Une réversible, méthode non-invasive pour les mesures de résistance des voies aériennes et d'échantillonnage du liquide de lavage broncho-alvéolaire chez des souris

Avant de commencer cette procédure, l’avare anesthésié avec de la tomate injectée par voie intrapéritonéale. Les animaux sont ensuite placés sur une table et un cathéter de calibre 20 est inséré par voie orale dans la trachée. Les souris intubées sont placées sur un ventilateur mécanique et une ligne intraveineuse est amorcée dans la veine de la queue.

Les souris sont ensuite enfermées dans un SIGGRAPH de rongeur attaché à deux transducteurs de pression. L’électronique permet de mesurer en continu la résistance du système respiratoire lors de la provocation à l’acétylcholine. Après avoir débranché le ventilateur et la ligne intraveineuse, le cathéter trachéal est avancé dans le poumon gauche, qui est lavé avec une solution saline injectée et retirée à travers le cathéter.

Bonjour, je suis Simone Phar du département de médecine du Baylor College of Medicine. Aujourd’hui, nous allons vous montrer l’intubation orale de souris de sorte que la mécanique des voies respiratoires et le liquide de lage broncho-vélaire puissent être collectés à plusieurs reprises. Nous utilisons cette procédure pour étudier les maladies allergiques expérimentales, qui sont un modèle expérimental de l’asthme, et cette procédure peut également être adaptée à d’autres applications.

Alors commençons. Pour commencer cette procédure, la souris est profondément anesthésiée par une injection intrapéritonéale de 48 milligrammes par kilogramme d’ate. La souris est ensuite placée dans une boîte de type lumière douce pour la garder calme.

Une cage de souris propre recouverte d’un drap en tissu peut être utilisée à cet effet : après cinq à 10 minutes, confirmez par un pincement des orteils que l’animal est complètement anesthésié, puis placez-le en position couchée. Face ventrale vers le haut sur une petite table ajustée à un angle de 45 degrés. Pour fixer le sujet en place, insérez un élastique ENC autour de la table derrière la rangée supérieure de dents.

Une lampe chauffante doit être utilisée pour garder la souris au chaud avec votre main droite. Utilisez une pince à épiler pour saisir, étendre et soulever la langue de la bouche. Ensuite, insérez doucement un abaisse-langue en métal tenu dans votre main gauche.

Cela permettra d’avoir des voies respiratoires sans entrave et de visualiser les cordes vocales pour l’intubation. Ensuite, insérez un fil de fibre optique de 0,8 millimètre de diamètre connecté à une source lumineuse à travers le cathéter angio et étendez-le de 10 millimètres au-delà de l’extrémité. Tout en étudiant l’abaisseur avec votre main gauche, utilisez votre main droite pour guider l’extrémité éclairée du fil de fibre optique à travers la cavité buccale et le pharynx jusqu’à ce que les cordes vocales soient visualisées.

Ensuite, sous la visualisation directe et au moment où les cordes sont ouvertes au maximum, passez le fil à travers les cordes vocales en mouvement et dans la trachée. Passez maintenant l’angio-cathéter sur le fil de la fibre optique dans la trachée jusqu’à ce que l’extrémité du cathéter se trouve dans la partie médiane de la trachée. Pour une souris de 17 à 22 grammes, cela correspond à un segment de cathéter de 10 millimètres restant à l’extérieur de la bouche.

Retirez le filetage de la fibre optique pour confirmer la réussite de l’intubation. Observez des respirations profondes régulières qui se terminent immédiatement après l’occlusion du connecteur avec le pouce. Abaissez la table pléthysmographe jusqu’à ce qu’elle soit parallèle à l’établi et tournez le sujet de 180 degrés jusqu’à ce qu’il fasse face à l’orifice du ventilateur d’air.

Retournez l’animal sur le côté avant de le connecter au ventilateur. Assurez-vous d’une connexion étanche à l’air et activez le ventilateur. Une intubation réussie est confirmée lorsque l’excursion abdominale raso est observée au rythme du ventilateur plus tard.

Pour préparer l’aiguille pour la ligne intraveineuse, retirez une aiguille de calibre 27 de 10 millimètres de son connecteur de seringue et pliez-la à 90 degrés au point médian de sorte que le biseau soit orienté vers l’angle. Connectez l’extrémité non biseautée au tube PE 10 menant à l’orifice d’injection IV. Pour prévenir l’embolisation gazeuse potentiellement mortelle.

Purgez le tube et l’aiguille avec du chlorure de sodium à 37 degrés Celsius 0,9 % à l’aide de la seringue d’un millilitre. L’orifice d’injection est constitué d’une aiguille de calibre 27 enfoncée dans un trou percé dans le capuchon d’un tube de centrifugation de 15 millilitres. Le capuchon est rempli de solution saline de sorte que l’extrémité de l’aiguille est constamment immergée, réduisant ainsi la probabilité que l’air soit entraîné dans l’aiguille et injecté par voie intraveineuse.

Alignez l’aiguille à l’extrémité codale de la queue. Parallèle à la veine latérale et au-dessus de celle-ci. Passez l’aiguille légèrement sous la peau tout en la dirigeant.

Crânien le long de la longueur des veines et poussant sous-cutanéement jusqu’à la courbure. Pour confirmer la mise en place réussie de l’IV, tirez légèrement sur le piston de la seringue. Vous devriez voir le sang refluer dans la tubulure IV.

