Name: Une réversible, méthode non-invasive pour les mesures de résistance des voies aériennes et déchantillonnage du liquide de lavage broncho-alvéolaire chez des souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Découvrez une méthode réversible et non invasive d'intubation orale chez la souris pour mesurer la résistance des voies aériennes et prélever le liquide de lavage broncho-alvéolaire. Cette technique permet des mesures répétées en physiologie respiratoire.

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Nous remercions le Dr W. Mintzer pour la suggestion de réaliser à fibre optique intubation orotrachéale. Soutenue par des subventions U19AI070973, R01AI057696, K02HL75243 et R01HL082487 de la National Institutes of Health.

<ol><li>Hamelmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+airway+responsiveness+in+allergic+mice+using+barometric+plethysmography%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 766-775 (1997).</li>
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<li>Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reevaluation+of+the+validity+of+unrestrained+plethysmography+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice.</a> J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).</li>
<li>Grunig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+IL-13+independently+of+IL-4+in+experimental+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma.</a> Science. 282, 2261-2263 (1998).</li>
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<li>Corry, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4%2C+but+not+interleukin+5+or+eosinophils%2C+is+required+in+a+murine+model+of+acute+airway+hyperreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4, but not interleukin 5 or eosinophils, is required in a murine model of acute airway hyperreactivity.</a> J. Exp. Med. 183, 109-117 (1996).</li>
<li>Amdur, M. O., Mead, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+respiration+in+unanesthetized+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanics of respiration in unanesthetized guinea pigs.</a> Am J Physiol. 192, 364-368 (1958).</li>
</ol>

L&#39;étude de l&#39;asthme, et diverses autres maladies obstructives des voies aériennes, constitue un domaine actif et croissant de la recherche biomédicale. Une composante importante de l&#39;asthme lié à la recherche expérimentale est la capacité à mesurer les variations de taille des voies aériennes dans des conditions variables. Rétrécissement des voies respiratoires excessive en réponse au défi provocateur, une fonction canonique de l&#39;asthme et des maladies pulmonaires liées à une propriété et de l&#39;hyperr...

