Enregistrements Sensillum simple chez les insectes Drosophila melanogaster Et Anopheles gambiae

Cette vidéo montre comment effectuer des enregistrements syn uniques chez la drosophile, le melanogaster et un gambier terriblement gambier, des odeurs préparées sont pipetées sur des bandes de papier et insérées dans des pipettes de pâturage. Des insectes vivants sont montés pour immobiliser les organes olfactifs. L’insecte est placé sous un microscope et une électrode de référence est insérée dans l’œil de l’insecte.

L’électrode d’enregistrement est ensuite insérée dans un centum olfactif. Une odeur est soufflée de la pipette au centum et l’activité neuronale est enregistrée. Bonjour, je m’appelle Leslie Vasal du laboratoire Sal de l’Université Rockefeller, et je m’appelle Mariza Pellegrino, également du laboratoire Vasal.

Et je suis de la, Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour enregistrer à partir des neurones sensoriels olfactifs de la mouche du vinaigre de l’œsophage melanogaster, et du moustique du paludisme et nais gambi. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le fonctionnement du capteur d’odeur chez les insectes et comment les neurones réagissent aux produits chimiques volatils. Alors commençons.

Commencez cette procédure en affûtant les électrodes à utiliser pour les enregistrements. À l’aide d’une perceuse, faites un petit trou d’environ deux millimètres de diamètre sur la paroi d’une seringue de 20 litres, à un centimètre de la pointe. Remplissez la seringue d’hydroxyde de potassium filtré à 0,5 molaire et fixez-la horizontalement sur un support sous un microscope à dissection avec la pointe dans le champ de vision, enfoncez un fil électrique dans le trou de la seringue, en vous assurant qu’il ne bloque pas l’extrémité de la seringue et connectez-la à l’anode d’une alimentation électrique.

Sur le côté droit du microscope, fixez un arbre porte-électrode à un micromanipulateur manuel. Ensuite, à l’aide d’une pince crocodile, fixez un câble électrique à la base de l’arbre du porte-électrode. Connectez le câble à la cathode de l’alimentation.

Insérez un morceau de fil de tungstène de cinq centimètres dans le porte-électrode et vissez-le à l’arbre. Sur le manipulateur. Réglez l’alimentation sur six fois.

Pendant l’observation sous le microscope à dissection, insérez une électrode dans l’extrémité de la seringue de sorte que 90 % de la longueur des électrodes soit dans la solution. Au bout d’une minute, retirez lentement l’électrode, puis insérez-la à nouveau. Cette fois, seulement 50 % de l’électrode doit être en contact avec la solution.

Après 30 secondes, retirez à nouveau l’électrode. Répétez ce processus 10 fois à chaque fois en insérant l’aiguille de manière à ce que 50 % de l’électrode soit en contact avec l’hydroxyde de potassium. Une fois l’électrode affûtée, elle est prête à être utilisée pour des expériences.

Commencez la préparation du système de distribution d’odorisant en coupant le papier de chromatographie en bandes de trois millimètres sur cinq centimètres sur chaque pipette à bande de 30 microlitres de l’odorant souhaité. Placez ensuite la bande à l’intérieur d’un verre devant votre pipette. Fixez un morceau de tube d’air d’environ trois centimètres de long à la pipette.

Ensuite, utilisez un connecteur pour fermer le tube et placez les odorisants préparés de côté. Ensuite, à l’aide d’une lame de rasoir, coupez une pipette sérologique en plastique de 10 millilitres à partir de quatre millilitres à partir du haut, jetez l’extrémité pointue. Ensuite, à l’aide d’une petite perceuse, créez deux trous, l’un au repère de moins 1,5 millilitre et l’autre au repère de moins 0,5 millilitre.

