Name: Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette dactine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-03T16:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Découvrez l'imagerie en temps réel de neurones individuels et de cellules de la crête neurale dans les embryons de Danio rerio. Cette méthode par microscopie confocale permet d'étudier la motilité cellulaire et la dynamique de l'actine in vivo.

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Ce travail a été soutenu par le NIH R01 NS042228 au MCH L&#39;Olympus FV1000 confocale a été acquise avec une instrumentation NIH partagé octroi S10RR023717 au ministère UW Zoologie (PI Bill Bement). Erica Andersen, Namrata Asuri, et Matthew Clay ont contribué également à ce document.

1. Assemblée des diapositives et des diapositives d'injection d'imagerie Diapositives d'injection: <ol><li> Préparer élastomère de silicone Sylgard conformément aux instructions du fabricant. </li><li> Utilisez le Sylgard d'obligations à trois microscope en verre standard de diapositives ainsi que par l'empilement d'une diapositive sur le dessus de l'intersection des deux autres diapositives, qui sont disposés côte à côte sur les bords longs. Le chariot supérieur crée un angle droit ou de "mur" entre le haut et glisse en bas. </li><li> Laissez Sylgard mis nuit. Ces lames sont réutilisables. </li></ol> Diapositives d'imagerie: <ol><li> Nous utilisons des rectangles d'acier inoxydable coupées à la même taille d'une lame de microscope en verre standard (75mm x 25mm x 1mm) pour la chambre s'adapte le support de diapositives sur la platine du microscope. Un trou de 1,5 cm est coupé dans le centre du rectangle. </li><li> Apposez une lamelle de 22 mm 2 au rectangle en métal avec Sylgard. Utilisez juste assez pour bien sceller Sylgard la lamelle. Pour l'image sur un microscope inversé, les embryons seront montés sur cette lamelle et imagée à partir du bas. </li><li> Laissez Sylgard mis nuit. Ces lames sont réutilisables et nettoyé avec de l'éthanol à 70% entre les utilisations. </li></ol> 2. Préparation de constructions d'ADN Pour exprimer un transgène dans un tissu de manière spécifique, le gène d'intérêt est cloné derrière un promoteur spécifique des cellules. Nous utilisons un élément cis-régulatrices du gène de poisson zèbre neurogenin1 (-3.1ngn1) 2 ou le gène sox10 (-4.9sox10) 3 pour conduire l'expression dans les neurones sensoriels ou des cellules de la crête neurale, respectivement. Pour visualiser la dynamique cellulaire et la membrane, nous exprimons cytoplasmiques ou membranaires localisées fluorophores. Pour l'image de F-actine de distribution, nous exprimons l'ADN codant pour le domaine d'homologie calponine de l'utrophine fusionnée à mCherry (UtrCH-mCherry). La sonde UtrCH-mCherry biocapteur permet la visualisation de la F-actine, sans interférer avec la dynamique de l'actine 1. Nous générer ces constructions d'ADN en utilisant la passerelle Invitrogen recombinaison stratégie basée sur le clonage et les vecteurs de 4 fournie dans le poisson zèbre Tol2kit 5. <ol><li> Générer vecteur d'expression (s) en utilisant multisite-passerelle de la technologie et des vecteurs de la Tol2kit zebrafish 5. Les plasmides contenant l'épine dorsale du Tol2 pT2KXIGDin. </li><li> Purifier l'ADN plasmidique avec QIAfilter Plasmid Midi Kit de préparation (QIAGEN Inc) et éluer à l'eau stérile. L'ADN n'a pas besoin d'être linéarisé pour l'injection. </li></ol> 3. L'injection de constructions d'ADN <ol><li> Diluer l'ADN à une concentration finale de 10-50 pg / ml d'ADN dans le rouge de phénol à 0,2% (pour la visualisation lors de