Name: Lencapsulation des cellules cancéreuses PuraMatrix (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Découvrez l'encapsulation de cellules CAR5 dans PuraMatrix pour créer des cultures 3D de cancer de l'ovaire. Cette méthode reproduit fidèlement les nodules micrométastatiques in vivo.

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Notes techniques: <ul><li> La gélification est initiée par l'ajout de sels. Par conséquent, il est essentiel que les sels ne viennent en contact avec PuraMatrix jusqu'à gélification est désiré, l'exposition aux sels de la force ionique très faible (par exemple, &lt;0,05 M) provoque la gélification irréversible. </li><li> Les restes de solutions de stock qui sont prêts peuvent être utilisés à une date ultérieure à condition qu'ils ne l'ont pas entrer en contact avec des sels. Vous n'avez pas besoin de s'inquiéter sonication répéter. </li><li> Les bulles d'air peuvent être enlevés aliquotage PuraMatrix dans des tubes stériles suivis par centrifugation. </li><li> Soyez très prudent lors des changements de médias comme l'aspiration peut facilement perturber le lit PuraMatrix. </li></ul> Matériaux: BD PuraMatrix RAD16 Peptide-1 Hydrogel% (Cat # 354250): La concentration de peptide total du mélange non dilué est de 10 mg / ml. <ul><li> Sonicator bain-marie ou Vortex </li><li> 96 puits, boîte de culture cellulaire </li><li> Milieux de culture cellulaire </li><li> Filtré stérile H 2 O </li><li> Stérile Saccharose filtrée à 20% </li><li> Cellules (tous à 5000 cellules / puits): OVCAR-5 </li></ul> Toutes les étapes doivent être effectuées dans des conditions aseptiques. Procédure: <ol><li> Soniquer l'PuraMatrix 1% (RAD16) dans un sonicateur bain-marie pendant 30 minutes pour réduire la viscosité avant de l'utiliser. </li><li> La solution PuraMatrix 1% peuvent désormais être répartie dans des tubes stériles pour simplifier de futures expériences. <ol class="lalpha"><li> Eviter la formation de bulles d'air, si elles forment tout simplement spin bas des tubes stériles contenant PuraMatrix à 1000 rpm (300 xg) pendant 5 minutes. </li><li> La concentration de peptide total du mélange non dilué est de 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Deux séries de quatre puits seront plaquées à 2,5 mg / ml et 1,25 mg / ml de concentration de peptide total, respectivement. </li><li> Diluer le PuraMatrix dans chaque puits mis à 0,2 um stériles sucrose filtrée à 20% de saccharose et de 13,3% au total des concentrations de peptide de 5 mg / ml et 2,5 mg / ml, respectivement pour atteindre une concentration de BD 2x PuraMatrix de 10% de saccharose. <ol class="lalpha"><li> Faire 20% de saccharose, diluer 10 g de saccharose, puis le volume à 50 ml d'eau. </li><li> 13% et 10% de saccharose peut être préparé en diluant la solution stock de 20%. <ol class="lroman"><li> 13% de saccharose (pour chaque 10 ml): 6,5 ml de saccharose à 20% + 3,5 ml stériles H 2 O. </li><li> 10% de saccharose (pour chaque 10 ml): 5,0 ml de saccharose à 20% + 5,0 ml stériles H 2 O. </li></ol></li></ol></li><li> Préparer un mélange maître de peptide PuraMatrix basé sur le nombre de puits que vous l'intention de la plaque. (Voir l'exemple ci-dessous.) Puis aliquotes dans des tubes individuels contenant 25 ml de mélange maître. <ol class="lalpha"><li> Le master mix doit être préparé à deux fois la concentration finale souhaitée du peptide totale car il sera dilué avec un volume égal de cellules pendant le placage. <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig11.