Name: Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: Apprenez à isoler des neutrophiles du sang humain et à les stimuler pour former des pièges extracellulaires (NETs). Cette méthode utilise la microscopie à fluorescence et électronique pour visualiser ces structures immunitaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Isolement PMN du sang humain Utilisez environ 24 ml de sang humain avec de l&#39;EDTA ou héparine (10 U / ml) comme anticoagulant. <ol><li> Ajouter 6 ml 1119 Histopaque à un tube Falcon de 15 ml et soigneusement ml de sang couche de 5 à 7 entières sur le dessus. </li><li> Centrifuger pendant 20 minutes à 800 xg sans freinage. </li><li> Aspirer et jeter jaunâtres et clairs couche supérieure et le transfert phase inférieure rougeâtre contenant des granulocytes dans des tubes Falcon frais. </li><li> Laver les cellules en remplissant des tubes Falcon avec du PBS et centrifuger pendant 10 minutes à 300 x g. </li><li> En attendant de préparer une solution de Percoll à 100% en mélangeant 18 ml de Percoll avec 2 ml de PBS 10x. Avec 1x PBS préparer 4 solutions ml de 85%, 80%, 75%, 70% et 65% de Percoll. </li><li> Préparer deux tubes Falcon avec un gradient de Percoll par superposition de 2 ml de chaque point de pourcentage au-dessus de l&#39;autre dans l&#39;ordre décroissant. </li><li> Après centrifugation éliminer le surnageant, mélanger et remettre granulés cellules sédimentées dans 4 ml de PBS. </li><li> Soigneusement couche 2 ml de la remise en suspension sur chacun des gradients. </li><li> Centrifuger pendant 20 minutes à 800 xg sans freinage. </li><li> Après centrifugation retirer la couche supérieure et la plupart des 65% de la couche avec des PBMC et de recueillir des blancs interphases restant jusqu&#39;à 85% de la couche dans des tubes Falcon de nouvelles. </li><li> Laver les cellules en remplissant des tubes Falcon avec du PBS et centrifuger pendant 10 minutes à 300 x g. </li><li> Retirer le surnageant et remettre les cellules sédimentées (généralement&gt; 95% sont PMN) dans 2ml de PBS. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hématimètre. </li></ol> 2. Activation PMN <ol><li> Préparer une plaque de 24 puits de culture cellulaire en mettant une solution stérile de 13 mm de glissement rondes couvercle en verre (# 1,5) dans chaque puits </li><li> Graine 2 x 10 5 cellules dans 500μl RPMI (contenant 2% de sérum albumine humaine) par puits et incuber pendant 1h de CO 2 étuve à 37 ° C. </li><li> Pendant ce temps préparer une solution de 600 nM PMA dans RPMI et ajouter aux cellules 100 ul par puits. Incuber de 15 min à 4 h de CO 2 étuve à 37 ° C. </li><li> Fixer les cellules de 4% (concentration finale) paraformaldéhyde dissous dans du PBS. </li></ol> PMA sert de contrôle positif et est jusqu&#39;à présent l&#39;agent le plus puissant pour induire la formation de NET. Alternativement, d&#39;autres stimuli ou de co-culture avec des agents pathogènes peut être utilisé pour l&#39;induction NET. Le statut respectif de la formation des NET peut être vérifiée tout au cours du temps se déroule, si d&#39;autres échantillons sont préparés en parallèle. Si un colorant d&#39;ADN non-pénétrants, comme Sytox vert (Invitrogen) est ajouté aux cellules non-fixes, seul l&#39;ADN extracellulaire sera détectée. Depuis la formation de nouveaux filets est en quelque sorte altérée en présence d&#39;Sytox, pour chaque point dans le temps un échantillon parallèle doit être utilisé. 3. NET de détection par immunomarquage NET sont très fragiles, même après fixation et doivent être manipulés avec grand soin, sinon la majorité seront perdus lors de la préparation. <ol><li> Retirez délicatement lamelles de verre avec des cellules de la plaque attachée culture de 24 puits en le soulevant au bord d&#39;une aiguille courbe et la saisir avec une pince fine. Mettez la lamelle à l&#39;envers sur une goutte de PBS. Cela peut être fait sur une feuille de Parafilm couvrant un stand tube à essai. Laver comme celui-ci 3 fois pendant 5 min. </li><li> Incuber lamelles de la même manière à une baisse de 0,5% de Triton X-100 pendant 1 min à température ambiante à perméabiliser les cellules. Laver 3 fois en PBS pendant 1 min. </li><li> Préparer une chambre humide avec du parafilm et un tissu humide. Posez le couvercle glisse à l&#39;envers sur une goutte de tampon de blocage (5% âne sérum) et incuber pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Diluer