Préparation des os décalcifiés pour l'histologie, histomorphométrie et analyse Fluorochrome
8 janvier 2010
Histologie osseuse décalcifiés fournit des informations importantes pour une variété d'applications cliniques et de recherche. Il est techniquement difficile, en particulier avec des spécimens de grande taille. Cette vidéo illustre le processus de production de sections de bonne qualité et démontre les difficultés techniques et des méthodes permettant de les surmonter.
Et l'histologie osseuse décalcifiée met en évidence la microarchitecture de l'os en montrant à la fois les composants minéralisés et cellulaires, fournissant des informations essentielles sur le remodelage osseux, la formation et la résorption osseuses. Cela revêt une importance considérable dans diverses applications cliniques et de recherche. Elle permet d'obtenir des images de grande qualité et autorise des techniques telles que l'évaluation en fluorescence et l'histo-optométrie.
La réalisation d'histologies sous os calcifié est techniquement difficile, particulièrement avec des échantillons de grande taille. Cette vidéo démontrera les difficultés techniques et les méthodes permettant de les surmonter afin d'obtenir des sections sous os calcifié. Elle n'abordera pas l'évaluation histomorphométrique de ces sections.
Pour cela, nous vous renvoyons à la publication importante suivante. Cette vidéo couvrira la préparation des échantillons et le traitement de fixation, l'inclusion, la coupe en sections tant par meulage que par découpe, la préparation des lames et la coloration après le prélèvement des tissus. L'échantillon.
Dans ce cas, la colonne vertébrale cervicale de mouton est placée dans un récipient hermétique et opaque contenant une solution tamponnée au phosphate à 10 %. L'exposition à la lumière doit être minimale si une analyse au fluorochrome doit être réalisée. Étant donné que les fluorochromes sont sensibles à la lumière, l'échantillon est ensuite transporté au laboratoire et taillé à la bonne dimension, ce qui améliore la fixation et garantit qu'il s'insère correctement dans un bloc.
Bien que l'orientation du tissu sur la lame doive être connue à ce stade afin que le bloc puisse être préparé dans le plan correct. La sécurité est très importante et les instruments doivent être utilisés de manière à maintenir les mains à l'écart de la lame. Leur zone d'intérêt est désormais découpée à la taille souhaitée.
La découpe finale est ensuite effectuée à l’aide d’une petite scie à ruban, ce qui entraîne une perte tissulaire moindre. Une fois que le bloc a été découpé à la bonne taille, il est placé dans un récipient scellé et opaque contenant de la solution fraîche afin de terminer la fixation. Le volume du récipient doit être d’environ 10 fois la taille de l’échantillon.
Pour obtenir une fixation adéquate, le spécimen doit rester dans la formule et la solution entre une et deux semaines, selon sa taille, après quoi il est transféré dans de l'éthanol à 70 %. La transformation est ensuite effectuée lentement, car la grande taille des blocs et la faible perméabilité de l'os rendent la diffusion des solvants lente. La déshydratation est ensuite réalisée à l'aide de concentrations croissantes d'éthanol, suivie d'un éclaircissement dans le butanol. Le spécimen est maintenu à l'abri de la lumière et sous agitation constante.
Nous recommandons environ une semaine dans chaque solution. Le traitement prend donc environ quatre à six semaines. Cette étape ne doit pas être précipitée, car cela compromettrait la qualité finale des coupes.
Il existe plusieurs options d'inclusion pour l'os calcifié. Le choix de la résine ou du méthacrylate dépend de l'analyse à effectuer. Par exemple, l'immunohistochimie n'est pas possible avec toutes les résines.
Les résines époxy nécessitent une lumière UV pour le durcissement, ce qui interférerait avec l'analyse des fluorochromes. Nous recommandons de consulter les spécifications du fabricant avant de faire un choix réfléchi. Nous utilisons le TEVI 7, 100 car il permet d'obtenir de bonnes sections coupées et polies pour la microscopie optique et l'analyse des fluorochromes, tout en étant économique.
La considération importante concernant l'inclusion est que la densité de l'os et celle du milieu d'inclusion doivent être étroitement appariées. Cela est très important lors de la découpe ultérieure des blocs, en particulier pour les sections microscopiques. Le mélange est préparé conformément aux instructions du fabricant et vigoureusement agité. Il peut être utile d'inclure quelques échantillons tests afin d'optimiser le protocole.
Contrairement à la paraffine, cette étape est irréversible. Les blocs sont placés avec la surface de coupe vers le bas dans le moule. Le moule sera plus grand que le bloc afin d'assurer un soutien et une résistance suffisants.
L'infiltration de méthacrylate doit être effectuée lentement afin de permettre une infiltration maximale du méthacrylate dans l'os. Là encore, il convient de minimiser l'exposition à la lumière. Après une semaine dans une solution d'infiltration, celle-ci est remplacée et la solution de durcissement est ajoutée.
Une plaque de support est ensuite fabriquée. Nous utilisons du tevit 30 40 à cet effet. Le moule est ensuite retiré délicatement et le bloc est désormais prêt.
