par minute, ce qui correspond à une force de traînée de trois pico Newin sur les attaches d'ADN, en utilisant les conditions décrites dans ce protocole.

Placer un aimant permanent en terre rare au-dessus de la cellule d'écoulement avant l'acquisition d'images afin d'éviter les interactions non spécifiques entre les billes et la surface. Positionner un éclaireur à fibre à un angle d'incidence compris entre 10 degrés et parallèlement au plateau du microscope, à proximité du champ de vision du microscope équipé d'un objectif 10 x et d'une caméra CCD. Un éclairage en champ sombre est utilisé pour augmenter le contraste lors de la mise au point de l'image des billes à l'aide d'une bille liée.

Commencez l'acquisition de données pendant 20 à 30 minutes à une fréquence d'images lente. Dans une expérience réussie, 100 billes peuvent être observées simultanément. L'expérience doit produire de nombreuses traces montrant la synthèse de l'ADN du brin conducteur.

Afin de mesurer les taux et le caractère processif du déroulement de l'ADN et de la polymérisation, il est nécessaire de déterminer précisément les positions des billes. Ajuster ces positions à l’aide de fonctions gaussiennes bidimensionnelles. Visualiser la trajectoire en suivant la position de la bille dans chaque image à l’aide d’un logiciel de suivi.

Ensuite, tracez la position des billes en fonction du temps à l'aide de tout logiciel graphique afin d'obtenir des données de vitesse. Ajustez les courbes par une régression linéaire et calculez la pente pour le mouvement processif. Déterminez la longueur totale de l'ADN du début à la fin d'un événement de raccourcissement.

Combinez toutes les mesures individuelles et tracez les distributions de vitesse et de productivité en ajustant les données à l’aide de fonctions gaussiennes et exponentielles simples, respectivement. Nous venons de vous montrer comment mesurer les vitesses et le caractère processif de la réplication de l’ADN au niveau de la molécule unique. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de s’assurer que la force et la traînée exercées par l’écoulement laminaire n’affectent pas les activités enzymatiques des protéines de réplication.

Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et amusez-vous bien lors de vos expériences.