Name: Un protocole pour la production de KLRG1 tétramère (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Apprenez à produire des tétramères KLRG1 pour l'analyse des ligands en immunologie. Cette méthode utilise l'expression bactérienne et l'induction IPTG pour étudier les interactions récepteur-ligand.

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Nous remercions le Dr Naidenko pour les aider à optimiser les conditions de repliement. Ce travail a été soutenu par le NIH recherche AI58181 accorder à Laurent Brossay. Cindy Banh est soutenu par les NIH NRSA F31 AI080230. Stephanie Terrizzi et Cindy Banh contribuent également à ce travail.

Préparation de corps d'inclusion <ol><li> Inoculer 4 x flacons de 500 ml de tuberculose chaque contenant 50 pg / ml de chloramphénicol et de carbénicilline avec une culture de nuit de bactéries exprimant la construction KLRG1 plasmide. Lorsque la DO atteint 0,6 A à 600 nm, induire avec l'ajout de 0,4 M IPTG et incuber la culture pour 4 heures supplémentaires d'agitation à 37 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules récoltées dans le pH tampon de resuspension = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 25% (p / v) de saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Remarque: Les granulés peuvent être congelés à ce stade. </li><li> Piscine pas plus de 60 ml de remises en suspension bactérienne dans un bécher en polypropylène. Si nécessaire, ajuster à 60 ml avec du tampon TE pH 8,0 et remuer le mélange à demi-vitesse. </li><li> Pour en remuant le mélange ajoutez goutte à goutte: le lysozyme (finale = 1 mg / ml), MgCl2 (finale = 5 mm), 2 mg DNAse I dans le glycérol à 50% contient 75 mM de NaCl, Triton-X100 (finale = 1%), TNT ( final = 10 mM). </li><li> Soniquer la solution sur la glace pendant 1,5 min et centrifuger les lysats à 5000 rpm pendant 10 min à 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Décanter le surnageant. </li><li> Ajouter 15 ml de tampon de lavage pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% de Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). </li><li> Sur la glace, soniquer solution pour 1,5 min jusqu'à ce que la pastille est complètement remis en suspension. </li><li> Centrifuger les échantillons à 5000 rpm pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Répétez le lavage 5 fois. </li></ol></li><li> Répétez 5b avec un tampon de lavage sans Triton X-100, centrifugeuse et remettre en suspension dans 4 ml de tampon TE. </li><li> Prenez l'inclusion poids humide des organes boue et de stocker dans un tampon TE à une concentration de 30 à 100 mg / ml. </li></ol> Repliement des KLRG1 <ol><li> Faire 1 L de repliement tampon pH = 8,0 (0,4 M arginine-HCl, 0,1 M Tris pH 8 à 8,3, EDTA 2 mM, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA sans comprimés inhibiteur de la protéase, 5 GSH mM et 0,5 mM GSSG) et le froid à 4 ° C tout en remuant. </li><li> Préparer le corps d'inclusion pour l'injection dans le mélange de pliage: Il est idéal pour faire 5 10 injections chacun avec 0,25 0,5 uM de concentration de telle sorte que la concentration finale de la protéine sera 2 3 uM. <ol class="lalpha"><li> Faire fondre le volume de 50 mg de corps d'inclusion dans la boue 7 M GnHCl avec 10 mM de β-mercaptoéthanol. </li><li> Gardez à l'inclusion des organismes / mélange GnHCl à 37 ° C pendant 30 - 40 min et le vortex toutes les 5 min pour assurer une fusion complète (lisier deviendra clair quand il est complètement fondu). </li><li> Centrifugeuse à vitesse max pendant 30 min dans microcentrifugeuse à 4 ° C et le transfert du surnageant dans un tube à centrifuger de 15 ml. Ne pas transférer toute la petite pastille noirâtre. </li></ol></li><li> Régler le volume avec le tampon d'injection (3 M GnHCl, 10 NaAcetate mM, pH 4.2,10 mM EDTA). </li><li> Injecter 1 ml de corps d'inclusion diluée à chaque heure. Lors de l'injection, mélanger à haute vitesse, ajouter 1 ml de corps d'inclusion déposer diluée à goutte avec 2 secondes entre chaque goutte. Lorsque l'injection est faite, mélanger à basse vitesse. </li><li> Continuer nuit d'agitation à basse vitesse à 4 ° C. </li></ol> Concentration des réactions Repliement <ol><li> Après le protocole Millipore s, concentrer la L 1 du pré-filtrée (0,22 um filtrée) la réaction de repliement en utilisant une cellule agitée Amicon YM10 et la membrane d'ultrafiltration NMWL 10K (Millipore) à ~ 10 ml. </li><li> Concentré à ≤ 2 ml en utilisant un Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li></ol> Purification de KLRG1 tétramère <ol><li> Configuration du AKTAFPLC à 4 ° C, selon GE Healthcare manuels. </li><li> Purifier la forme monomère du KLRG1 par chromatographie d'exclusion stérique en utilisant un Sephacryl S-200 à haute résolution 16/60 colonne (GE Healthcare) dans HEPES 20 mM et 150 mM de NaCl. (Voir figure 1). </li><li> Concentré à 1 ml en utilisant Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li><li> Utilisez l'enzyme BirA conformément au protocole d'avidité s biotinyler le monomère KLRG1. </li><li> La biotine libre est éliminé par chromatographie d'exclusion stérique comme dans 2. </li><li> KLRG1 molécule est tetramerized en mélangeant KLRG1 monomère avec 4 fois molaire supérieure streptavidine conjuguée PE (BD Biosciences). </li></ol> Les résultats représentatifs <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="Figure 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"></a> Figure 1. Représentant des résultats positifs de la chromatographie d'exclusion stérique AKTA FPLC de l'repliée KLRG1. Le graphique montre la séparation du monomère (83,52 ml), dimère (56,36 ml), et multimère (36,26 ml) sous forme de KLRG1 repliée. Le pic à 94,25 ml représente l'échange de tampon.