anticorps primaires, par exemple la lutte contre Histon ms et RB anti-élastase neutrophile, en tampon de blocage. </li><li> Transfert couvercle glisse dans la chambre humide directement à partir du tampon de blocage sur une goutte d&#39;anticorps primaire et incuber pendant 1 h à 37 ° C. </li><li> Lavez 3 fois pendant 5 min avec du PBS. </li><li> Diluer anticorps secondaire, par exemple la lutte contre dk ms Cy2 et dk anti-rb Cy3, en tampon de blocage. </li><li> Transfert couvercle se glisse dans la chambre humide sur une goutte d&#39;anticorps secondaire et incuber pendant 1 h à 37 ° C. </li><li> Lavez 3 fois pendant 5 min avec du PBS. Selon vos options de microscopie par fluorescence, l&#39;ADN tache pendant 5 min, soit avec Hoechst 33342 (1 pg / ml), qui aura besoin d&#39;excitation UV ou Draq5 pour l&#39;excitation bien rouges et laver deux fois avec dist. de l&#39;eau. </li><li> Régler une baisse de Mowiol 20 pi sur une lame de verre et de monter des lamelles avec des cellules à l&#39;envers. Les cellules doivent être entre la lamelle et la lame. La baisse de Mowiol va former une couche mince d&#39;épaisseur homogène lorsque la lamelle est placée sur la goutte. Normalement, il n&#39;ya pas besoin d&#39;appuyer sur l&#39;échantillon. Si vous voulez utiliser des lentilles non-immersion, l&#39;échantillon est prêt pour l&#39;inspection.Pour l&#39;analyse microscopique avec des lentilles à immersion, laissez sécher le spécimen pendant environ 1 heure jusqu&#39;à ce que le Mowiol a solidifié au bord de l&#39;échantillon. </li></ol> 4. NET Préparation pour microscopie électronique à balayage (MEB) <ol><li> Message fixer les cellules sur les lamelles de verre de 24 puits plaque avec du glutaraldéhyde à 2,5%. </li><li> Retirer des lamelles de verre contenant des cellules de la plaque de culture à 24 puits et de mettre à l&#39;envers sur une goutte d&#39;eau. Laver comme celui-ci 3 fois pendant 5 min. </li><li> Transfert des lamelles de nouveau dans 24 puits, la plaque de culture cellulaire contenant 0,5% OsO4 et incuber pendant 30 min. </li><li> Retirer des lamelles de verre contenant des cellules de la plaque de culture à 24 puits et de mettre à l&#39;envers sur une goutte d&#39;eau. Laver comme celui-ci 3 fois pendant 5 min. </li><li> Transfert des lamelles de nouveau dans 24 puits, la plaque de culture cellulaire contenant 1% d&#39;acide tannique et incuber pendant 30 min. </li><li> Répétez les étapes 04/02 au 04/04 </li><li> Déshydrater à travers le schéma suivant (5min chacun): <ul><li> 30% d&#39;éthanol </li><li> 50% d&#39;éthanol </li><li> 70% d&#39;éthanol </li><li> 80% d&#39;éthanol </li><li> Éthanol à 90% </li><li> 100% d&#39;éthanol </li><li> 100% d&#39;éthanol </li><li> 100% d&#39;éthanol </li></ul></li><li> Transfert couvercle glisse dans sécheuse point critique et des échantillons secs. </li><li> Manteau de la surface de spécimen avec 5nm platine / carbone calque à l&#39;aide évaporateur à couche mince </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: La méthode d&#39;isolement donne habituellement non stimulées neutrophiles viable avec une pureté supérieure à 95%. Lorsque fixé à différents moments après la stimulation, le protocole immunomarquage montre la séquence des changements morphologiques des cellules au cours NETosis aplatissement, une perte de lobules nucléaire, perte de granules et de l&#39;intégrité noyau qui aboutit à un chevauchement croissant de l&#39;énergie nucléaire (c&#39;est à dire des histones) et granulaires (ie élastase neutrophile) coloration. Ce protocole peut servir de point de départ pour analyser les interactions spécifiques des pathogènes avec des neutrophiles. Cette interaction peut être disséqué de façon plus détaillée en utilisant le protocole de préparation pour la microscopie électronique à balayage. NET fluorescence Exemple de neutrophiles stimulés colorées pour NET (bleu = ADN, rouge = histones, vert = élastase neutrophile). Les images montrent, outre la localisation NET, la localisation nucléaire de l&#39;ADN et les histones et le modèle granulaire pour l&#39;élastase neutrophile. SEM PMA de stimulation Micrographie électronique à balayage montrant non neutrophiles stimulés et stimulés par PMA. Après stimulation, les neutrophiles s&#39;aplatissent et produire NET. NET SEM et Shigella Une résolution plus élevée SEM image de bactéries Shigella piégés dans les filets.