l'injection) dans l'eau. </li><li> Remplir et calibrer l'aiguille: Retour de remplissage d'une aiguille tiré capillaire avec environ 1 ul solution d'ADN et de l'insérer dans le porte-aiguille de l'appareil d'injection (nous utilisons un Picospritzer). En utilisant une pince fine, casser la pointe de l'aiguille de telle sorte que l'ouverture pointe est d'environ 10 mm de diamètre. Mesurer le diamètre de la gouttelette dans l'huile minérale avec un micromètre oculaire. Ajustez le réglage durée de la pression pour obtenir une goutte d'environ 1 volume nl. </li><li> Recueillir une cellule embryons au stade d'embryon dans le milieu de l'E3 (5mm de NaCl, KCl 0.17mm, 0.33mm CaCl 2, MgSO 4 * 0.33mm 7H 2 O, pH 7,0). </li><li> Transfert environ 30-60 embryons à la diapositive d'injection et la position de l'embryon dans le coin à angle droit formé entre le haut et glisse en bas. Enlever la plupart de l'E3 pour que les embryons sont tenues à la diapositive par tension superficielle. </li><li> Utilisez une épingle pliée disséquer pour faire tourner des embryons afin que la cellule est contre le mur de la lame d'injection. </li><li> Utilisez un micromanipulateur pour guider l'aiguille à travers le chorion embryon, à travers le jaune d'œuf et dans la seule cellule de l'embryon. Injecter 0.5 à 1 solution d'ADN nl dans la cellule. </li><li> Transfert des embryons en boîtes de Petri en E3 et incuber à 28,5 ° C. Si nécessaire, le développement peut être ralenti par l'incubation des embryons à plus basse température. </li></ol> 4. Embryons de montage pour l'imagerie <ol><li> Retirez le chorions des embryons avec des pinces fines environ une heure avant embryons atteignent l'âge souhaité pour l'imagerie (environ 14-17 heures après la fécondation pour nos fins). </li><li> Sélectionnez embryons avec des cellules marquées à l'aide d'un microscope de dissection équipés de fluorescence. Nous utilisons un objectif 4X (grossissement 40X) sur un champ de Nikon AZ100 en raison de sa combinaison de longue distance de travail et de grossissement élevé. </li><li> Placer un embryon dans un tube de micro avec environ 50 E3 ul contenant 0,2% de tricaïne anesthésiques (concentration 10X). </li><li> Ajouter 500 ul de 1% d'agarose bas point de fusion de l'E3 avec 10 mM HEPES (maintenue à 42 ° C), diluer la tricaïne à une concentration finale de 0,02%. </li><li> Immédiatement transférer l'embryon dans une goutte d'agarose à l'lamelle de la lame d'imagerie utilisant une pipette en verre grand diamètre. </li><li> Avant l'agarose se durcit, la position de l'embryon ainsi la région avec des cellules marquées est orientée vers le bas contre la lamelle du bas (bas dorsale pour les cellules de la crête neurale et dorsolatéral bas pour les neurones sensoriels spinaux). </li><li> Assemblez la chambre d'imagerie: Manteau d'un côté d'un anneau en plastique (2 cm de diamètre extérieur, 3 mm de haut) avec de la graisse de silicone sous vide et d'apposer à la diapositive imagerie métal. Manteau de l'autre côté de l'anneau avec de la graisse. </li><li> Remplir la chambre avec E3 contenant 10 mM d'HEPES et 0,02% tricaïne. Joint au sommet de chambre par l'apposition d'une lamelle de 22 mm 2 à la surface supérieure de l'anneau graissé. </li></ol> 5. L'imagerie 4D des comportements cellulaires sur l'Olympe FV1000 confocale avec IX81 Microscope Les détails de l'acquisition d'image dépendra des spécificités de votre système de microscope. Nous décrivons ici le processus d'acquisition time-lapse pour l'Olympus FV1000 microscope confocal. Voir le précédent protocole JoVE des time-lapse d'acquisition avec le Zeiss LSM 510 système confocal 