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

Dans ce protocole, il est montré comment purifier, biotinyler et KLRG1 tetramerize. KLRG1 tétramère peut être utilisé pour étiqueter KLRG1 ligands par cytométrie en flux. Bien que les conditions de repliement devra être testé empiriquement pour chaque protéine, d&#39;autres lectines de type C pourrait être tetramerized utilisant un protocole similaire. En utilisant des protéines tetramerized comme sondes, des ligands de récepteurs orphelin lectine de type C pourrait potentiellement être identifiés.

<table><tbody><tr><td>Enzyme BirA et tampon</td><td>Kit de biotinylation</td><td>Avidité</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Comprimés complets d'inhibiteurs de protéases, sans EDTA</td><td>Réactif</td><td>Groupe Roche</td><td>11 836 170 001</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Cellule d'agitation Amicon</td><td>Équipement</td><td>EMD Millipore</td><td>Modèle n°8400</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Mémbane d'ultrafiltration YM10 NMWL 10K</td><td>Matériel de filtration</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur YM10 de 15 ml</td><td>Matériel de filtration</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>Équipement</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Colonne haute résolution Sephacryl S-200 16/60</td><td>Équipement</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine PE</td><td>Réactif</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>ou équivalent</td></tr></tbody></table>

un protocole pour la production de klrg1 tétramère

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Récepteurs des cellules tueuses G1 lectine-like (KLRG1) est un récepteur de type II glycoprotéine transmembranaire inhibiteurs appartenant au type C de type lectine superfamille. KLRG1 existe à la fois comme un monomère et comme un homodimère ponts disulfure. Ce récepteur est bien conservé se trouve sur la plupart des cellules matures et récemment NK activées ainsi que sur un sous-ensemble de lymphocytes T effecteurs / mémoire. Utiliser KLRG1 tétramère ainsi que d&#39;autres méthodes, E, N, et R-cadhérines ont été identifiés comme KLRG1 ligands. Ces Ca 2 + cellulaire dépendante des molécules d&#39;adhésion cellulaire comprend un domaine extracellulaire contenant cinq répète cadhérine responsable des interactions cellule-cellule, un domaine transmembranaire et un domaine cytoplasmique qui est liée au cytosquelette d&#39;actine. Génération du tétramère KLRG1 était essentielle pour l&#39;identification des ligands KLRG1. KLRG1 tétramère est également un outil unique pour élucider la cadhérine rôles et jouer dans la régulation de KLRG1 la réponse immunitaire et l&#39;intégrité des tissus.

Ce protocole décrit la production de KLRG1 tétramère, qui est un outil puissant pour l&#39;analyse des KLRG1 ligands.

Un protocole pour la production de KLRG1 tétramère

Le récepteur inhibiteur G1 de type lectine des cellules tueuses (KLRG1) est un récepteur glycoprotéique transmembranaire de type II appartenant à la superfamille des lectines de type C. ...