<ol><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.</li>
<li>Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+capture+and+kill+Candida+albicans+yeast+and+hyphal+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms.</a> Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).</li>
<li>M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+amazonensis+promastigotes+induce+and+are+killed+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps.</a> PNAS. 106, 6748-6753 (2009).</li>
<li>Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+expression+allows+the+pathogen+group+A+Streptococcus+to+escape+killing+in+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps.</a> Curr Biol. 14, 396-400 (2006).</li>
<li>Fuchs, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).</li>
<li>Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+spontaneous+apoptosis+of+neutrophil+granulocytes+by+the+intracellular+parasite+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major.</a> J Immunol. , 169-898 (2002).</li>
</ol>

Le protocole doit permettre à l&#39;isolement des non neutrophiles stimulés à la pureté considérable, l&#39;induction de la formation nette et l&#39;analyse des changements morphologiques au cours NETosis. Lors de la manipulation des échantillons avec soin, c&#39;est à dire en évitant les difficiles conditions de lavage qui se traduira par la perte de la plupart des filets lâchement, le montant de la formation des NET dans des conditions de stimulation différentes (durée, relance) peuvent être comparés. À cet égard, les protocoles prévus peut servir comme point de départ pour établir des méthodes pour analyser les scénarios plus sophistiqués: l&#39;interaction des neutrophiles / pathogène, la séquence de stimuli, interaction avec d&#39;autres cellules immunitaires.