Airway physiologie logiciel de mesure (Rescomp) a été spécialement préparé (Millenium Premier Group, 415-519-4371). Les données ont été analysées à l&#39;aide d&#39;un poste de travail PC sous Windows XP équipé d&#39;un processeur Pentium III (Intel, Inc Santa Clara, CA) et une analogique 17 broches pour signal numérique convertisseur (National Instruments, # PC-LPM16). Un petit animal voies respiratoires physiologie poste de travail a été spécialement assemblé (Millenium Premier Group) à l&#39;aide des capteurs de pression disponibles dans le commerce (pièce n ° TRD5700 et TRD4510), des modules de préampli (pièce n ° MAX2270), le châssis (n ° de pièce MAX1320, le tout à partir Buxco, Inc Wilmington, Caroline du Nord ) et un pléthysmographe animaux personnalisée de petite taille. 0,5 mm de diamètre externe de fibre optique fil, connecté à une source de lumière (Cole Palmer Illuminateur, 41722 séries) Ventilateur (Harvard Apparatus Souris Ventilateur, # 687) 10 mm, aiguille 27ga (BD Biosciences, cat. No. 309602) Lampe chauffante 1 ml seringue (BD Biosciences, cat. No. 305109) 4 pinces (pince poney printemps 3200) <br/&gt; 0,5 mm fil externe pour le guide de l&#39;intubation Hémacytomètre Lames de microscope Superfrost / plus (chat Fisher. No. 12-550-15) Shandon Filtre Cartes (Thermo chat. No. 5991022) Coulissant cellule différentielle tache (chat Fisher. No. 122911) Microscope optique (Leica) Cytospin 3 (Shandon) 20 ga, 1,25 pouces, cathéters intraveineux PROTECTIV (Smith médicale) 0,5 mm en fibre optique polymère (Edmund Optics # NT02-532). <!-- OLD Materials List 4/12/10 Changed
 Airway physiologie logiciel de mesure (Rescomp) a été spécialement préparé (Millenium Premier Group, 415-519-4371) et les données ont été analysées à l&#39;aide d&#39;un poste de travail PC sous Windows XP équipé d&#39;un processeur Pentium III (Intel, Inc Santa Clara, CA) et une 17-broches analogique en signal numérique (National Instruments, # PC-LPM16). Petit animal voies respiratoires physiologie poste de travail a été spécialement assemblé (Millenium Premier Group) à l&#39;aide des capteurs de pression disponibles dans le commerce (pièce n ° TRD5700 et TRD4510), préampli modules (n ° de pièce MAX2270) et le châssis (n ° de pièce MAX1320, le tout à partir Buxco, Inc Wilmington, Caroline du Nord) et un pléthysmographe animaux personnalisée de petite taille. 0,5 mm de diamètre externe de fibre optique fil, connecté à une source de lumière (Cole Palmer Illuminateur, 41722 séries); Ventilateur (Harvard Apparatus Souris Ventilateur, # 687), 10 mm, aiguille 27ga (BD Biosciences, cat no 309602..); Chaleur lampe; 1 ml seringue (BD Biosciences, cat no 305109..); 4 pinces (pince poney printemps 3200), 0,5 mm fil externe pour le guide de l&#39;intubation); hémacytomètre; Superfrost / lames de microscope plus (chat Fisher aucune 12-550.. -15); Shandon Filtre Cartes (cat Thermo pas 5.991.022);.. coulissant cellule différentielle tache (chat Fisher aucune 122,911);.. microscope optique (Leica); Cytospin 3 (Shandon), 20 ga, 1,25 pouces, cathéters intraveineux (PROTECTIV Smith médical); 0,5 mm fibre optique polymère (Edmund Optics # NT02-532). -&gt;

une réversible, méthode non-invasive pour les mesures de résistance des voies aériennes et d&#39;échantillonnage du liquide de lavage broncho-alvéolaire chez des souris

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperréactivité (PA) des mesures et des broncho-échantillonnage liquide de lavage (BAL) sont essentielles pour les modèles expérimentaux d&#39;asthme, mais les procédures maintes reprises d&#39;obtenir de telles mesures dans le même animal ne sont généralement pas faisable. Ici, nous démontrons protocoles pour l&#39;obtention de souris mesures répétées de la procréation assistée et broncho-liquide de lavage. Les souris ont été contestées par voie intranasale sept fois plus de 14 jours avec un allergène puissant ou fictive traitée. Avant le premier défi, et dans les 24 heures suivant chaque épreuve intranasale, les mêmes animaux ont été anesthésiés, intubés par voie orale et ventilés mécaniquement. Procréation assistée, évaluée en comparant les courbes dose-réponse de la résistance du système respiratoire (RRS) induite par l&#39;augmentation des doses intraveineuses de l&#39;acétylcholine (Ach) de chlorure entre imposture et allergènes animaux contestées, ont été déterminés. Par la suite, et par la même l&#39;intubation, le poumon gauche a été un lavage de sorte que le dénombrement différentiel des cellules des voies respiratoires peut être effectuée. CesDes études révèlent que des mesures répétées de la procréation assistée et la collecte de liquide de LBA sont possibles à partir des mêmes animaux et que l&#39;hyperréactivité bronchique maximale et éosinophilie des voies aériennes sont atteintes dans les 7-10 jours suivant le début du test de provocation. Cette nouvelle technique permet de réduire de façon significative le nombre de souris nécessaires à l&#39;expérimentation longitudinale et est applicable à diverses espèces de rongeurs, des modèles de maladies des voies respiratoires et des instruments de physiologie.

Des mesures répétées de la physiologie respiratoire rongeurs et prélèvement de cellules inflammatoires des voies respiratoires sont souhaitables, mais généralement pas possible. Nous décrivons ici une méthode reproductible pour intubation par voie orale souris qui permet des mesures répétées de l&#39;hyperréactivité des voies aériennes et prélèvement de cellules inflammatoires des voies aériennes.