Bonjour, je suis Stephanie Resi du laboratoire de Lauren Parce, du Département de microbiologie moléculaire et d'immunologie à l'université Brown. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour la génération de tétramères K LRG un. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les interactions cohérentes de K LRG un.Commençons. Tout d'abord, ensemencez quatre flacons de 500 millilitres de tampon TB contenant les antibiotiques appropriés avec des bactéries exprimant la construction plasmidique K LRG un, puis faites croître à 37 degrés Celsius sous agitation jusqu'à ce que la DO atteigne 0,6, mesurée à 600 nanomètres ; induisez alors l'expression via le promoteur T7 par l'ajout de 0,4 molaire de IPTG et incubez la culture pendant quatre heures supplémentaires sous agitation à 37 degrés Celsius. Après l'incubation de quatre heures, transférez les bactéries dans des tubes de centrifugation et centrifugez les cultures pendant 20 minutes à 3000 tr/min et à 4 degrés Celsius.Si nécessaire, les culots peuvent être congelés à moins 80 degrés Celsius à ce stade pour une utilisation ultérieure. Resuspendre les cellules récoltées dans 30 millilitres de tampon de resuspension Resus. Ensuite, rassembler les suspensions bactériennes Resus jusqu'à un volume de 60 millilitres dans un bécher en polypropylène.Si nécessaire, porter le volume total à 60 millilitres avec du tampon TE supplémentaire à pH huit et mélanger le mélange à mi-vitesse sur un agitateur chauffant pendant que la suspension de Resus en pool est agitée avec les solutions suivantes. Ajouter goutte à goutte au mélange : lysozyme, chlorure de magnésium, D NS un, TRITON X-100, et enfin DTT.Transférez la solution dans des tubes d'ultracentrifugation à l'aide d'un broyeur à fisure muni d'un convertisseur ultrasonique à une amplitude de 30 %. Soniquez la solution sur de la glace pendant 1,5 minute, puis centrifugez le lysat à 5 000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Versez délicatement le surnageant et ajoutez 15 millilitres de tampon de lavage. Répétez la sonication comme précédemment jusqu'à ce que le culot soit complètement resuspendu, puis répétez la centrifugation. Répétez les étapes de lavage et de centrifugation cinq fois. Enfin, resuspendez le culot à l’aide de tampon de lavage ne contenant pas de Triton X-100. Faites une dernière centrifugation, puis resuspendez dans quatre millilitres de tampon TE. Ce sont vos corps d'inclusion.Quantifiez vos corps d'inclusion par poids humide. La suspension de corps d'inclusion peut être conservée à quatre degrés Celsius dans des tampons à des concentrations de 30 à 100 milligrammes par millilitre. Une fois les corps d'inclusion prêts, vous pouvez maintenant vous préparer au repliement.Commencez la procédure de repliement en préparant une bouteille fraîche d'un litre de tampon de repliement et en agitant doucement à quatre degrés Celsius pour refroidir. Ensuite, préparez sept injections de corps d'inclusion destinées à être injectées dans le tampon de repliement. Tout d'abord, faites fondre le stock de suspension de corps d'inclusion dans un tube de microcentrifugeuse contenant un volume final de 1,4 millilitre dans du chlorure de guanidine sept molaire plus 10 millimolaire de β-mercaptoéthanol dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 à 40 minutes.Vortexez toutes les cinq minutes. Vous saurez que la fusion est terminée