Ensuite, insérez une pointe de pipette de 200 microlitres dans un coupleur cannelé et poussez le coupleur dans l’extrémité coupée de la pipette de 10 millilitres. Fixez la pipette à un support magnétique et positionnez-la près du microscope. Raccordez ensuite la pipette sérologique à une pompe à air à l’aide d’un tube d’air et placez les pipettes contenant les odorisants à côté de la pipette sérologique prête à l’emploi.

Ensuite, vissez les électrodes dans le porte-électrode et la sonde connectée aux manipulateurs sur la configuration du microscope. Placez un morceau de verre de protection sur la cire dentaire à un angle de 30 degrés, en vous assurant que la cire dentaire ne recouvre pas la partie supérieure du verre. Placez ensuite le morceau de cire dentaire dans la partie centrale d’un microscope.

Faites glisser maintenant, placez un petit morceau de cire supplémentaire sur la diapositive, comme indiqué ici au-dessus. Placez un capillaire en verre tiré à l’aide d’une extracteur vertical. Construisez un aspirateur de vol en insérant une pointe de pipette coupée de 200 microlitres dans une extrémité d’un morceau de tube d’air de 120 centimètres.

Couvrez l’autre extrémité du tube avec un morceau de maille de 1,5 centimètre sur 1,5 centimètre et fixez-le en place en le bouchant avec une coupe. Pointe de pipette d’un millilitre. Utilisez maintenant l’aspirateur de mouches pour ramasser une mouche adulte dans une bouteille.

Piégez la mouche en bouchant la pointe de l’aspirateur de mouches avec une pointe de 200 microlitres. Soufflez ensuite dans le tube pour pousser la mouche vers l’extrémité de l’embout de 200 microlitres. À l’aide d’une lame de rasoir, l’extrémité large de la pipette se trouve à quelques millimètres de la mouche.

Insérez rapidement de la cire dentaire pour piéger la mouche sous un microscope à dissection. Coupez la pointe de la pipette près de la tête de la mouche, en prenant soin de ne pas la blesser avec une petite pointe de pipette. Poussez la cire jusqu’à ce qu’environ la moitié des yeux de la mouche s’extrudent de la pointe.

Assurez-vous que les jambes ne sortent pas car elles pourraient interférer avec les enregistrements. Montez la mouche sur un morceau de cire, la tête vers le haut. Placez ensuite la cire sur la lame adjacente à la vitre de protection comme indiqué ici.

Poussez légèrement la cire pour que l’antenne s’étende et repose sur le verre. Fixez l’antenne en positionnant le capillaire en verre dans la rainure entre le deuxième et le troisième segment de l’antenne. Une fois que la mouche a été positionnée sur la lame, transférez-la dans le microscope utilisé avec les réglages d’enregistrement et d’odorisant à faible grossissement.

Placez l’antenne à peu près au milieu du champ de vision. Abaissez doucement l’électrode de référence et placez-la à côté de l’œil. Abaissez ensuite l’électrode d’enregistrement et positionnez-la à côté de l’antenne.

Augmentez le grossissement et repositionnez l’antenne au milieu du champ de vision. Placez le dispositif de diffusion d’odeurs près de la tête de la mouche pointant vers l’antenne. Revenez à un faible grossissement à l’aide d’un micromanipulateur.

Insérez l’électrode de référence dans l’œil de la mouche. Abaissez l’électrode d’enregistrement sur l’antenne sans toucher sa surface. Revenez ensuite à un grossissement élevé à l’aide du micromanipulateur.

Insérez l’électrode d’enregistrement dans un syn à n’importe quel point de sa longueur lorsque l’électrode a été correctement placée, une activité spontanée dans les cellules du sens peut être détectée. Si nécessaire, l’électrode peut être poussée plus loin ou même jusqu’au bout du sens pour obtenir un meilleur rapport signal/bruit. Pour enregistrer les réponses aux substances odorantes, connectez la pipette de pâturage à la pompe à air à l’aide d’un tube d’air et soufflez l’odorisant, dans ce cas, l’acétate de méthyle, en activant la pompe à air pendant environ une seconde à environ 220 millilitres par minute.