Une réversible, méthode non-invasive pour les mesures de résistance des voies aériennes et d&#39;échantillonnage du liquide de lavage broncho-alvéolaire chez des souris

Les mesures de l'hyperréactivité bronchique (HRB) et le prélèvement de liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) sont essentiels aux modèles expérimentaux d'asthme, mais des interventions répétées...

Avant de commencer cette procédure, les animaux sont anesthésiés par injection intrapéritonéale de tomate. Les animaux sont ensuite placés sur une table et un cathéter de 20 gauge est inséré par voie orale dans la trachée. Les souris intubées sont placées sous ventilateur mécanique et une voie intraveineuse est établie dans la veine de la queue.Les souris sont ensuite placées dans un SIGGRAPH pour rongeurs fixé à deux transducteurs de pression. L'électronique permet la mesure continue de la résistance du système respiratoire lors d'une épreuve à l'acétylcholine. Après avoir déconnecté le ventilateur et la ligne intraveineuse, le cathéter trachéal est introduit dans le poumon gauche, qui est lavé par une solution saline injectée et retirée par le cathéter.Bonjour, je suis Simone Phar du Département de médecine du Baylor College of Medicine. Aujourd'hui, nous allons vous montrer l'intubation orale de souris afin de pouvoir recueillir à plusieurs reprises les mécaniques respiratoires et le liquide de lavage broncho-alvéolaire. Nous utilisons cette procédure pour étudier les maladies allergiques expérimentales, un modèle expérimental de l'asthme, et cette technique peut également être adaptée à d'autres applications.Commençons. Pour débuter cette procédure, la souris est profondément anesthésiée par une injection intrapéritonéale de 48 milligrammes par kilogramme d'ate. La souris est ensuite placée dans une boîte de type lumière douce afin de la maintenir au calme.Une cage à souris propre recouverte d'un drap en tissu peut être utilisée à cet effet. Après cinq à dix minutes, confirmer par une pincée du orteil que l'animal est complètement anesthésié, puis le placer en position couchée, côté ventral vers le haut, sur une petite table réglée à un angle de 45 degrés. Pour maintenir l'animal en place, insérer un élastique ENC faisant le tour de la table derrière la rangée supérieure de dents.Une lampe chauffante doit être utilisée pour maintenir la souris au chaud avec la main droite. Utilisez une pince pour saisir, étirer et soulever la langue depuis la bouche. Insérez ensuite délicatement un abaisse-langue en métal tenu dans la main gauche.Cela permettra une voie aérienne dégagée et la visualisation des cordes vocales pour l'intubation. Ensuite, insérez un filament optique de 0,8 millimètre de diamètre relié à une source lumineuse à travers le cathéter angio et faites-le dépasser de 10 millimètres au-delà de l'extrémité. Tout en maintenant le depressor avec la main gauche, utilisez la main droite pour guider l'extrémité éclairée du filament optique à travers la cavité buccale et le pharynx jusqu'à la visualisation des cordes vocales.Ensuite, sous visualisation directe et en synchronisant avec le moment où les cordes sont maximales ouvertes, passez le fil à travers les cordes vocales en mouvement et dans la trachée. Faites maintenant passer le cathéter angio sur le fil optique dans la trachée jusqu'à ce que la pointe du cathéter se situe dans la partie médiane de la trachée. Pour une souris de 17 à 22 grammes, cela correspond à un segment de cathéter de 10 millimètres restant à l'extérieur de la bouche.Retirer le fil optique pour confirmer une intubation réussie. Observer des respirations profondes régulières qui cessent immédiatement après l'occlusion du connecteur avec le pouce. Abaisser la table du pléthysmographe jusqu'à ce qu'elle soit parallèle à la paillasse de travail et tourner le sujet de 180 degrés jusqu'à ce qu'il soit face au port du ventilateur d'air.Placer l'animal sur le côté avant de le connecter au ventilateur. Assurer une connexion étanche et activer le ventilateur. Une intubation réussie est confirmée ultérieurement par l'observation d'une excursion abdominale régulière, synchronisée avec le rythme du ventilateur.Pour préparer l'aiguille destinée à la perfusion intraveineuse, retirez une aiguille de 27 gauge et 10 millimètres de son embout pour seringue et pliez-la à 90 degrés en son milieu, de sorte que le biseau soit orienté vers l'intérieur de l'angle. Connectez l'extrémité non biseautée au tube PE 10 menant au port d'injection intraveineuse. Pour éviter une éventuelle embolie gazeuse mortelle.