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"></li></ol></li><li> Préparer les suspensions de cellules par trypsinisation cultures cellulaires monocouche cellulaire. <ol class="lalpha"><li> 2 ml de Trypsine EDTA 0,05% peut être utilisé pour chaque flacon T-75. </li></ol></li><li> Neutraliser la trypsine par addition de milieux de culture cellulaire contenant 10% inactivé par la chaleur du sérum de veau fœtal (utiliser au moins 2 ml de milieu par ml de trypsine utilisée dans l'étape précédente.) </li><li> Centrifuger les cellules à 1000 rpm (~ 300 xg) pendant 5 minutes pour créer un culot cellulaire. <ol><li> Resuspendre les cellules dans 10% de saccharose filtrée stérile. </li><li> Compter les cellules et les spin-down à nouveau à 1000 rpm (~ 300 xg) pendant 5 minutes pour éliminer des traces de sel dans les médias. </li></ol></li><li> Resuspendre les cellules OVCAR-5 dans 10% de saccharose à 2,0 x 10 5 cellules / ml sorte que le nombre final de cellules par puits sera 5000 cellules dans chaque puits. Les étapes suivantes doivent être effectuées rapidement. </li><li> Ajouter 25 ul de l'2,0 x 10 5 cellules / ml, suspension pour le premier tube individuels contenant 25 ul du mélange maître de PuraMatrix comme le montre le schéma ci-dessus. <ol class="lalpha"><li> Mélanger rapidement à la pipette (~ 5 fois haut et bas) dans le tube, sans introduire de bulles d'air. </li><li> Puis la pipette de la cellule de 50 ul de suspension / PuraMatrix mélange dans le puits approprié d'un plat de 96 puits. </li><li> Initier la gélification de la BD par PuraMatrix délicatement pipetage 150 ul milieux de culture cellulaire (RPMI + 10% de FBS) sur le côté du puits <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig12.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"></li></ol></li><li> Répétez les étapes décrites dans 8 jusqu'à ce que tous les puits ont été plaqués. </li><li> Après 30 minutes très doucement supprimer ~ 2 / 3 de la presse à l'aide d'une pipette 200 pi pour équilibrer le pH de l'hydrogel. <ol class="lalpha"><li> NE PAS UTILISER un aspirateur AS Cela perturbera LA MATRICE </li><li> Placez la pointe de la pipette dans le puits afin qu'il ne touche pas le lit PuraMatrix et retirez délicatement les médias à partir du puits. </li><li> Des précautions doivent être prises pour ne pas perturber la matrice lors de la culture de cellules dans PuraMatrix. </li></ol></li><li> Très doucement, ajouter 150 l de frais milieux de culture cellulaire sur le côté des cellules contenant ainsi encapsulé dans PuraMatrix. </li><li> Changer le milieu de culture cellulaire dans chaque puits toutes les 48 heures avec milieu de culture frais en prenant soin de répéter les étapes 10 et 11. </li></ol> Les résultats représentatifs: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1692/1692_fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig1tmb.jpg" alt="Figure 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"></a> Figure 1. OVCAR-5 cellules ont été encapsulé comme décrit dans le protocole ci-dessus. Les images ont été acquises en utilisant une inversé Olympus FV1000 microscope équipé de Spectra-Physics DeepSee Ti: Sapphire laser réglé à 750 nm. Séances d'imagerie ont été menées sur les jours 1, 3, 5 et 7 de post-plaquage. Une longue distance de travail, de l'eau plongeant objectif 40x (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) a été utilisé pour l'image à travers le PuraMatrix. Tridimensionnelle des volumes ont été recueillies par l'acquisition de piles d'images dans les étapes 1,47 um axiale. Deux organisations non descanned détecteurs recueillies à l'aide de l'émission l'autofluorescence violet (440-490 nm) et vert (510-550 nm) filtres passe-bande. Les images finales et les films pile de profondeur ont été traitées à l'aide ImageJ en combinant deux canaux de détection.