À l’aide d’un aspirateur électrique, recueillez des moustiques âgés de 40 à 63 à cinq jours dans une petite cage en plastique. Placez la cage sur de la glace pendant environ 15 minutes pour anesthésier les moustiques. Une fois que les moustiques ont cessé de bouger, transférez quatre à six moustiques au stade du microscope de dissection.

Hommes et femmes. Les moustiques peuvent être utilisés pour l’enregistrement. Chez les mâles.

Les antennes ressemblent à des plumes Alors que chez les femelles, elles apparaissent filamenteuses à l’aide de fines pinces, enlevez les ailes et les pattes des moustiques pour les immobiliser. Une fois les ailes retirées, placez les moustiques dans un gobelet en plastique humidifié pour éviter qu’ils ne se dessèchent. Placez deux morceaux de ruban adhésif double face d’un centimètre de long parallèlement l’un à l’autre et à environ un centimètre de distance au centre et sur le côté d’une lame de verre sous le microscope de dissection, utilisez une pince pour placer un moustique sur son côté.

Sur le ruban central. Un œil se collera à la bande. Ajustez la position des pulpes maxillaires de manière à ce qu’elles s’étendent parallèlement sur le ruban.

Fixez les pulpes maxillaires en plaçant de fines ficelles telles que des poils humains à la base et à l’extrémité des pulpes. Une fois que le moustique a été positionné sur la diapositive, transférez-le dans la configuration d’enregistrement. En position de faible grossissement, les pulpes maxillaires à peu près au milieu du champ de vision et la tête en haut font pivoter la platine jusqu’à ce que l’une des pulpes soit à angle droit.

Avec l’électrode d’enregistrement, ajustez la hauteur des électrodes de sorte que l’électrode de référence soit positionnée juste au-dessus de l’œil du moustique. Et l’électrode d’enregistrement se trouve près des pulpes maxillaires. Placez le dispositif de diffusion des odeurs de manière à ce qu’il soit le plus près possible des pulpes.

Insérez l’électrode de référence dans l’œil. Passez à l’objectif 100 x et insérez l’électrode d’enregistrement dans la cheville de l’palpe. Une fois que l’électrode est dans le sentum, l’activité spontanée des cellules peut être détectée.

Comme pour le registre de la drosophile, l’odorant a induit des réponses en soufflant l’odorant dans ce cas, un OCT trois en connectant la pipette postérieure contenant l’odeur à la pompe à air, puis en activant la pompe à air. Nous allons maintenant montrer quelques enregistrements représentatifs des neurones sensoriels olfactifs de la drosophile et de l’ophologie. En fonction du soleil et de la qualité de l’enregistrement, on peut distinguer différents nombres de neurones olfactifs au sein d’une seule trace dans la grande base emblématique silla de drosophila melanogaster, par exemple, entre deux et quatre cellules, cette différence d’amplitude de pointe devrait apparaître pendant l’enregistrement.

Cette figure montre des enregistrements réalisés à partir de deux cellules de drosophile AB deux lum. Les enregistrements de la cellule A sont affichés en bleu et les enregistrements de la cellule B sont affichés en vert, tandis qu’aucune des deux cellules n’est activée pendant l’application d’huile de paraffine. Comme le montre la figure de gauche, seule la réponse des cellules A à l’acétate de méthyle dans le pal maxillaire d’OPIS gambier, les chevilles rainurées et le soum contiennent trois cellules, mais seulement deux sont facilement discriminées. Ici.

Les enregistrements indiqués en vert indiquent la réponse des lymphocytes B à l’odorant, OCT trois. Nous venons de vous montrer comment enregistrer à partir des neurones sensoriels olfactifs de la mouche du vinaigre drosophile melanogaster, et du moustique du paludisme et du nouveau gambi. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’avoir une préparation d’isset stable et un réservoir et une électrode fins pour effectuer des enregistrements avec succès.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.