Évacuez le tube et l'aiguille à l'aide de 0,9 % de chlorure de sodium à 37 degrés Celsius à l’aide d’une seringue d’un millilitre. Le port d'injection est constitué d'une aiguille de calibre 27 passant à travers un trou percé dans le bouchon d'un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Le bouchon est rempli de sérum physiologique de sorte que l'extrémité de l'aiguille soit constamment immergée, réduisant ainsi la probabilité qu'un air soit entraîné dans l'aiguille et injecté par voie intraveineuse.Alignez l'aiguille à l'extrémité codale de la queue, parallèlement et au-dessus de la veine latérale. Faites avancer l'aiguille légèrement sous la peau tout en la dirigeant.Avancer crânialement le long de la veine et pousser sous-cutanément jusqu'au coude. Pour confirmer un positionnement intraveineux réussi, tirer légèrement sur le piston de la seringue. Vous devriez observer un reflux sanguin dans le tubage intraveineux.En outre, il doit y avoir un écoulement sans entrave dans la ligne intraveineuse lors de l'injection de 50 à 100 microlitres de solution saline dans la veine de la queue. Après avoir retiré la lampe chauffante du dispositif, enfermez le sujet dans le plasmo graphe et fixez-le de manière étanche à l'air à l’aide de quatre pinces. Le retrait de la lampe chauffante est essentiel pour éviter de chauffer l’air dans la chambre du plasmo graphe et pour empêcher toute modification potentielle des mesures ultérieures de la résistance du système respiratoire, ou RRS. La résistance du système respiratoire, ou RRS, est déterminée par une quantification continue du quotient.Changement de la pression des voies respiratoires par rapport au débit d'air ou delta P sur V aux points de volume pulmonaire égal. Le delta P est déterminé à l'aide d'un transducteur de pression relié au cathéter angio trachéal V. La dérivée du volume du greffon plasmatique par rapport au temps est calculée par le module de préamplification. Après établissement d'une ligne de base stable, RRS injectent cinq doses successives de concentrations croissantes de chlorure d'acétylcholine ou de CH pendant une seconde par voie intraveineuse.Chaque dose suivante est administrée dès le retour de la RRS à la ligne de base, jusqu'à ce qu'une augmentation de 200 % de la résistance des voies respiratoires soit atteinte. Retirer la perfusion de la veine de la queue et déconnecter la souris du ventilateur. En maintenant une voie aérienne perméable en laissant en place la canule trachéale, s'assurer que la souris a repris une respiration spontanée.Sinon, on peut encourager la respiration en massant doucement le thorax. Une fois que la souris a repris une respiration spontanée, transférez-la, avec la canule trachéale en place, dans une chambre purgée d'oxygène à 100 % et maintenue à 37 degrés Celsius à l’aide d’une lampe chauffante. La canule trachéale doit rester en place jusqu’à ce que l’animal soit réveillé afin d’éviter une mort par asphyxie provoquée par une hypersécrétion salivaire induite par l’acétylcholine.Le liquide de lavage broncho-alvéolaire, ou liquide de LBA, ne peut être recueilli que lorsque le réflexe nauséeux de la souris est suffisamment revenu, ce qui devrait se produire environ 20 minutes après son remplacement dans la chambre de récupération. Pour évaluer le réflexe nauséeux, faites doucement glisser le cathéter angio vers l’intérieur et vers l’extérieur : une toux ou des signes de lutte évidents