Le découpage par meulage produit des sections plus épaisses, comprises entre 20 et 50 micromètres d'épaisseur. Il est utile pour l'analyse en fluorescence, car des sections plus épaisses produisent une fluorescence plus intense. Pour réaliser la section par meulage, un microtome est nécessaire, de préférence équipé d'une lame en diamant. Nous utilisons une lame en diamant courbe de 0,6 millimètre.
Un lubrifiant est indispensable. Nous préférons un lubrifiant à base de pétrole, bien qu'un lubrifiant à base de silicone fonctionne également bien. Le bloc est ensuite placé dans la pince.
Il est fixé dans le porte-objet macro et le bloc est avancé vers la lame. La première coupe expose la surface de sectionnement et permet l'orientation de la coupe. Elle doit être éliminée.
Le meulage est un processus lent qui ne doit pas être précipité. Une lubrification adéquate doit être assurée pendant le meulage de la section. Elle est ensuite placée sur une lame.
Il peut être nettoyé et poli selon les besoins. La coupe a tendance à s'enrouler, nous recommandons donc de placer un morceau de sachet sandwich par-dessus et de la maintenir à plat, avec une autre lame fixée en place.
Il est ensuite placé dans un incubateur à une température comprise entre 60 et 80 degrés Celsius pendant une heure. Cela ramollit un méthacrylate et favorise l'adhérence de la section sur la lame de façon plane. Ici, nous observons une image fluorescente composite de trois fluorochromes différents injectés à des intervalles mensuels.
Ceci permet d'identifier le site de minéralisation à un moment précis. Les doses et la préparation de ces marqueurs sont indiquées dans le texte. Le terme micro fournit des sections minces, idéales pour la microscopie optique.
Il s'agit d'un processus techniquement difficile. Nous conseillons d'utiliser un microtome à coulisse pour la résistance supplémentaire qu'il offre lors de la découpe de ces blocs durs. Différents types de lames peuvent être utilisés, notamment des lames en carbure de tungstène.
Cependant, nous recommandons une lame en acier inoxydable, car celle-ci peut être facilement et fréquemment réaffûtée selon les besoins. La lame doit être orientée de manière à former un angle de 45 degrés avec un bloc. La densité du méthacrylate est sensible à de nombreux facteurs, notamment l'humidité ambiante dans la pièce.
Le bloc doit donc être conservé sur une surface desséchée. Un ramollissement peut être obtenu en appliquant un papier humide sur le bloc si nécessaire ; plusieurs coupes peuvent être nécessaires pour atteindre les conditions de coupe adéquates afin d'obtenir une section de qualité. Là encore, le sac en plastique refermable et la lame supplémentaire sont fixés afin d'aplatir la section avant son placement dans l'incubateur.
La coloration est similaire à celle utilisée en histologie standard avec inclusion en paraffine, sauf que l'inclusion en cire n'est évidemment pas nécessaire. Les colorations couramment utilisées pour l'os comprennent la VSA avec contre-coloration à la safranine, la safranine, le vert clair ol, et le masson trichrome. Le protocole relatif à ces colorations est indiqué dans le texte.
Les réactifs sont sélectionnés et filtrés avant utilisation. Golden. La coloration est fréquemment utilisée en histooptométrie. Nous recommandons d'optimiser les colorations sur des lames-tests en premier lieu.
Après chaque étape, la lame peut être observée au microscope afin de vérifier les colorations correctes. Cela permet d'ajuster précisément la durée d'application de chaque colorant. Une fois le protocole de coloration optimisé, toutes les lames de l'expérience sont colorées simultanément dans un support, en suivant le même protocole, afin d'éviter que des variations de coloration n'affectent leur géométrie thermique.
Les lames seront ensuite insérées de manière standard. Nous vous souhaitons bonne chance dans votre expérience.
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Aperçu
L'histologie osseuse non décalcifiée est essentielle pour comprendre la microarchitecture osseuse, y compris les composants minéralisés et cellulaires. Cette vidéo illustre les difficultés techniques et les méthodes permettant d'obtenir des sections de qualité à partir de grands échantillons.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Histologie osseuse
- Applications cliniques
- Méthodologies de recherche
Contexte
- Le remodelage et la formation osseux sont essentiels pour la santé.
- Les coupes non décalcifiées fournissent des images détaillées de la structure osseuse.
- Des techniques telles que l'évaluation par fluorométrie améliorent l'analyse.
- Des difficultés surviennent avec les grands échantillons lors de la préparation histologique.
Objectif de l'étude
- Démontrer le processus d'obtention de coupes osseuses de qualité non décalcifiées.
- Mettre en évidence les difficultés techniques liées à la préparation histologique.
- Proposer des solutions pour surmonter ces défis.
Méthodes utilisées
- Préparation d'échantillons osseux non décalcifiés.
- Techniques de sectionnement d'échantillons de grande taille.
- Méthodes d'évaluation visuelle.
- Démonstration de techniques histologiques.