De plus, il devrait y avoir un écoulement sans entrave à travers la ligne IV lors de l’injection de 50 à 100 microlitres de solution saline dans la veine de la queue. Après avoir retiré la lampe chauffante de l’installation, enfermez le sujet dans le plasmographique et fixez-le de manière étanche à l’air avec l’application de quatre pinces. Le retrait de la lampe chauffante est important pour éviter de chauffer l’air dans la chambre du plasmographe et de modifier potentiellement les mesures ultérieures de la résistance du système respiratoire ou de la résistance du système respiratoire ou de la résistance du système respiratoire ou de la RRS est déterminée par une quantification continue du quotient.

Changement de la pression des voies respiratoires sur le débit d’air ou delta P sur V aux points de volume pulmonaire égal. Delta P est déterminé à l’aide d’un transducteur de pression connecté à l’angiocathéter trachéal V.Le différentiel de volume de greffe de plasma au fil du temps est calculé par le module de préampli. Après avoir établi une base de référence stable, RRS injecte cinq doses successives de concentrations croissantes de chlorure d’acétylcholine ou d’un CH sur une seconde via l’iv.

Chaque dose subséquente est administrée au retour du RRS à la ligne de base jusqu’à ce qu’une augmentation de 200 % de la résistance des voies respiratoires soit atteinte. Retirez l’IV de la veine de la queue et débranchez la souris du ventilateur. En maintenant la canule trachéale en place, assurez-vous que la souris a repris sa respiration spontanée.

Sinon, la respiration peut être encouragée en massant doucement le thorax. Une fois que la souris a repris sa respiration spontanée, transférez-la avec la canule trachéale en place dans une chambre purgée avec 100 % d’oxygène et maintenue à 37 degrés Celsius avec la lampe chauffante. La canule trachéale doit rester en place jusqu’à ce que l’animal soit éveillé pour éviter la mort liée à l’asphyxie causée par l’hypersalivation induite par l’acétylcholine.

Le lavage broncho-alvéolaire ou liquide BAL ne peut être recueilli que lorsque la souris a suffisamment récupéré son réflexe nauséeux, ce qui devrait se produire environ 20 minutes lors du remplacement dans la chambre de récupération. Pour évaluer le réflexe nauséeux, faites glisser doucement le cathéter angio vers l’intérieur et vers l’extérieur, une toux ou une lutte évidente indique que le réflexe nauséeux est revenu pour recueillir le liquide BAL. Un fil-guide d’intubation métallique avec une courbure continue d’environ 30 degrés dirigé vers le lobe gauche du poumon est inséré dans l’angiocathéter.

Faites avancer le fil G et le cathéter angio ensemble dans le lobe gauche du poumon de sorte que le moyeu du cathéter exclu ne dépasse les dents de devant que d’un millimètre. Assurez-vous que l’extrémité du fil G ne passe pas à travers l’extrémité ouverte du cathéter angio. Pour éviter une lacération ou une rupture trachéale tout en maintenant l’angiocathéter en place, rincez 300 microlitres de PBS stérile pH 7,4 dans le poumon gauche à l’aide d’une seringue d’un millilitre immédiatement après tout en aspirant le piston de la seringue.

Pour créer une pression négative, retirez lentement l’angiocathéter tout en massant intensément le poumon. Un retour de BAL de 100 à 200 microlitres est attendu. Remettez immédiatement la souris de lavage dans la chambre à 37 degrés Celsius, 100 % d’oxygène.

Placez l’animal sur son côté gauche jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli, environ 20 minutes, puis remettez-le dans sa cage. Nous présentons ici des résultats représentatifs de mesures de résistance des voies respiratoires, l’hyperréactivité des voies respiratoires définie comme des valeurs RRS significativement plus élevées à n’importe quelle dose d’acétylcholine par rapport aux valeurs naïves développées après cinq provocations allergènes à la quatrième dose. Cependant, une hyperréactivité des voies respiratoires beaucoup plus importante a été observée après le sixième défi, sans augmentation supplémentaire de la réactivité.

Lors de la septième provocation, une dose de CH a été arrêtée après que les valeurs RRS aient triplé par rapport aux valeurs de base, d’autres augmentations de la dose entraînant autrement un bronchospasme mortel. Les souris ont été testées à plusieurs reprises avec un véhicule par voie intranasale pour ne pas développer d’hyperréactivité des voies respiratoires et, à toutes les doses d’une HC, les mesures de RRS données ne varient pas significativement des valeurs de base, comme le montrent ces tracés RRS représentatifs en temps réel d’une souris naïve et six fois plus allergique recevant des doses IV consécutives d’une CH avant l’émergence d’une HR A robuste. La bande cellulaire dominante des voies respiratoires induite par l’allergène était le neutrophile, similaire à la tendance d’une HR. Cependant, l’éosinophilie s’est progressivement renforcée avec une provocation allergène répétée et l’éosinophile est devenu le type cellulaire numériquement dominant dans le liquide BAL. Après le sixième défi, il a coïncidé avec une baisse marquée du nombre de neutrophiles.

Dans le contrôle PBS a défié les souris. Les mesures de résistance des voies respiratoires n’ont pas non plus varié de manière significative au fil du temps. Une augmentation du recrutement des macrophages dans les neutrophiles, mais pas du recrutement d’éosinophiles dans le liquide BAL, a également été observée chez ces souris, similaire à ces changements observés chez les souris recevant uniquement des échantillons répétés de liquide BAL.

Nous venons donc de vous montrer comment intuber de manière réversible des souris par voie orale et accéder à la ligne intraveineuse pour collecter des données physiologiques sur les voies respiratoires et le gros liquide broncho-alvéolaire. Avant d’effectuer ces techniques sur des animaux vivants, il est essentiel de pratiquer et de perfectionner chaque technique séparément. Sur les animaux cric.

Une manipulation stricte et douce est essentielle et une technique d’asepsie stricte doit être effectuée à tout moment. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.