indiquent que le réflexe nauséeux est revenu, permettant ainsi la collecte du liquide de LBA. Un fil-guide métallique d’intubation présentant une courbure continue d’environ 30 degrés orientée vers le lobe gauche du poumon est inséré dans le cathéter angio.Faire avancer ensemble le fil guide et le cathéter angio dans le lobe gauche du poumon de manière à ce que le bourrelet du cathéter dépasse à peine des dents antérieures d’un seul millimètre. Veiller à ce que l’extrémité du fil guide ne dépasse pas par l’extrémité ouverte du cathéter angio. Pour éviter une lacération ou une rupture de la trachée tout en maintenant le cathéter angio en place, injecter immédiatement après, en tirant simultanément sur le piston de la seringue, 300 microlitres de PBS stérile à pH 7,4 dans le poumon gauche à l’aide d’une seringue d’un millilitre.Pour créer une pression négative, retirez lentement le cathéter angio en massant intensément le poumon. Un rendement de lavage broncho-alvéolaire de 100 à 200 microlitres est attendu. Replacez immédiatement la souris lavée dans l'enceinte à 37 degrés Celsius et à 100 % d'oxygène.Placer l'animal sur son côté gauche jusqu'à ce qu'il soit complètement rétabli, environ 20 minutes, puis le remettre dans sa cage. Nous présentons ici des résultats représentatifs de mesures de la résistance des voies respiratoires, de l'hyperactivité bronchique définie comme des valeurs de RRS significativement plus élevées à n'importe quelle dose d'acétylcholine par rapport aux valeurs basales, observées après cinq défis allergéniques à la quatrième dose. Toutefois, une hyperactivité bronchique beaucoup plus marquée a été observée après le sixième défi, sans augmentation supplémentaire de la réactivité.Lors du septième défi, l'administration d'un CH a été arrêtée après que les valeurs de RRS ont triplé par rapport aux valeurs de base, car toute augmentation supplémentaire de la dose entraîne un bronchospasme létal. Les souris soumises à des défis répétés avec le véhicule par voie intranasale ne développent pas d'hyperactivité bronchique, et à toutes les doses de CH administrées, les mesures de RRS ne diffèrent pas significativement des valeurs de base, comme le montrent ces tracés représentatifs en temps réel de RRS obtenus chez une souris naïve et chez une souris soumise à six défis allergéniques recevant des doses intraveineuses consécutives d'un CH avant l'apparition d'une HRa marquée. Le type cellulaire dominant dans les voies respiratoires induit par l'allergène était le neutrophile, similaire à la tendance observée pour la HRa. Toutefois, l'éosinophilie s'est progressivement accentuée avec les défis allergéniques répétés, et l'éosinophile est devenu le type cellulaire prédominant sur le plan numérique dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire, après le sixième défi, coïncidant avec une diminution marquée du nombre de neutrophiles.Dans les souris témoins traitées au PBS, les mesures de résistance des voies respiratoires n'ont également pas varié de manière significative au fil du temps. Un recrutement accru de macrophages et de neutrophiles, mais pas d'éosinophiles, dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire a également été observé chez ces souris, des modifications similaires à celles observées chez les souris soumises uniquement à des prélèvements répétés de liquide de lavage broncho-alvéolaire.Nous venons donc de vous montrer comment intuber réversiblement des souris par voie orale et accéder à la ligne intraveineuse afin de recueillir des données de physiologie respiratoire et du liquide bronchoalvéolaire. Avant d'appliquer ces techniques sur des animaux vivants, il est essentiel de s'entraîner et de perfectionner chaque technique séparément, sur des animaux morts.Une manipulation stricte et délicate est essentielle, et une technique aseptique rigoureuse doit être appliquée en tout temps. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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