<ol><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+Peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS One. 1, e119-e119 (2006).</li>
</ol>

l&#39;encapsulation des cellules cancéreuses puramatrix

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Plus de preuves suggèrent que les cellules cancéreuses en culture en trois dimensions avec plus de précision récapitule la complexité de la biologie de la tumeur. Beaucoup de ces modèles utilisent la membrane basale reconstituée issus d&#39;animaux qui contiennent une quantité variable de facteurs de croissance et cytokines qui peuvent influencer la croissance de ces modèles de culture cellulaire. Ici, nous décrivons en détail la préparation et l&#39;utilisation de PuraMatrix, un gel auto disponibles commercialement peptide montage qui est dépourvu de matériels d&#39;origine animale et des agents pathogènes d&#39;encapsuler et de propager la lignée cellulaire du cancer de l&#39;ovaire, OVCAR-5. Nous commençons par décrire comment préparer le PuraMatrix avant utilisation. Ensuite, nous démontrons comment bien mélanger la suspension cellulaire PuraMatrix et d&#39;encapsuler les cellules de l&#39;hydrogel. Lors de l&#39;ajout de milieux de culture cellulaire ou l&#39;injection dans un environnement physiologique, la composante du peptide PuraMatrix rapide auto assemble en un hydrogel 3D qui présente une structure fibreuse nanomètre échelle avec une taille moyenne de pores de 500 à 200 nm<sup&gt; 1</sup&gt;. En outre, nous démontrons comment propager les cultures cultivées en PuraMatrix encapsulé. Lorsque encapsulé dans PuraMatrix, OVCAR-5 cellules s&#39;assemblent en trois structures acineuses dimensions qui ressemblent plus à la morphologie des nodules micrométastatique observés dans la clinique de monocouche dans des modèles in vitro. En utilisant la microscopie confocale, nous illustrons l&#39;apparence d&#39;un représentant OVCAR-5 cellules encapsulées dans PuraMatrix le jour 1, 3, 5 et 7 plaquage poste. L&#39;utilisation de PuraMatrix aux cellules cancéreuses de la culture devrait améliorer notre compréhension de la maladie et nous permettre d&#39;évaluer la réponse au traitement dans des systèmes modèles prédictifs plus cliniquement.

Cette vidéo montre comment encapsuler et les cellules cancéreuses de la culture dans les PuraMatrix, une auto disponibles commercialement assemblage gel de peptides.

L&#39;encapsulation des cellules cancéreuses PuraMatrix

De plus en plus de données suggèrent que la culture de cellules cancéreuses en trois dimensions récapitule plus fidèlement la complexité de la biologie tumorale. Bon nombre de ces...