neutrophiles pièges extracellulaires: comment générer et de les visualiser

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Granulocytes neutrophiles sont le groupe le plus abondant de leucocytes dans le sang périphérique. Comme phagocytes professionnels, ils engloutissent les bactéries et les tuer quand leur niveau intracellulaire fusible antimicrobien granulés avec le phagosome. Nous avons constaté que les neutrophiles ont un moyen supplémentaire de tuer les microorganismes: lors de l&#39;activation, ils libèrent des protéines de granules et de la chromatine qui forment ensemble les fibres extracellulaires qui lient les agents pathogènes. Ces nouvelles structures, ou des neutrophiles pièges extracellulaires (EVF), dégradent les facteurs de virulence et de tuer les bactéries 1, 2 champignons et des parasites 3. L&#39;épine dorsale de structure des EVF est de l&#39;ADN, et ils sont rapidement dégradés en présence des DNases. Ainsi, les bactéries exprimant DNases sont plus virulents 4. En utilisant la microscopie corrélative alliant MET, MEB, immunofluorescence et de vivre des techniques d&#39;imagerie cellulaire, nous avons pu montrer que lors de la stimulation, les noyaux des neutrophiles perdent leur forme et de l&#39;UE et l&#39;hétérochromatine homogénéiser. Plus tard, l&#39;enveloppe nucléaire et les membranes des granules se désintègrent en permettant le mélange des composants NET. Enfin, les filets sont libérés que les pauses membrane cellulaire. Ce programme de mort cellulaire (NETosis) est distinct de l&#39;apoptose et nécrose et dépend de la génération d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène par la NADPH oxydase 5. Neutrophiles pièges extracellulaires sont abondants dans les sites d&#39;inflammation aiguë. NET semble être une forme de la réponse immunitaire innée que les microorganismes se lier, de les empêcher de se répandre, et assurer une forte concentration locale d&#39;agents antimicrobiens à dégrader les facteurs de virulence et de tuer les agents pathogènes permettant ainsi neutrophiles de remplir leur fonction antimicrobienne même au-delà de leur durée de vie. Il ya plus de preuves, cependant, que les filets sont également impliqués dans les maladies qui vont de syndromes auto-immuns à l&#39;infertilité 6. Nous décrivons des méthodes pour isoler granulocytes neutrophiles du sang périphérique humain 7 et les inciter à former des développements. Aussi nous inclure des protocoles de visualiser les filets dans la microscopie optique et électronique.

Neutrophiles pièges extracellulaires (NET) sont un important mécanisme immunitaire inné pour combattre les bactéries pathogènes, champignons et parasites. Nous décrivons ici les méthodes d&#39;isoler granulocytes neutrophiles dans le sang humain et de les activer pour former NET. Nous présentons les techniques de préparation de visualiser NET en microscopie optique et électronique.

Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser

Les granulocytes neutrophiles constituent le groupe de leucocytes le plus abondant dans le sang périphérique. En tant que phagocytes professionnels, ils engulfent les bactéries et les éliminent...