6. <ol><li> Placez la chambre d'imagerie dans le support de diapositives sur la platine du microscope et de se concentrer sur l'embryon en utilisant un objectif 10x ou 20x en lumière transmise. </li><li> Basculer vers un objectif 60x (NA de 1,2 ou plus) et se concentrer sur la cellule étiquetés avec épifluorescence. Nous utilisons soit une immersion dans l'huile (UPLSAPO 60xO NA 1,35) ou de l'eau par immersion (UPLSAPO 60xW NA 1,20) lentille. </li><li> Dans le logiciel de FV (Ver 1.7c), cliquez sur répétez XY pour commencer le balayage laser. </li><li> Réglez les paramètres d'acquisition et de contrôle d'acquisition d'image (sortie de laser, la vitesse de balayage, HV, le gain, et les niveaux de décalage) pour optimiser le signal tout en gardant la puissance du laser à un minimum (25% ou moins) pour éviter d'endommager les tissus et réduire photoblanchiment. </li><li> Afin d'acquérir une série Z, définir les limites supérieure et inférieure de la Z-stack, avec la taille du pas. Assurez-vous que l'icône de profondeur est engagée afin que l'icône de balayage XY XY et Z a mis en évidence. Démarrer l'acquisition en cliquant sur l'icône de balayage XYZ. </li><li> Afin d'acquérir une série time-lapse, définissez l'intervalle de temps et le nombre de points dans le temps sous la rubrique TimeScan dans l'acquisition des paramètres de la fenêtre. Cliquez sur l'icône temps dans la fenêtre de contrôle Image Acquisition de telle sorte que l'icône de balayage XY a XY (Z) et T en surbrillance. Démarrer l'acquisition en cliquant sur le XY (Z) l'icône T Sweep. </li><li> Alternativement, le TimeController peut être utilisé pour mettre en place un time-lapse. Cette programmation est utile pour générer des ensembles de données volumineux, comme elle ne dépasse pas l'allocation de mémoire. Sous Périphérique, ouvrez la fenêtre TimeController. Créer une tâche d'imagerie. La fenêtre des paramètres d'image s'ouvre. Cliquez sur le bouton Etat FV à jour les paramètres d'acquisition. Assurez-vous Enregistrer et Supprimer sont vérifiés sous la rubrique Terminer. Définir le nom du fichier de sortie et cliquez sur OK pour enregistrer les paramètres et fermer la fenêtre. Utilisez la fonction de boucle pour définir l'intervalle de temps souhaité et le nombre de points dans le temps. Cliquez Ready et Start pour commencer l'acquisition. La pause et le Z-fonctions de changement peut être utilisé pour recentrer tout d'imagerie. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Les chiffres et les films représentent des exemples de neurones sensoriels et les cellules de la crête neurale étiquetés avec une membrane cible fluorophores ou la sonde biocapteur actine. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 images confocal (z-projections) de Tg (ngn1: GFP-CAAX). Embryon transgénique injectées avec 25 pg ngn1: mCherry-CAAX ADN. Les étiquettes mCherry-CAAX un neurone rouge (A) dans un fond avec tous les neurones sensoriels ROHON Barbe-étiquetés verts (B). C) image fusionnée des canaux vert et rouge. Barre d'échelle = 50 microns. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 confocale z-projections des neurones dans les embryons injectés avec ~ 20 pg ngn1:.. MCherry-UtrCH ADN A) ROHON Barbe-neurone sensoriel dans 16,5 embryons HPF. F-actine du signal est forte dans les cônes de croissance (flèches) et en saillies le long des axones nouvellement formé. B) Neuron dans 20 embryons HPF montrant une forte F-actine du signal dans les cônes de croissance de l'axone périphériques branchés (pointes de flèches) et signal plus faible dans le centre plus mature axones (flèches). Barre d'échelle = 50 microns.

<ol><li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li>
<li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li>
<li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li>
<li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination%3A+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li>
<li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li>
</ol>

La concentration optimale de l&#39;ADN injecté varie selon la taille et la force du promoteur de construire et doit être déterminée empiriquement. L&#39;injection d&#39;ADN trop peut conduire à des embryons malsaine avec la mort cellulaire étendue, tandis que trop peu se traduira par une très faible proportion des embryons injectés exprimant le transgène. Le niveau d&#39;expression d&#39;ADN est corrélée avec la force du signal fluorophore, qui varie de cellule à cellule. Alors que le tri des embryons en épifluorescence...

<table><tbody><tr><td>Tricaïne (méthanesulfonate d'éthyle 3-aminobenzoate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'élastomère de silicone Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Kit QIAfilter Plasmid Midi</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>051-0302-900</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Le poisson zèbre est un modèle idéal pour les comportements d&#39;imagerie cellulaire pendant le développement in vivo. Embryons de poisson zèbre sont fécondés à l&#39;extérieur et donc facilement accessible à toutes les étapes de développement. En outre, leur clarté optique permet d&#39;imagerie à haute résolution de la cellule et de la dynamique moléculaire dans le milieu naturel de l&#39;embryon intact. Nous utilisons une approche d&#39;imagerie en direct à analyser les comportements lors de la migration des cellules de crête neurale de cellules et de l&#39;excroissance et l&#39;orientation des axones neuronaux. Imagerie Live est particulièrement utile pour comprendre les mécanismes qui régulent les processus motilité cellulaire. Pour visualiser les détails de la motilité cellulaire, comme l&#39;activité de propulsion et de dynamique moléculaire, il est avantageux de marquer des cellules individuelles. Dans le poisson zèbre, l&#39;injection d&#39;ADN plasmidique donne une mosaïque d&#39;expression transitoire et offre des avantages distincts par rapport aux autres méthodes de marquage des cellules. Par exemple, des lignées transgéniques qualifient souvent les populations de cellules entières et peuvent donc occulter la visualisation des saillies fines (ou des changements dans la distribution moléculaire) dans une seule cellule. En outre, l&#39;injection de l&#39;ADN au stade d&#39;une cellule est moins invasive et plus précise que les injections de teinture à des stades ultérieurs. Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;étiquetage individuel des neurones en développement ou les cellules de la crête neurale et l&#39;imagerie par leur comportement in vivo. Nous injectons ADN plasmidique dans une cellule embryons au stade, qui se traduit par l&#39;expression du transgène mosaïque. Les vecteurs contiennent des cellules de promoteurs spécifiques de cette expression d&#39;entraînement d&#39;un gène d&#39;intérêt dans un sous-ensemble de neurones sensoriels ou des cellules de la crête neurale. Nous fournissons des exemples de cellules marquées à la GFP membrane cible ou avec une sonde biocapteur qui permet la visualisation de la F-actine dans les cellules vivantes 1. Erica Andersen, Namrata Asuri, et Matthew Clay ont contribué également à ce travail.

Ce protocole décrit l&#39;imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

Le poisson-zèbre est un modèle idéal pour l'imagerie des comportements cellulaires pendant le développement in vivo. Les embryons de poisson-zèbre sont fécondés externement et sont donc facilement...

Pour imager le comportement de cellules individuelles in vivo, un ADN plasmidique contenant un promoteur spécifique à la cellule, pilotant l'expression d'une flore quatre ou d'un biocapteur, est injecté dans des embryons de poisson zèbre. Les changements dynamiques dans la distribution sont visualisés in vivo à l'aide d'un biocapteur basé sur l'effet F et le domaine de liaison de l'utrophine. Des embryons récemment fécondés sont alignés le long de la lame d'injection et positionnés dans l'angle formé entre les lames supérieure et inférieure.L'ADN codant pour les marqueurs fluorescents ou les biocapteurs est injecté dans la cellule. Le lendemain, les embryons sont montés dans de l'aros.Sur la lame d'imagerie, les embryons sont positionnés avec les cellules marquées vers le bas et la chambre est scellée avec un couvre-objet. Bonjour, je suis Erica Anderson du laboratoire de Mary Hallin et des départements de zoologie et d'anatomie de l'Université du Wisconsin à Madison. Je suis Nam Tauri, également du laboratoire Hallin.Et je suis Matt Clay du laboratoire Hallin. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'imagerie en direct de cellules marquées individuellement chez des embryons de poisson zèbre. Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour étudier la motilité cellulaire et la dynamique de l'actine lors de la croissance des axones et de la migration des cellules de la crête neurale.Commençons. Pour assembler les lames d'injection, préparez d'abord l'élastomère de silicone cyl guard conformément aux instructions du fabricant. Mélangez 10 parties de la base d'élastomère avec une partie d'agent de durcissement.Utilisez le cyl pour assembler trois lames à microscope en verre standard. Disposez deux lames côte à côte selon leurs bords longs. Appliquez de l'ARD sur la troisième lame et placez-la par-dessus les deux autres lames.Utilisez juste assez de colle pour sceller les lames sans excès s'écoulant entre les lames. Tout excès peut être retiré le lendemain à l’aide d’une lame de rasoir. Laissez le protecteur SIL durcir toute la nuit avant l’imagerie des lames.Nous utilisons des rectangles en acier inoxydable découpés aux mêmes dimensions qu'une lame de microscope en verre standard, avec un trou de 1,5 centimètre au centre. Un coverslip carré de 22 millimètres est fixé au rectangle métallique à l'aide de Sylgard. Les lames d'injection et les lames d'imagerie sont réutilisables et peuvent être nettoyées entre chaque utilisation avec de l'éthanol à 70 %, puis rincées à l'eau avant l'injection d'embryons.Effectuez une dilution de l'ADN à une concentration finale de 10 à 50 microgrammes par millilitre. ADN dans de l'eau contenant 0,2 % de rouge de phénol. Le rouge de phénol permet la visualisation pendant l'injection.Ensuite, remplissez et étalonnez l'aiguille. Remplissez par aspiration rétrograde l'aiguille capillaire apol avec environ quelques microlitres de solution d'ADN. Attendez que l'aiguille soit remplie, puis insérez-la dans le porte-aiguille de l'appareil d'injection à l'aide de fines pinces.Cassez l'extrémité de l'aiguille de manière à ce que l'ouverture ait un diamètre d'environ 10 micromètres. Mesurez le diamètre de la goutte dans l'huile minérale à l'aide d'un micromètre oculaire. Pour calculer le volume d'injection, ajustez le réglage de durée du pico-spritzer.Ainsi, le diamètre des gouttelettes est de 0,12 micromètre ou environ un nanolitre en volume. Une durée de 10 à 30 millisecondes est typique. Recueillir les embryons au stade unicellulaire dans le milieu embryonnaire E3 et transférer environ 30 à 60 embryons sur la lame d'injection.Positionnez les embryons le long du bord de la lame supérieure et retirez la majeure partie du E three afin que les embryons soient maintenus contre la lame par tension superficielle à l’aide d’une épingle de dissection courbée. Faites pivoter les embryons pour que la cellule soit contre la paroi de la lame d’injection. Utilisez un micromanipulateur pour guider l’aiguille à travers le chorion de l’embryon, puis à travers le vitellus, jusqu’à l’intérieur de la cellule unique de l’embryon.Injectez 0,5 à un nanolitre de solution d'ADN dans la cellule. Transférez les embryons injectés dans des boîtes de Pétri en E3 et placez-les dans un incubateur à 28,5 degrés Celsius. Si nécessaire, le développement peut être ralenti en incubant les embryons à une température plus basse le jour suivant l'injection.Préparez les embryons pour l'imagerie environ une heure avant qu'ils n'atteignent l'âge souhaité pour l'acquisition d'images. Retirez les enveloppes coriennes des embryons à l'aide de pinces fines. Nous commençons généralement l'imagerie des embryons environ 14 à 17 heures après la fécondation.Ensuite, sélectionnez les embryons présentant des cellules marquées à l’aide d’un microscope stéréoscopique équipé de fluorescence ; nous utilisons un objectif Forex sur un microscope Nikon a Z 100 en raison de sa combinaison de grande distance de travail et de fort grossissement. Placez un embryon dans un tube microfuge contenant environ 50 microlitres de V trois. Ajoutez du stock de trica et de l’agarose à 1 % à bas point de fusion fondue pour obtenir une concentration finale de 0,02 % de trica à l’aide d’une pipette en verre à large orifice.Transférez immédiatement l'embryon dans une goutte d'agro sur la lamelle de la préparation d'imagerie, avant que l'agro ne durcisse. Positionnez l'embryon de manière à ce que la région contenant les cellules marquées soit orientée vers le bas, en contact avec la lamelle inférieure. Ensuite, assemblez la chambre d'imagerie. Enduisez un côté d'un anneau en plastique de graisse silicone pour vide et fixez-le sur le support métallique d'imagerie.Enduisez de graisse l'autre face de l'anneau. Remplissez la chambre avec du E trois contenant des tas de 10 millimolaires et 0,02 % de Trica. Scellez le dessus de la chambre en fixant une lame couvre-objet de 22 millimètres carrés sur la surface supérieure graissée de l'anneau. L'embryon est désormais prêt pour l'imagerie en quatre D, comme cela sera montré dans la section suivante.Les détails de l'acquisition d'images dépendront des caractéristiques spécifiques de votre système de microscope. Ici, nous démontrons le processus d'acquisition en lapse de temps pour le microscope confocal Olympus FB 1000. Voir le protocole JO précédent pour l'acquisition en lapse de temps avec le système confocal Zeiss LSM five 10.Placer la chambre d'imagerie dans le porte-lame sur la platine du microscope et focaliser sur l'embryon à l'aide d'un objectif 10 x ou 20 x. En lumière transmise, passer à un objectif de 60 x avec une ouverture numérique de 1,2 ou supérieure, puis focaliser sur une cellule marquée en utilisant la fluorescence d'excitation dans le logiciel FV. Cliquer sur répétition xy pour commencer le balayage laser.Ajustez les paramètres d'acquisition et les commandes d'acquisition d'image pour optimiser l'image et acquérir une série en Z. Réglez les limites supérieure et inférieure du Z ainsi que la taille du pas. Activez l'icône de profondeur dans la fenêtre de commande d'acquisition d'image et démarrez l'acquisition en cliquant sur l'icône XY, série Z pour acquérir une série temporelle.Définissez l'intervalle de temps et le nombre de points temporels dans la section de balayage temporel. Dans la fenêtre des paramètres d'acquisition, cliquez sur l'icône de temps située dans la fenêtre de contrôle de l'acquisition d'image, puis démarrez l'acquisition en cliquant sur l'icône de la suite XYZT. Nous présentons ici des films et des images représentatifs de cellules individuelles marquées.Lorsque des neurones individuels sont marqués, leurs axones ne sont pas masqués par d'autres cellules marquées, ce qui permet d'observer clairement les prolongements OD sur les axones et les cônes de croissance. Ce film montre un neurone sensoriel marqué avec la protéine RFP ciblée vers la membrane. Il émet deux axones dans des directions opposées qui s'étendent hors du champ de vision.Un troisième axone s'étend de manière orthogonale à partir du corps cellulaire et forme des branches. De même, l'étiquetage de cellules individuelles de la crête neurale permet l'imagerie des fins prolongements cellulaires associés à la motilité cellulaire. Ici, deux cellules de la crête neurale sont marquées avec une GFP ciblant la membrane.Ils présentent une activité protractive étendue lorsqu'ils migrent dans une direction antérieure. Il est souvent utile de marquer individuellement des cellules au sein d'une lignée transgénique afin de visualiser les interactions entre cellules voisines au sein d'une population. Cette image montre un embryon exprimant de manière stable la GFP dans tous les neurones sensoriels, qui a été injecté par de l'ADN codant pour l'étiquette RFP afin de marquer en rouge un neurone au milieu de neurones verts, par injection d'ADN codant.La sonde du capteur biosensible à l'actine montre un effet plus marqué dans le signal au niveau des cônes de croissance et des protrusions dynamiques le long des axones nouvellement formés, par rapport au corps cellulaire. À un stade ultérieur, le signal reste intense dans les cônes de croissance, tandis que les axones matures présentent un signal nettement plus faible. Nous venons de vous montrer comment réaliser un imaging en temps réel de neurones et de cellules de la crête neurale marqués individuellement chez des embryons de poisson zèbre.Lors de cette procédure, il est important de choisir des embryons dans lesquels l'ADN n'est pas exprimé à des niveaux suffisamment élevés pour provoquer une toxicité ou une mort cellulaire. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode permettant d'analyser le cerveau des vertébrés en développement dans embryons de poissons zèbres vivent à la résolution seule cellule par microscopie confocale. Cela inclut la méthode par laquelle nous injectons de l'embryon de poisson zèbre à cellule unique, puis monter et l'image du cerveau en développement.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

La clé de la compréhension des processus morphogénétiques qui façonnent l'embryon précoce est la capacité de cellules d'image à haute résolution. Nous décrivons ici une technique de marquage des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans des embryons de zebrafish entier avec membrane cible protéine fluorescente verte.

L&#39;étiquetage et l&#39;imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

La vidéo montre le présent une méthode qui prend avantage de la combinaison de l'électroporation et la microscopie confocale pour l'imagerie en direct sur chaque cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur poisson zèbre en développement.

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Cellules qui meurent sont extrudés à partir des tissus épithéliaux par la contraction concertée des cellules voisines, sans perturber la fonction de barrière. La clarté optique de développement du poisson zèbre offre un excellent système pour visualiser l'extrusion dans la vie épithéliums. Nous décrivons ici les méthodes d'induire et d'extrusion d'image dans l'épiderme zebrafish larvaire à une résolution cellulaire.

Imagerie cellulaire en direct d&#39;extrusion de l&#39;épiderme du poisson zèbre développement

Source : Williams, A. L., et al. