L'induction ou à toxines et d'extraction de protéines à partir Fusarium Spp. Cultures pour les études protéomiques

Extraction de protéines pour les analyses protéomiques espèces fongiques nécessite un niveau élevé de standardisation d'être accomplie selon le minimum d'informations sur une expérience de protéomique (MIAPE) des lignes directrices. Nous vous présentons une vidéo-protocole qui comprend une procédure pour minimiser les biais expérimentaux lors de l'induction de toxines et d'extraction de protéines à partir

Cette vidéo décrit une procédure utilisée pour induire la synèse de toxines chez certaines espèces, dans ce cas pour et le protocole d’extraction de prote entier utilisé pour les études protéomiques dans notre laboratoire. La durée de la procédure, 16 jours, quatre jours pour la croissance fongique, 10 jours pour la synthèse des toxines et deux jours pour l’extraction des protéines. Après quatre jours, les colonies continuent de croître activement vers le bord de la plaque.

Un mycélium aérien typique se forme et est collecté à l’aide d’une lame de stéroïde sous une boîte d’écoulement de lame en grattant doucement la surface de la plaque. Le mycélium est coupé en cinq petits morceaux et ajouté à un flacon contenant 25 millilitres de milieu induisant des toxines. L’induction de toxines est plus efficace que la poussière noire.

Le flacon est recouvert d’aluminium. Les cultures sont ensuite agitées pendant 10 jours, à raison de 150 coups par minute à 25 degrés centigrades. Le substrat est de SAPH et contient une solution de rangs S hautement concentrée.

Le lit avec l’obscurité est connu pour faciliter la synèse des toxines dans ria. Le mycélium est ensuite séparé du liquide contenant la toxine en filtrant sur le tissu proche de l’IM. Le liquide peut être utilisé pour mesurer la teneur en toxines tandis que le mycélium est utilisé pour l’extraction des protéines.

Pour éviter le transfert de support, mon plafond est lavé trois fois à l’eau stérile. L’excès d’eau doit être éliminé par la suite, comme de l’azote liquide, est ajouté, et les échantillons peuvent être stockés à moins 80 ou utilisés pour l’extraction de protéines. La procédure d’extraction des protéines est basée sur l’utilisation de SDS et de TCA et se compose de différentes étapes de lyse.

Il proposera une méthode qui englobe plusieurs opérateurs à réaliser. En même temps que l’extraction des réplicats biologiques, un opérateur différent effectue chaque réplication. Cette procédure prend en compte les différences dans la procédure d’extraction qui peuvent être générées par les différents opérateurs qui traitent les réplicats.

Il devrait donc présenter une plus grande robustesse lorsque les réplicats biologiques sont comparés, car la variable opérateur est incluse dans la répétition. Dans le même temps, l’utilisation de plusieurs opérateurs réduit le temps de traitement. L’échantillon est broyé dans un mortier stérile à l’aide d’azote liquide jusqu’à ce que le mycélium soit une poudre fine.

Cette étape est cruciale pour la qualité et la quantité de protéines. Le mycélium est collecté dans des tubes en téflon de 10 milli dans une proportion de quatre dixièmes du volume total des tubes. Un tampon de lyse contenant du SDS et différents inhibiteurs de protéase est ensuite ajouté.

Les tubes sont ensuite agités jusqu’à l’obtention d’une solution homogène. Ensuite, les échantillons sont agités pendant 30 minutes dans la chambre de code pour être encore homogénéisés, les échantillons sont bouillis afin de dissoudre les parois cellulaires et les protéines hydrophobes. La présence de SDS empêche la formation d’oligomères qui interrompent la précipitation des protéines.

Une étape de centrifugation sépare trois phases. Les protéines sont suspendues dans la solution transparente qui est recueillie dans un nouveau tube conservé sur de la glace. La palette est ensuite utilisée pour effectuer une deuxième étape, en répétant le vortex, l’ébullition et la centrifugation.

Les snat des deux lyses sont combinés afin d’effectuer une précipitation avec une précipitation glaciaire, un tampon contenant un ton acide, de l’acide triacide et du DTT. Les échantillons sont ensuite stockés pendant la nuit pendant 16 heures à moins 20 degrés centigrades pour permettre aux protéines. Les protéines de précipitation sont situées au fond des tubes pour améliorer la précipitation.

Les tubes sont centrifugés à grande vitesse pendant 45 minutes. La bouche est maintenant bien visible. Les surnageants peuvent être éliminés à l’aide d’un tampon de tuyau de cinq millilitres.

Le TCA est ensuite éliminé en ajoutant 25 millilitres de tampon de lavage glaciaire contenant de l’acétone et du DTT. Il est ensuite soigneusement et vigoureusement secoué. Ensuite, une nouvelle étape de centrifugation est effectuée.

Le palais des protéines flotte maintenant, il faut donc faire preuve de tension pour éliminer le snat. Une deuxième étape de lavage est effectuée, en ajoutant le lavage, le tampon, l’agitation et la centrifugation. L’agent SUP est éliminé et l’échantillon est séché à l’aide d’un sac rapide.

Lorsque l’échantillon est sec, la protéine a la consistance d’une poudre. Stocker. La protéine de l’échantillon doit être prélevée dans le tube pour diminuer l’interférence électrostatique du plastique.

Un pistolet électrostatique est utilisé et la poudre de protéines est recueillie à l’aide d’une spatule métallique. Les protéines sont ensuite résus en suspension directement dans le tampon de marquage. Utilisé pour le sprint 2D 30 minutes à 800 grammes par minute.

Suffisant pour la solubilisation. La protéine avant de procéder à l’étiquetage coûteux en 2D du tiret. La qualité des protéines est testée sur la page SDS d’un gel dimensionnel, comme on peut le voir.

L’absence de frottis significatifs sur le bord d’une voie suggère une bonne qualité de l’échantillon.