Les pièges extracellulaires des neutrophiles, ou NET, constituent un mécanisme récemment identifié de destruction des agents pathogènes par les neutrophiles, qui libèrent une combinaison de protéines cytoplasmiques et granulaires, ainsi que de la chromatine, formant des fibres extracellulaires capables de piéger les agents pathogènes. Dans cette vidéo, les granulocytes sont isolés à partir de sang total humain par centrifugation en gradient de densité histopaque. Les neutrophiles sont ensuite isolés à partir de la préparation de granulocytes par gradient Percoll.Après centrifugation, les cellules sont ensemencées sur des lamelles et stimulées pour former des réseaux à l’aide de stimuli chimiques ou biologiques, puis traitées pour une immunomarquage ou une microscopie électronique afin de visualiser les réseaux. Bonjour, je suis Christian Gosman, du centre de microscopie de l’Institut Max Plunk pour la biologie des infections. Aujourd’hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de purifier les granulocytes neutrophiles à partir de sang humain et de les stimuler à produire des pièges extracellulaires neutrophiles, ou réseaux.Nous visualiserons ensuite les réseaux par immunofluorescence et microscopie électronique à balayage. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les mécanismes menant à la formation des réseaux et pour analyser leurs propriétés antimicrobiennes. Commençons donc.Commencer ce protocole dans une hotte à flux laminaire en préparant six millilitres d'histo 1119 dans chacun des quatre tubes Falcon de 15 millilitres. Déposer soigneusement cinq à sept millilitres de sang total sur l'histo dans chaque tube. Centrifuger les tubes pendant 20 minutes à environ 800 ×g, en s'assurant que le frein est désactivé une fois la centrifugation terminée. Retirer délicatement les tubes de la centrifugeuse.Le tube contiendra quatre couches bien distinctes, de haut en bas : une couche rouge foncé contenant les érythrocytes, une couche rouge clair contenant les granulocytes neutrophiles ainsi que quelques érythrocytes, une couche jaunâtre blancâtre contenant les leucocytes et le sérum, et une couche jaune claire de sérum.À nouveau, travaillez dans l'enceinte de flux laminaire. Utilisez le périphérique relié à un système sous vide pour aspirer soigneusement la couche supérieure jaune. Ensuite, à l’aide d’une pipette, transférez la phase rougeâtre contenant les granulocytes de chaque tube dans un nouveau tube Falcon.Ensuite, remplissez les tubes avec du PBS pour laver les granulocytes. Ensuite, faites-les précipiter par centrifugation pendant 10 minutes à environ 300 ×g pendant que les cellules tournent. Préparez une solution per coll à 100 % en mélangeant 18 millilitres de per co avec 2 millilitres de PBS 10 fois concentré.Ensuite, utilisez la solution per coll à 100 % et du PBS une fois pour préparer quatre millilitres de chacune des concentrations suivantes : 65, 70, 75, 80 et 85 % per coll. Utilisez ces solutions pour préparer des gradients per coll en superposant soigneusement deux millilitres de chaque solution dans chacun de deux tubes. Commencez par verser deux millilitres de la solution à 85 % dans chaque tube.Ensuite, déposer délicatement sur le dessus de la solution à 85 % per coll deux millilitres de la solution à 80 % per co. Continuer à superposer deux millilitres de chaque solution par ordre décroissant, de sorte que la solution à 65 % soit déposée en dernier sur le dessus. Retirer les leucocytes sédimentés du centrifugeuse sous la hotte.Jetez le surnageant et resuspendez les cellules dans un millilitre de PBS. Ensuite, rassemblez les cellules resuspendues dans un tube neuf. Superposez soigneusement deux millilitres des granulocytes resuspendus sur chacun des gradients de Pérol.Ensuite, centrifuger pendant 20 minutes à environ 800 ×g, en veillant à désactiver le frein après la centrifugation. Les interfaces doivent être clairement visibles en raison de la densité cellulaire la plus élevée. Jeter la couche supérieure et la majeure partie de la couche à 65 %, qui contiennent les cellules mononucléées du sang périphérique ou les pBMC.Recueillir l'interface 65 %–70 % ainsi que les interfaces 70 %–75 % et 80 %–85 % provenant de chaque gradient et les transférer dans de nouveaux tubes Falcon. Laver les cellules en remplissant le tube avec du PBS et centrifuger pendant 10 minutes à environ 300 × g pour former un culot cellulaire après la centrifugation. Éliminer le surnageant et resuspendre les leucocytes polymorphonucléés ou PMN culotés dans deux millilitres de PBS.À ce stade, 95 % ou plus des cellules présentes dans la préparation seront des mns. À l’aide d’un hémocytomètre, déterminez les concentrations cellulaires, puis déposez 200 000 cellules dans 500 microlitres de RPMI sur des lamelles rondes stériles placées dans des puits de plaques de culture de 15 millimètres de diamètre. Incubez pendant une heure dans une étuve à 5 % de CO2 à 37 degrés Celsius afin de permettre l’attachement des cellules aux lamelles après une heure.Ajoutez 100 microlitres de RPMI contenant le stimulant souhaité. Pour une expérience cinétique, ajoutez le stimulant de manière séquentielle, en commençant par le temps de stimulation le plus long pour chaque point temporel conditionnel. Préparez un contrôle positif en ajoutant 600 nano molaires de PMA dans le RPMI.Également, pour chaque condition ou point de temps, préparez un témoin négatif en ajoutant uniquement le RPMI, incubez jusqu'à quatre heures dans un incubateur à CO2 à 37 degrés Celsius. Pendant la stimulation, la formation des NETs peut être surveillée par microscopie en champ clair. Peu après la stimulation, les noyaux modifient considérablement leur forme. Ils perdent leur rondeur, se condensent, puis s'étendent au point de temps souhaité ; ajoutez 600 microlitres de solution de paraformaldéhyde à 8 % à température ambiante dans chaque puits.Pour amener la concentration finale à 4 %, incuber pendant deux à quatre heures pour le marquage immunologique. Placer une feuille de paraforme sur un support de tubes à essai comportant trois fois huit orifices d'environ 15 millimètres de diamètre. Pour former des puits, remplir les puits avec du PBS.Utilisez une aiguille courbe pour soulever délicatement chacun des lamelles à partir du paraldéhyde sur la plaque de culture. Ensuite, à l’aide de pinces, saisissez le lamelle et retournez-le sur la surface d’une goutte de PBS sur le paraform. À ce stade, les pièges extracellulaires des neutrophiles sont très fragiles et il convient de manipuler avec le plus grand soin afin d’éviter toute perte cellulaire.Après cinq minutes, répétez le lavage en transférant les lamelles vers de nouvelles gouttes de PBS. Répétez l'opération pour un total de trois lavages. Ensuite, transférez les lamelles dans une goutte de Triton X-100 0,5 % à température ambiante pendant une minute afin de rendre les cellules perméables.Ensuite, rincer trois fois dans le PBS pendant une minute chacun après le rinçage. Poursuivre avec la coloration selon le protocole écrit joint. Effectuer chacune des étapes d'incubation et de rinçage en inversant la lame sur le paraform.Une fois les cellules colorées, déposez une goutte de 20 microlitres de MO sur une lame en verre et fixez les lamelles par leur face avant vers le bas, en plaçant les cellules entre la lamelle et la lame. Après une heure, le MOY doit être solidifié et les cellules sont prêtes pour l'analyse microscopique. À l’aide d’objectifs à immersion, préparez les cellules pour une microscopie électronique à balayage sous une hotte chimique.Post-fixez les cellules sur les lamelles de verre dans une plaque de 24 puits avec du glutaraldéhyde à 2,5 % dans le PBS pendant 30 minutes. Pendant l'incubation, placez une feuille de paraforme sur un tube à essai. Placez-la debout avec trois rangées de huit trous d'un diamètre d'environ 15 millimètres.Pour former des puits. Remplir les puits avec de l'eau distillée. Utiliser une aiguille courbe pour soulever chacun des lamelles de la solution de glutaraldehyde.Ensuite, à l’aide de pinces, saisissez la lame couvre-objet et transférez-la dans une goutte d’eau distillée sur le Paraform en plaçant les lames couvre-objets dans des gouttes d’eau distillée sur le Paraform. Répétez cette opération pour un total de trois lavages de cinq minutes chacun, puis replacez les lames couvre-objets dans les puits de la plaque de culture cellulaire contenant du tétraoxyde d’osmium à 0,5 % dans l’eau distillée et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Retirez les lames couvre-objets de la plaque et lavez-les trois fois dans l’eau distillée comme précédemment.Les replacer ensuite dans la plaque 24 puits contenant 0,5 millilitre de 1 % d'acide tannique par puits et incuber pendant 30 minutes. Ensuite, laver les lamelles trois fois, cinq minutes à chaque