lorsque la suspension devient claire.Centrifuger une minute à vitesse maximale dans un microcentrifugeuse à quatre degrés Celsius. Ensuite, en prenant soin de ne pas recueillir le petit culot noirâtre, transférer le surnageant dans un tube de centrifugation de 15 millilitres.Ajuster le volume à sept millilitres avec du tampon d'injection pour l'injection. Augmenter d'abord la vitesse d'agitation du mélange de repliement à élevé. Puis ajouter un millilitre de corps d'inclusion dilués.Goutte à goutte, avec deux secondes entre chaque goutte uniquement. Ajouter un millilitre de corps d'inclusion dilués à la fois, avec une heure d'intervalle entre chaque injection. Revenir à une vitesse de rotation faible.Poursuivre l'agitation à faible vitesse à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Les protéines seront alors prêtes à être concentrées et purifiées. Pour commencer à concentrer les tétramères de KLRG1 repliés.Commencez par préfiltrer la réaction à l’aide d’un filtre de 22 micromètres. Ensuite, concentrez la réaction d’un litre à environ 10 millilitres à l’aide d’une cellule à agitation Millipore Amicon et d’une membrane de filtration ultrafine ayant une limite nominale de poids moléculaire de 10 kilodaltons, conformément aux instructions du fabricant et de S. Puis, à l’aide d’une membrane de filtration ultrafine Millipore ayant un seuil de poids moléculaire de 10 kilodaltons, concentrez davantage jusqu’à un volume inférieur ou égal à deux millilitres.Configurez votre système de chromatographie conformément aux instructions du fabricant. Nous utilisons le système de chromatographie liquide rapide de protéines ACTA de GE Healthcare à quatre degrés Celsius, avec une colonne haute résolution. Purifiez la forme monomérique de K lrg, dans un tampon contenant 20 millimolaires de heaps et 150 millimolaires de chlorure de sodium, par chromatographie d'exclusion stérique.Le volume injecté doit être inférieur à 2 % du volume total du gel de la colonne. Ensuite, à l’aide d’une membrane de filtration ultrafine Millipore ayant un seuil de coupure en poids moléculaire de 10 kilodaltons, concentrer davantage selon les instructions du fabricant jusqu’à un volume final d’un millilitre par monomère KLG. Éliminer la biotine libre en purifiant comme précédemment par chromatographie d’exclusion stérique afin d’obtenir le tétramère.Mélangez les monomères KL LRG un avec un excès molaire quadruple de tétramères de streptavidine conjugués à la FICO rine, désormais disponibles pour le marquage des ligands récepteurs. Ce graphique montre un résultat positif de la séparation des protéines K lrg un repliées par chromatographie d'exclusion stérique, de gauche à droite. Les pics illustrent les formes multimère, dimère et monomère de K LRG un.Le pic situé à l'extrême droite représente l'échange de tampon. Bien que les conditions de repliement doivent être testées empiriquement pour chaque protéine, d'autres récepteurs de type lectine C devraient pouvoir former des tétramères selon un protocole similaire, permettant ainsi l'identification potentielle d'autres ligands. Nous venons de vous montrer comment générer le tétramère KLRG1 lors de cette procédure.Il est important de se rappeler de vérifier les niveaux d'induction et de respecter strictement les conditions de repliement. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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