Résultats principaux
- Production réussie de coupes osseuses de haute qualité.
- Identification des difficultés techniques courantes.
- Méthodes efficaces pour surmonter les problèmes de préparation.
- Compréhension améliorée de la microarchitecture osseuse.
Conclusions
- L'histologie osseuse non décalcifiée est essentielle pour les applications cliniques et de recherche.
- Les défis techniques peuvent être efficacement gérés grâce à des méthodes appropriées.
- Des coupes de qualité fournissent des informations précieuses sur la santé osseuse.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'histologie osseuse non décalcifiée permet une visualisation directe des composants osseux minéralisés et cellulaires, fournissant des données essentielles sur le remodelage, la formation et la résorption osseuses. Cette approche soutient la validation de cibles dans les modèles de maladies squelettiques en préservant l'architecture tissulaire native pour une analyse quantitative. La méthode améliore la confiance prédictive dans les études précliniques en permettant une évaluation longitudinale des dynamiques de minéralisation par marquage au fluorochrome.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en préservant à la fois les compartiments osseux minéralisés et cellulaires pour une analyse mécanistique.
- Valeur opérationnelle : Soutient la réduction des risques biologiques grâce à l'observation directe des processus de formation et de résorption osseuses dans des échantillons pertinents pour la maladie.
- Valeur translationnelle : Facilite la confiance dans la cible en permettant la corrélation entre des critères d'évaluation histologiques et des résultats fonctionnels dans des modèles précliniques.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit des résultats quantitatifs d'histomorphométrie et d'analyse des fluorochromes pour une évaluation standardisée des taux de minéralisation osseuse.
- Valeur opérationnelle : Permet la reproductibilité des essais grâce à des protocoles standardisés de sectionnement, de coloration et d'acquisition d'images applicables à des flux de travail impliquant de nombreux échantillons.
- Valeur translationnelle : Facilite la préparation au criblage en générant des données quantitatives de minéralisation résolues dans le temps, adaptées à l'évaluation de composés en pharmacologie squelettique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Offre une continuité pertinente pour l'étude des maladies en permettant un suivi longitudinal du remodelage osseux, depuis la découverte jusqu'aux étapes de validation préclinique.
- Valeur opérationnelle : Permet de prendre des décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant des données quantitatives sur le phénotype osseux, validées par histomorphométrie.
- Valeur translationnelle : Renforce la prédiction et la réduction des risques grâce à la corrélation directe entre les motifs de marquage fluorochromique et les événements temporels de minéralisation dans les études d'intervention thérapeutique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de la cible jusqu'à l'identification du composé candidat et aux essais d'efficacité préclinique, en particulier pour les thérapeutiques ciblant l'os et la pharmacologie de sécurité squelettique.
- Découverte biologique : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en permettant la visualisation directe de l'activité des ostéoblastes et des ostéoclastes dans les tissus non décalcifiés.
- Écrantage : Assure la préparation des tests grâce à des protocoles standardisés de polissage et de sectionnement produisant des résultats quantifiables en fluorescence et en histomorphométrie.
- Analyse : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes, notamment la vitesse d'apposition minérale, la vitesse de formation osseuse et les chronologies de minéralisation dérivées des fluorochromes, permettant des comparaisons entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte à la continuité préclinique en permettant une évaluation longitudinale des dynamiques du remodelage osseux, essentielles à la validation des modèles de maladies squelettiques.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme histologique réutilisable pour les programmes de pharmacologie squelettique, grâce à des protocoles standardisés d'inclusion en résine, de sectionnement et de coloration applicables à divers modèles osseux et modalités thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive grâce à une évaluation directe et quantitative de la formation et de la résorption osseuses, sans artefacts de décalcification.
- Valeur opérationnelle : Standardisation et reproductibilité par le biais de protocoles validés d'inclusion, de sectionnement et de coloration pour des échantillons volumineux et denses.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions de poursuite ou d'abandon en développement de thérapeutiques squelettiques, en réduisant l'ambiguïté mécanistique des critères d'efficacité liés au remodelage osseux.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque des candidats ciblant l'os, fondée sur des signaux d'efficacité et de sécurité précliniques validés par histomorphométrie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en histologie osseuse, en techniques d'inclusion en résine et en protocoles de manipulation des fluorochromes.
- Requiert un équipement spécialisé, notamment des microtomes à coulisse, des macrotomes à lame de diamant et un environnement de traitement protégé de la lumière pour assurer la stabilité des fluorochromes.
- Exige une standardisation interéquipes des durées de fixation, de déshydratation et d'infiltration afin de garantir la qualité des sections sur des échantillons volumineux et peu perméables.
- Implique des adaptations selon les densités osseuses et les tailles d'échantillons variables, nécessitant des milieux d'inclusion adaptés à la densité et des durées de traitement prolongées.
- Comprend des limites pratiques telles que les étapes d'inclusion irréversibles, la sensibilité à la lumière des fluorochromes et les artefacts de recourbement des sections, nécessitant un aplatissage mécanique lors du montage.