fois. Répéter ensuite la fixation avec l'osmétrioxyde et le lavage.Ensuite, couvrez le tube à essai. Placez-le sur un nouveau morceau de paraforme. Déshydratez les cellules par une série d'incubations dans les solutions d'éthanol suivantes, cinq minutes chacune : 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %.Et enfin, une fois de plus dans de l’éthanol à 100 %. Plongez le porte-lame dans un bain d’échantillons rempli d’éthanol. Placez rapidement les lamelles dans le porte-lame en métal, en veillant à ce que les échantillons ne s’assèchent pas.Ensuite, transférez le bateau contenant l'échantillon dans un séchoir par point critique refroidi, ou CPD. Remplissez la chambre du CPD avec du CO2 liquide. Laissez la vanne d'entrée complètement ouverte afin de maintenir le niveau de liquide, et dès qu'une phase d'éthanol devient visible sous la phase de CO2 au fond de la chambre, ouvrez la vanne de vidange située en bas.Pour éliminer la majeure partie de l'éthanol. Laisser le compartiment se purger pendant environ 30 minutes. Après la purge, fermer la vanne d'entrée et abaisser le niveau du liquide juste en dessous du sommet du creuset.Faites circuler de l'eau chaude à travers la veste du CPD. Lorsque la température atteint entre 36 et 38 degrés Celsius et que la pression augmente jusqu'à 1 200 livres par pouce carré, la ligne de séparation entre le liquide et le gaz disparaîtra et les échantillons seront au-dessus du point critique. Une fois le point critique atteint, relâchez lentement le gaz sur une période de cinq minutes.Pour éviter la condensation, la température doit rester d'environ 40 degrés Celsius. Pendant ce temps, ouvrez la porte et retirez le bateau. Vérifiez que le solvant déshydratant s'est évaporé.Placer les lamelles côté droit vers le haut sur l'adhésif du porte-échantillon en aluminium et les transférer dans le système de revêtement haute résolution. Évacuer le cylindre de revêtement jusqu'à deux fois dix puissance moins cinq millibars. Régler ensuite l'appareil à 1,8 kilovolt et 70 milliampères, et surveiller l'épaisseur de la couche de carbone platine à l'aide d'un cristal de quartz jusqu'à ce que la couche atteigne cinq nanomètres.Relâchez la pression du cylindre de revêtement du système de revêtement haute résolution. Ensuite, à l'aide de pinces, retirez les échantillons du coteur. Ramenez la chambre du MEB à la pression atmosphérique.Ouvrez la porte. Ensuite, insérez les échantillons dans le porte-échantillon et faites le vide dans la chambre. Pour l'analyse MEB.Lorsqu'elles sont fixées à différents moments après la stimulation, les modifications morphologiques durant la NETose peuvent être observées par microscopie à immunofluorescence. Sur cette figure, l'ADN est représenté en bleu par le complexe histone-ADN. Le complexe ADN est montré en rouge et l'élastase des polynucléaires neutrophiles.Un marqueur de granules est montré en vert pendant la première phase de la NETose, uniquement au niveau de la périphérie nucléaire dans les noyaux condensés. Plus tard, lorsque la chromatine est davantage décondensée, la majeure partie du noyau est colorée dans les réseaux décondensés. La coloration est homogène.Ce jeu d'images illustre le recouvrement des colorations nucléaire et granulaire qui se produit lors de la NETose. Cette micrographie électronique à balayage montre des neutrophiles non stimulés après stimulation par la bactérie Ella ; les neutrophiles s'aplatissent et produisent des pièges extracellulaires de neutrophiles. Ici, une bactérie du genre Gel a été piégée dans ces filets.Les bactéries, comme les gels, sont immobilisées et tuées par les enzymes présentes dans les réseaux. Nous venons de vous montrer comment isoler les granulocytes neutrophiles à partir de sang humain et comment les stimuler afin d'induire la formation de pièges extracellulaires neutrophiles. Ces derniers peuvent ensuite être analysés plus en détail par immunofluorescence ou microscopie électronique à balayage.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les réseaux sont très fragiles, même après fixation. Afin de minimiser la perte de réseaux, nous prélevons les lamelles contenant les neutrophiles stimulés à partir des puits et effectuons la majeure partie de la procédure à la surface de gouttes de tampon. Même ainsi, il est essentiel de manipuler les échantillons délicatement et lentement.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

neutrophil-extracellular-traps-how-to-generate-and-visualize-them

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo montre la coloration fluorescente des pièges extracellulaires des neutrophiles, les composants extracellulaires de l’ADN expulsés par les neutrophiles. Cette technique permet de visualiser l’interaction adhésive entre les cellules cancéreuses et les TNE.

Microscopie à fluorescence des pièges extracellulaires neutrophiles ou TNE : une technique pour observer l’interaction adhésive entre les cellules cancéreuses et les TNE

Cette vidéo présente une technique in vitro pour générer et isoler des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE). Les neutrophiles sont isolés du sang périphérique et stimulés avec de l’acétate de myristate de phorbol (PMA) pour produire des TNE. Au cours de l’incubation, les neutrophiles subissent un processus de mort cellulaire (NETosis) pour libérer des TNE composées de chromatine décondensée mélangée à des protéines cytoplasmiques granulaires.

Une technique in vitro pour générer des pièges extracellulaires de neutrophiles humains

Cette vidéo montre l’induction et la visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles ou TNE dans des neutrophiles pré-marqués à l’aide de sérum de patient contenant des anticorps cytoplasmiques anti-neutrophiles. De plus, l’utilisation d’un colorant d’ADN imperméable et la microscopie à fluorescence permettent de visualiser les TNE.

Induction et visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans des neutrophiles pré-marqués

Macrophage pièges extracellulaires sont une entité nouvellement décrite. Cet article se concentre sur les méthodes de microscopie confocale et comment elles sont visualisées in vitro et in vivo des échantillons pulmonaires.

Visualisation des pièges extracellulaires de Macrophage à l’aide de la microscopie confocale

Nous présentons ici une méthode dans laquelle neutrophiles humains de faible densités (LDN), récupérés du liquide de lavage péritonéal postopératoire, produisent massives pièges extracellulaires neutrophiles (filets) et efficacement emprisonnent quelques cellules tumorales gratuit qui poussent par la suite.

Neutrophiles pièges extracellulaires générées par les neutrophiles faible densité obtient du liquide de Lavage péritonéal médiat attachement et la croissance des cellules tumorales

Ici, nous présentons un protocole pour générer des pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et l'exploitation de NETQUANT, une option logicielle entièrement automatique pour la quantification des NET dans les images d'immunofluorescence.

Quantification automatisée basée sur l'image des pièges extracellulaires neutrophiles à l'aide de NETQUANT

Ce protocole décrit un dosage très sensible et très haut débit de neutrophiles piège extracellulaire (NET) pour la quantification semi-automatisé des ex vivo NET formation par microscopie confocale tridimensionnelle par immunofluorescence. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer la formation nette et dégradation après différents stimuli et peut être utilisé pour l’étude des thérapies potentielles axés sur le NET.

Un test haut débit pour évaluer et quantifier les neutrophiles piège extracellulaire Formation

Les pièges extracellulaires de Neutrophile (NET) sont des structures tridimensionnelles produites par les granulocytes neutrophiles stimulés. Il est devenu clair ces dernières années que les ENe sont impliqués dans une grande variété de maladies. La détection des EAE dans les tissus peut avoir une pertinence diagnostique, de sorte que des protocoles normalisés pour l'étiquetage des composants NET sont nécessaires.

Immunofluorescence Étiquetage des pièges extracellulaires de l'homme et de la murine Neutrophil dans les tissus paraffins

Un protocole pour l’induction et l’analyse de pièges extracellulaires (TNE) in vitro est présenté. La quantification de l’ADN, de la cathélicidine (LL37) et de l’activité enzymatique a fourni des données qui montrent la variabilité de la composition et de la morphologie des TNE induites par des stimuli microbiens et chimiques dans des conditions contrôlées similaires.

Analyse morphologique et compositionnelle des pièges extracellulaires neutrophiles induits par des stimuli microbiens et chimiques

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont associés à diverses maladies, et l’immunofluorescence est souvent utilisée pour leur visualisation. Cependant, il existe différents protocoles de coloration et, dans de nombreux cas, un seul type de tissu est examiné. Ici, nous établissons un protocole d’application générale pour la coloration des TNE dans les tissus de souris et d’humains.

Imagerie par immunofluorescence des pièges extracellulaires des neutrophiles dans les tissus humains et murins

Nous présentons une méthode automatisée à haut débit pour quantifier les pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles en utilisant le système d’analyse de cellules vivantes, couplée à une approche à double colorant dépendant de la perméabilité membranaire.

Technique à haut débit en temps réel pour quantifier la formation de pièges extracellulaires à neutrophiles dans les neutrophiles humains

Apprenez à isoler des neutrophiles du sang humain et à les stimuler pour former des pièges extracellulaires (NETs). Cette méthode utilise la microscopie à fluorescence et électronique pour visualiser ces structures immunitaires.

Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser

Explorer plus de vidéos