Name: Linduction ou à toxines et dextraction de protéines à partir Fusarium Spp. Cultures pour les études protéomiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-16T15:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Apprenez l'induction de toxines et l'extraction de protéines à partir de cultures Fusarium spp. pour des analyses protéomiques conformes aux directives MIAPE. Cette méthode standardisée minimise les biais expérimentaux.

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Nous tenons à remercier Servane Contal et Boris Untereiner pour leur contribution technique. Nous reconnaissons l&#39;appui du FNR &quot;FUTOX&quot; du projet.

Le protocole exige 16 jours pour son achèvement. Le calendrier est détaillé dans la figure 1. Détails pour la préparation des tampons <ul><li> Préparation du tampon de lyse (3 ml par échantillon). </li><li> Préparation du tampon de lavage (50 ml par échantillon). Ce tampon doit être pré-refroidis et conservés à -20 ° C dans le congélateur jusqu'à ce que d'autres analyses et conservés sur la glace pendant toute la procédure. </li><li> Préparation du tampon de précipitation (20 ml par échantillon). Ce tampon doit être pré-refroidis et conservés à -20 ° C dans le congélateur jusqu'à ce que nécessaire et conservé sur la glace durant toute la procédure. </li><li> Les travaux devraient préférentiellement être réalisée dans la chambre froide à 4 ° C. </li></ul> Espèces de champignons Trois souches utilisées pour les analyses protéomiques ont été classés à Fusarium graminearum sur la base de leurs caractéristiques morphologiques et Alpha-1-facteur d'élongation de la traduction d'analyse (O'Donnell et al., 1998) Ces souches appartiennent à la collection du CRP-Gabriel Lippmann et ont été maintenus et conservés à - 80 ° C dans 15% de glycérol. Préparation du mycélium Les champignons ont été cultivés sur V8 de 4 jours à 25 ° C alternant période de lumière et l'obscurité à chaque 12 heures. Les cultures ont été fragmentés en utilisant une lame stérile et des morceaux de ces cultures ont été utilisés pour inoculer 250 ml erlenmeyers contenant 100 ml de toxine induisant des médias. Mycéliums ont été récoltés après 10 jours et ont été séparés de moyenne en filtrant la culture avec un filtre stérile. Mycéliums ont été lavés 3 fois avec de l'eau stérile pour enlever les résidus moyennes et d'autres composés. Nous avons alors immédiatement gelé les cellules en ajoutant l'azote liquide et conservés les échantillons à -80 ° C. Description générale de l'extraction des protéines Les échantillons de protéines ont été extraites selon la méthode décrite dans la figure 3A et 3B. Les échantillons de Fusarium ont été broyés dans l'azote liquide et la poudre a été recueilli dans des tubes en téflon 10 ml. Les échantillons ont ensuite été incubées 30 minutes avec le tampon de lyse, bouillis pendant 10 minutes, puis centrifugé 2 fois à température ambiante (12000g pendant 15 minutes). Les surnageants ont été recueillis et mis en incubation à -20 ° C avec un tampon de précipitations durant la nuit. Après centrifugation à 4 ° C pendant 45 minutes Acheter 30000G, les boulettes de protéines précipitées ont été lavés 3 fois avec de l'acétone froide contenant du DTT. Enfin, les granulés sont séchés à l'air et les protéines ont été remis en solution dans le tampon d'étiquetage, ajuster le pH à 8. Un sous-échantillon de 30 ml a été retiré pour la quantification des protéines totales et le surnageant restant a été stocké à -20 ° C jusqu'à ce que l'électrophorèse des protéines. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Chronologie de la procédure. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Schéma de plusieurs opérateurs de l'échantillon de traitement. <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3a.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3atmb.jpg" alt="Figure 3a" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="La figure 3a"></a> Figure 3a. <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3b.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3btmb.jpg" alt="Figure 3b" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3b"></a> Figure 3b. Figures 3a-b diagrammes de flux pour la procédure d'extraction de protéines (A: premier jour; B: deuxième jour).. <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig4tmb.jpg" alt="Figure 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"></a> Figure 4. Image 1D d'extraits protéiques. Les protéines ont été déroulera jusqu'au migration complète de bleu à la fin du gel qui a été coloré avec du violet de lave.

<ol><li>Bridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Extraction+from+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Purification+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protein Extraction from Fungi.</a> Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).</li>
<li>Jiao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+carbon+sources+on+trichothecene+production+and+Tri+gene+expression+by+Fusarium+graminearum+in+liquid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture.</a> FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).</li>
<li>Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of filamentous fungi.</a> Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).</li>
<li>Milles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+proteomic+approach+to+monitor+protein+synthesis+in+mycotoxin+producing+moulds%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotoxin+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds.</a> Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).</li>
<li>Morrison, N., Field, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+sample+in+OMICS+technology%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">Concept of sample in OMICS technology.</a> OMICS. 10, 127-137 (2006).</li>
<li>O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+evolutionary+origins+of+the+fungus+causing+Panama+disease+of+banana%3A+Concordant+evidence+from+nuclear+and+mitochondrial+gene+genealogies%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies.</a> PNAS. 95, 2044-2049 (1998).</li>
<li>Paper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+of+extracellular+proteins+in+vitro+and+in+planta+from+the+pathogenic+fungus+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum.</a> Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).</li>
<li>Pasquali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+in+science.+Protocol+videos%3A+the+implications+for+research+and+society%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Video in science. Protocol videos: the implications for research and society.</a> EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).</li>
<li>Taylor, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+about+a+proteomics+experiment+%28MIAPE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE).</a> Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).</li>
<li>Taylor, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+Fusarium+graminearum+grown+under+mycotoxin-inducing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions.</a> Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).</li>
</ol>

L&#39;intérêt récent pour les approches protéomiques dans le domaine de la biologie des champignons a conduit à une augmentation du nombre de publications utilisant cette technique (tel que revu à Kim et al., 2007). Méthodes pour l&#39;extraction des protéines reposent sur une combinaison des méthodes d&#39;extraction, ils sont souvent à peine décrits dans les sections méthodologiques et nécessitent une expertise dans le traitement des méthodes de dépannage potentiel. Comme pour les autres «omiques» les approches, l&#39;établissement de normes pour le traitement des échantillons et des données est essentielle afin de générer des renseignements scientifiques fiables. Par ailleurs des échantillons et des procédures de manipulation doivent être convenablement décrite afin de permettre l&#39;interprétation des résultats partagés entre les différents «omiques» expériences. Ce serait essentielle pour exploiter pleinement potentialité de la Croix-de data mining en génomique, protéomique, métabolomique, ... (Morrison et al., 2006). Minimum d&#39;informations sur une expérience de protéomique a été rédigé et groupes de travail ont été établis afin d&#39;aborder tous les aspects d&#39;une expérience (électrophorèse sur gel, la spectrométrie de masse, les interactions moléculaires, modifications des protéines, de l&#39;informatique de la protéomique, de traitement des échantillons). Pour l&#39;instant aucune information définis sont disponibles sur les procédures de traitement des échantillons. Compte tenu de l&#39;importance des procédures d&#39;extraction de protéines dans la détermination de la qualité finale des études de protéomique, afin de mettre en œuvre des procédures qui peuvent accroître la normalisation dans le cadre de directives MIAPE (Taylor et al., 2007), nous avons proposé l&#39;utilisation d&#39;un protocole vidéo détaillant l&#39;échantillon de traitement. Video description d&#39;expériences peut contribuer sensiblement à augmenter le nombre d&#39;informations sur le traitement des échantillons qui peuvent conduire à une meilleure reproductibilité des «omiques» des expériences (Pasquali, 2007). En effet, la reproductibilité entre les laboratoires est une exigence fondamentale pour garantir la validité des résultats en protéomique (http://www.fixingproteomics.org). La reproductibilité inter-laboratoire est influencé par deux facteurs: des instrumentations différentes et les différents opérateurs manipulant des échantillons. Dans le protocole décrit, nous proposons d&#39;effectuer biologiques reproduit impliquant plusieurs opérateurs (figure 2 et vidéo) pour augmenter la fiabilité des données (c.-à la variation des résultats techniques est prise en compte). La procédure décrite pour l&#39;extraction des protéines est basé sur la SDD et le chauffage. Cela a été montré précédemment pour garantir une bonne pureté et la quantité de protéines (Pont, 1996). SDS couplée à bouillante en dissout les parois des cellules, des protéines hydrophobes et empêche la formation d&#39;oligomères que les précipitations abort des protéines. D&#39;ébullition permet également l&#39;inactivation de protéases. Le même effet est produit aussi par l&#39;EDTA, PMSF et complète inhibiteur de la protéase mini. TNT supprime des ponts disulfure dans et entre les protéines facilitant la solubilisation des protéines. Afin de supprimer les FDS avant d&#39;IEF, les protéines sont précipitées par l&#39;acétone / TCA / TNT. Par ailleurs, l&#39;acétone / TCA / TNT précipitations permet d&#39;enlever certains contaminants comme les lipides, les acides nucléiques, de sels et / ou composés phénoliques lorsque ces composés sont présents. Comme SDS, ces molécules empêchent une bonne migration lors de l&#39;IEF. Suite à cette précipitation, il est nécessaire de laver les protéines précipitées par l&#39;acétone / TNT, afin d&#39;éliminer le TCA que cela peut interférer avec l&#39;IEF. Une préparation de l&#39;échantillon bonne est la clé de bons résultats. Pour cela, il est également essentiel d&#39;éviter la contamination des protéines à partir de l&#39;environnement de travail avec des gants sans poudre et le respect de bonnes pratiques de laboratoire. D&#39;un point de vue technique, dans le protocole décrit les étapes les plus critiques pour obtenir des quantités suffisantes et la pureté des protéines sont deux phases. Tout d&#39;abord, la phase de broyage où la destruction complète de la cellule est fondamentale pour la libération de protéines et, deuxièmement, la purification de protéines totales, une phase qui englobe la suppression de la majorité des lipides, ADN et d&#39;autres contaminants qui peuvent interférer avec la migration des protéines.

Médias et des solutions PDA: 39 pommes de terre g Dextrose Agar (Difco), 1 L d&#39;eau distillée. Agar V8: V8 de 200 ml (Campbell, USA), 2g CaCO3 (Sigma), Agar 16g (DIFCO), 800 ml d&#39;eau distillée Média induisant toxines: 1g de K 2 HPO 4, 0,5 g de KCl, 0,5 g MgSO 4 7H 2 O, 10 mg FeEDTA, 2g d&#39;acide glutamique L, saccharose 10g dans 1L d&#39;eau distillée. Tampon de lyse: <table border="1"><tr><td></td><td> 100mL </td><td> La concentration finale </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCL pH 8 </td><td> 5mL </td><td> 50mM </td><td> 1M </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2 g ou 10 ml </td><td> 2% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 500mL </td><td> 10mM </td><td> 2M </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 20mL </td><td> 0,1 mM </td><td> 0.5M </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 200mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Remplissez inhibiteur de la protéase mini </td><td> 1 comprimé </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eau </td><td> Qsp </td><td></td><td></td></tr></table> Tampon Précipitations: <table border="1"><tr><td></td><td> 100mL </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> TCA </td><td> 20mL </td><td> 20% </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 0,1 ml </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> Acétone </td><td> Qsp </td><td></td></tr></table> Tampon de lavage: <table border="1"><tr><td></td><td> 100mL </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 0,1 ml </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> Acétone </td><td> 100mL </td><td></td></tr></table> Étiquetage tampon (stocker à -18 ° C dans de petites aliquotes): <table border="1"><tr><td></td><td> 1ml </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> L&#39;urée </td><td> 140 mg </td><td> 7M </td></tr><tr><td> Thiourée </td><td> 50 mg </td><td> 2M </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 40 mg </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 30 uL </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> Eau </td><td> 1 ml </td><td></td></tr></table>

l&#39;induction ou à toxines et d&#39;extraction de protéines à partir fusarium spp. cultures pour les études protéomiques

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusarium sont des champignons filamenteux capables de produire différentes toxines. Mycotoxines de Fusarium telles que le déoxynivalénol, le nivalénol, T2, zearelenone, fusarique acide, moniliformine, etc .. avoir des effets néfastes sur la santé humaine et animale et certains sont considérés comme des facteurs de pathogénicité. Des études protéomiques ont montré pour être efficace pour déchiffrer les mécanismes de production de toxines (Taylor et al., 2008) ainsi que pour identifier les facteurs pathogènes potentiels (papier et al., 2007, Houterman et al., 2007) dans Fusarium. Il devient donc essentiel d&#39;établir des méthodes fiables permettant de comparer entre les études protéomiques afin de s&#39;appuyer sur des différences réelles dans l&#39;expression de protéines parmi les expériences, les souches et les laboratoires. La procédure qui sera décrite devrait contribuer à une augmentation du niveau de la standardisation des procédures de protéomique de deux manières. Le protocole a filmé est utilisé pour augmenter le niveau de détails qui peuvent être décrits avec précision. Par ailleurs, la disponibilité de procédures normalisées pour traiter biologiques répétitions doit garantir une plus grande robustesse des données, en tenant également compte du facteur humain au sein de la reproductibilité technique de la procédure d&#39;extraction. Le protocole décrit nécessite 16 jours pour sa réalisation: quatorze jours pour les cultures et deux jours pour l&#39;extraction des protéines (figure 1). Brièvement, les souches de Fusarium sont cultivés sur des milieux solides pour quatre jours, ils sont ensuite manuellement fragmentée et transférée dans un média induisant modifiés toxine (Jiao et al, 2008.) Pendant 10 jours. Le mycélium est recueilli par filtration à travers une couche Miracloth. Le broyage est effectué dans une chambre froide. Différents opérateurs ont effectué l&#39;extraction répétitions (n ​​= 3) afin de prendre en compte les biais dus aux variations techniques (figure 2). L&#39;extraction a été basée sur un tampon SDS / DTT comme décrit dans Taylor et al. (2008) avec de légères modifications. L&#39;extraction des protéines totales nécessaires un procédé de précipitation des protéines à l&#39;aide Acétone / TCA / TNT tampon de lavage de nuit et d&#39;acétone / TNT (figure 3a, 3b). Les protéines ont finalement été remis en solution dans le tampon de la protéine-étiquetage et quantifiés. Résultats de l&#39;extraction ont été visualisées sur un gel 1D (Figure 4, SDS-PAGE), avant de procéder à des gels 2D (IEF / SDS-PAGE). La même procédure peut être appliquée pour les analyses protéomiques sur d&#39;autres supports de culture et d&#39;autres champignons filamenteux (Miles et al., 2007).

Extraction de protéines pour les analyses protéomiques espèces fongiques nécessite un niveau élevé de standardisation d&#39;être accomplie selon le minimum d&#39;informations sur une expérience de protéomique (MIAPE) des lignes directrices. Nous vous présentons une vidéo-protocole qui comprend une procédure pour minimiser les biais expérimentaux lors de l&#39;induction de toxines et d&#39;extraction de protéines à partir<em&gt; Fusarium spp.</em

L&#39;induction ou à toxines et d&#39;extraction de protéines à partir Fusarium Spp. Cultures pour les études protéomiques

Les Fusarium sont des champignons filamenteux capables de produire différentes toxines. Les mycotoxines de Fusarium telles que le déoxynivalénol, le nivalénol, la T2, la zéaralénone, l'acide fusarique, ...

Ce vidéo décrit une procédure utilisée pour induire la synthèse de toxines chez certaines espèces, dans ce cas particulier, ainsi que le protocole d'extraction totale des protéines utilisé pour les études protéomiques dans notre laboratoire. La durée de la procédure est de 16 jours : quatre jours pour la croissance fongique, 10 jours pour la synthèse des toxines et deux jours pour l'extraction des protéines. Après quatre jours, les colonies sont encore en croissance active vers le bord de la boîte.Un mycélium aérien typique se forme et est collecté à l’aide d’une lame stérile sous une hotte à flux laminaire en grattant doucement la surface de la boîte. Le mycélium est découpé en cinq petits morceaux et ajouté à un flacon de mycélium précoce contenant 25 millilitres de milieu inducteur de toxine. L’induction de toxine est plus efficace que la poussière noire.Le flacon est recouvert d'aluminium. Les cultures sont ensuite agitées pendant 10 jours à 150 tours par minute à 25 centigrades. Le milieu est du SAPH et contient une solution concentrée de S row.Le lit, associé à l'obscurité, est connu pour faciliter la synthèse des toxines dans le ria. Le mycélium est ensuite séparé du liquide contenant les toxines par filtration sur un tissu MI close. Le liquide peut être utilisé pour mesurer la teneur en toxines, tandis que le mycélium est utilisé pour l'extraction des protéines.Pour éviter l'entraînement de milieux, mon mycélium est lavé trois fois avec de l'eau stérile. L'excès d'eau doit être éliminé par la suite, puis de l'azote liquide est ajouté, et les échantillons peuvent être stockés à -80 °C ou utilisés pour l'extraction des protéines. La procédure d'extraction des protéines repose sur l'utilisation de SDS et de TCA et comprend différentes étapes de lyse.Il proposera une méthode qui implique plusieurs opérateurs pour sa réalisation. En même temps que l'extraction des réplicats biologiques, un opérateur différent effectue chaque réplicat. Cette procédure tient compte des différences dans le protocole d'extraction pouvant être induites par différents opérateurs qui traitent les réplicats.Il devrait donc présenter une plus grande robustesse lors de la comparaison de réplicats biologiques, puisque la variabilité liée à l'opérateur est intégrée au réplicat. En même temps, l'utilisation de plusieurs opérateurs réduit le temps de traitement. L'échantillon est broyé dans un mortier stérile à l'aide d'azote liquide jusqu'à ce que le mycélium devienne une poudre fine.Cette étape est cruciale pour la qualité et la quantité de protéines. Le mycélium est recueilli dans des tubes en téflon de 10 millilitres, à raison de quatre dixièmes du volume total des tubes. Le tampon de lyse contenant du SDS et différents inhibiteurs de protéases est ensuite ajouté.Les tubes sont ensuite agités jusqu'à l'obtention d'une solution homogène. Puis, les échantillons sont agités pendant 30 minutes dans la chambre froide afin d'être davantage homogénéisés ; les échantillons sont portés à ébullition pour dissoudre les parois cellulaires et les protéines hydrophobes. La présence de SDS empêche la formation d'oligomères qui entraînerait un avortement de la précipitation des protéines.Une étape de centrifugation sépare trois phases. Les protéines sont en suspension dans la solution transparente, qui est recueillie dans un nouveau tube maintenu sur glace. La palette est ensuite utilisée pour effectuer une deuxième étape de lyse, en répétant le vortexage, l'ébullition et la centrifugation.Les surnageants des deux lysses sont combinés afin d'effectuer une précipitation avec le tampon de précipitation glacé, contenant de l'acétone, de l'acide trichloroacétique et du DTT. Les échantillons sont ensuite conservés toute la nuit pendant 16 heures à moins 20 degrés Celsius pour permettre la précipitation des protéines. Les protéines précipitées se situent au fond des tubes afin d'améliorer la précipitation.Les tubes sont centrifugés à grande vitesse pendant 45 minutes. Le culot est désormais bien visible. Les surnageants peuvent être éliminés à l’aide d’une pipette de 5 millilitres.L'acide trichloroacétique est ensuite éliminé en ajoutant 25 millilitres de tampon de lavage glacé contenant de l'acétone et du DTT. Le mélange est alors agité vigoureusement et complètement. Ensuite, une nouvelle étape de centrifugation est réalisée.Le plateau protéique flotte désormais, il faut donc faire attention pour éliminer le résidu. Une deuxième étape de lavage est effectuée, en ajoutant le tampon de lavage, en agitant et en centrifugeant. L'agent SUP est éliminé et l'échantillon est séché à l'aide d'un évaporateur sous vide.Lorsque l'échantillon est sec, la protéine présente une consistance poudreuse. Pour le stockage, les protéines de l'échantillon doivent être récupérées du tube afin de réduire l'interférence électrostatique du plastique.Un pistolet électrostatique est utilisé et la poudre protéique est recueillie à l’aide d’une spatule métallique. Les protéines sont ensuite directement resuspendues dans le tampon de marquage. Utilisé pour la 2D – 30 minutes à 800 grammes par minute.Suffisant pour la solubilisation. La protéine avant de passer à l'étiquetage coûteux en 2D. La qualité des protéines est testée sur un gel unidimensionnel SDS-PAGE, comme on peut le voir.L'absence de traînées significatives sur les bords d'une bande suggère une bonne qualité de l'échantillon.

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Pour étudier les processus de développement des ascospores dans Gibberella zeae, une procédure de collecte dans des conditions stériles est filmé afin de générer le plus haut niveau de l'information pour la description du protocole. Ceci devrait faciliter la reproductibilité de l'expérience, un aspect crucial lorsqu'il est plein des tests d'expression du génome profil sont mis en œuvre.

Gibberella zeae ascospores production et la collecte d&#39;expériences sur biopuces.

La dévastation des cultures céréalières par moisissures infectant les semences a incité de nombreux efforts de recherche afin de mieux comprendre les interactions plante-pathogène. Pour étudier les semences fongiques interactions dans un environnement de laboratoire, nous avons développé une méthode robuste pour la quantification de la reproduction des champignons, la biomasse et contamination par les mycotoxines en utilisant des essais biologiques du noyau.

Quantification de la colonisation fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines utilisant Bioassays noyau

Les membres du genre Burkholderia sont des agents pathogènes d'importance clinique. Nous décrivons un procédé pour l'extraction totale de la protéine bactérienne, en utilisant une rupture mécanique, et un gel d'électrophorèse 2D pour l'analyse protéomique ultérieure.

Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espèces

Nous démontrons une méthode pour l'analyse des aflatoxines et l'expression du transgène dans les graines d'arachide qui contiennent des signaux ARN interférence pour réduire au silence des gènes de synthèse de l'aflatoxine dans le champignon Aspergillus flavus. Contrôle de l'ARNi médiée par des mycotoxines dans les plantes n'a pas été signalé précédemment.

Contrôle des aflatoxines dans les arachides ARNi médiée: méthode pour analyser la production de mycotoxines et Transgene expression dans la Peanut /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystème

Nous présentons ici un protocole pour analyser la croissance d’Aspergillus flavus et la production d’aflatoxine dans les grains de maïs exprimant une protéine antifongique.  En utilisant une souche exprimant le GFP a. flavus , nous avons suivi l’infection et la propagation du champignon dans les grains mûrs en temps réel. L’essai est rapide, fiable et reproductible.

Inhibition de la croissance d’Aspergillus flavus et la Production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de Lablab purpureus L.

L'objectif de ce protocole est de détecter différents toxinotypes de Clostridium perfringens dans les aliments achetés localement, en particulier la toxine d'epsilon produisant des types de souche B et D, sans l'utilisation des chambres anaérobies.

L'enrichissement et la détection des toxines de Clostridium perfringens dans les échantillons d'aliments au détail

Ici, nous présentons un protocole pour profiler l’interaction entre l’hôte et l’agent pathogène pendant l’infection par protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Ce protocole utilise une quantification sans étiquette pour mesurer les changements dans l’abondance des protéines de l’hôte (p. ex., macrophages) et de l’agent pathogène (p. ex., cryptococcus néoformans)en une seule expérience.

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Nous présentons ici un protocole pour l’identification rapide des protéines produites par des bactéries pathogènes séquencées génomiquement en utilisant la spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF-TOF et l’analyse protéomique descendante avec un logiciel développé en interne. Les ions protéiques métastables se fragmentent en raison de l’effet acide aspartique et cette spécificité est exploitée pour l’identification des protéines.

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Nous présentons ici un protocole basé sur le système d’appât du ver de farine (Tenebrio molitor) qui a été utilisé pour isoler et sélectionner les champignons entomopathogènes (EPF) à partir d’échantillons de sol. Une formule de nombre de conidies efficaces (ECN) est utilisée pour sélectionner un EPF à haute tolérance au stress en fonction des caractéristiques physiologiques de la lutte microbienne des ravageurs sur le terrain.

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Les colonies fongiques entomopathogènes sont isolées à partir d’échantillons de sol tropical à l’aide d’appâts Tenebrio , d’appâts Galleria , ainsi que de milieux artificiels sélectifs, c’est-à-dire de gélose de dextrose de pomme de terre enrichie en extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide (milieu CTC).

Comparaison des méthodes d’isolement des champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol

Le présent article vise à fournir des protocoles détaillés et adéquats pour l’isolement des champignons endophytes associés aux plantes, la conservation à long terme des isolats, la caractérisation morphologique et l’extraction totale de l’ADN pour l’identification moléculaire ultérieure et les analyses métagénomiques.

Isolement, caractérisation et extraction totale de l’ADN pour identifier les champignons endophytes chez les plantes mycohétérotrophes

Apprenez l'induction de toxines et l'extraction de protéines à partir de cultures Fusarium spp. pour des analyses protéomiques conformes aux directives MIAPE. Cette méthode standardisée minimise les biais expérimentaux.

L'induction ou à toxines et d'extraction de protéines à partir Fusarium Spp. Cultures pour les études protéomiques

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