Les modèles de culture cellulaire en monocouche se sont révélés des outils très utiles pour l'étude de diverses maladies, notamment le cancer. Toutefois, ces modèles ne parviennent pas à reproduire le microenvironnement tridimensionnel observé in vivo. Cette vidéo démontrera l'utilisation de Matrixx pur, un gel peptidique auto-assemblant disponible commercialement, pour encapsuler et propager la lignée cellulaire de cancer ovarien CAR five.La suspension cellulaire est mélangée avec la Matrice pure et le milieu de culture. Un milieu est ajouté pour initier l'activation de la Matrice pure lorsque les cellules Carv cinq sont encapsulées et cultivées dans la Matrice pure, formant des structures tridimensionnelles ASIN R qui ressemblent à la morphologie des nodules micrométastatiques. Bonjour, je suis Adnan Abbi.Je suis chercheur postdoctoral dans le laboratoire du Dr TBA Hassan au Woman Center for Photo Medicine du Massachusetts General Hospital. Aujourd'hui, nous allons vous présenter un protocole permettant d'encapsuler et de cultiver une lignée cellulaire de cancer de l'ovaire dans une matrice synthétique appelée pure matrix. Nous utilisons ce modèle afin d'évaluer la réponse au traitement du cancer de l'ovaire dans notre laboratoire.Commençons. Le gel hydrophile de peptide RAD 16 matrice BD 1 % pure possède une concentration totale de peptide de 10 milligrammes par millilitre avant utilisation. Réduisez la viscosité de la matrice pure en la soniquant dans un bain d'eau pendant 30 minutes ; après la sonication, maintenez des conditions stériles.Prélevez des aliquotes de la solution matricielle pure à 1 % dans des tubes stériles. Pour simplifier les expériences futures, évitez la formation de bulles d'air ; si des bulles se forment, centrifugez simplement les tubes stériles contenant la matrice pure à 1000 tr/min pendant cinq minutes. Dans cette démonstration, nous allons ensemencer deux séries de quatre puits à 2,5 milligrammes par millilitre et 1,25 milligramme par millilitre respectivement, en fonction de la concentration totale en peptide. Préparez deux mélanges maîtres de peptide matriciel pur en fonction du nombre de puits que vous prévoyez d'ensemencer, soit huit dans ce cas.Chaque mélange maître doit être préparé à deux fois la concentration finale souhaitée en peptide total, car il sera dilué avec un volume égal de cellules lors du semis. Pour ce faire, diluez la matrice pure avec du saccharose stérile à 10 % et du saccharose à 13,3 % afin d'obtenir des concentrations finales en peptide total de cinq milligrammes par millilitre et 2,5 milligrammes par millilitre, respectivement, ce qui permet d'obtenir une concentration deux fois supérieure de matrice pure dans du saccharose à 10 %. Ensuite, aliquotez 25 microlitres des mélanges maîtres dans huit tubes individuels. Les mélanges maîtres de matrice pure sont désormais prêts pour l'encapsulation cellulaire. La lignée cellulaire de cancer ovarien CAR cinq sera encapsulée et propagée dans cette expérience ; avant la trypsine, incubez les cellules avec 10 millilitres de PBS stérile sans calcium ni magnésium pendant 15 à 20 minutes.Aspirez le PBS et la trypsine d'une culture cellulaire en couche unique, puis neutralisez la trypsine en ajoutant un milieu de culture cellulaire contenant 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur. Utilisez au moins deux millilitres de milieu par millilitre de trypsine utilisé à l'étape précédente. Ensuite, transférez les cellules dans des tubes de centrifugation et centrifugez-les à 1000 tr/min pendant cinq minutes afin d'obtenir un culot cellulaire.Après la centrifugation reus, suspendre le culot cellulaire dans du saccharose stérile à 10 %. Compter les cellules et les centrifuger à nouveau à 1000 tr/min pendant cinq minutes. Pour éliminer les traces de sel présentes dans le milieu, resuspendre les cellules O car cinq dans du saccharose à 10 % à une concentration de deux fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre, de sorte que le nombre final de cellules par puits soit de 5 000 cellules dans chaque puits.Les cellules sont désormais prêtes pour l'encapsulation dans la pur Matrixx. Les étapes suivantes pour l'encapsulation des cellules dans la matrice pure doivent être réalisées rapidement : ajouter 25 microlitres de la suspension cellulaire préparée précédemment dans le premier tube individuel contenant 25 microlitres du mélange maître de pure Matrixx. Mélanger rapidement en pipetant environ cinq fois vers le haut et vers le bas dans le tube, sans introduire de bulles d'air.Ensuite, pipeter le mélange de 50 microlitres de suspension cellulaire et de Matrixx pur dans le puits approprié d'une plaque de culture cellulaire à 96 puits. Initier la polymérisation du Matrixx BD en ajoutant délicatement 150 microlitres de milieu de culture cellulaire sur la paroi du puits. Répéter les étapes d'encapsulation des cellules pour les puits restants.N'oubliez pas que ces étapes doivent être effectuées rapidement et que la procédure d'encapsulation entière doit être complétée pour un puits avant de passer au suivant. Une fois les huit puits ensemencés, incubez les cellules pendant 30 minutes. Au bout de 30 minutes, à l'aide d'une pipette de 200 microlitres, placez la pointe de la pipette dans le puits de manière à ne pas toucher le lit de matrice pur et retirez très doucement le milieu du puits. Environ les deux tiers du milieu doivent être retirés afin d'équilibrer le pH de l'hydrogel.Ne pas utiliser un aspirateur sous vide car cela perturberait la matrice. Ensuite, ajouter très délicatement 150 microlitres de milieu frais de culture cellulaire sur le côté du puits contenant les cellules encapsulées dans la Matrixx pure. De la même manière que montré précédemment, retirer les deux tiers du milieu et ajouter du milieu frais aux puits restants.Remplacer le milieu de culture cellulaire dans chaque puits toutes les 48 heures par du milieu frais. Des cellules OR5 ont été encapsulées comme indiqué dans le protocole suivant. Des rendus 3D représentatifs d'images de cellules OR5 encapsulées et cultivées en matrice pure aux jours 1, 3, 5 et 7 sont présentés.Nous venons donc de vous montrer comment encapsuler en culture la lignée cellulaire de cancer ovarien CAR cinq dans une matrice synthétique appelée Pure Matrixx. Lorsque vous utilisez Pure Matrixx, il est important de garder à l'esprit que ce protocole a été optimisé pour la lignée cellulaire O Car cinq. Chaque chercheur devra optimiser et ajuster finement le protocole à sa propre lignée cellulaire.Et n'oubliez pas que lors des changements de milieu, il est très important de ne pas perturber le lit matriciel car il est très fragile ; n'aspirez jamais et utilisez toujours une pipette. Voilà, c'est tout. Merci beaucoup d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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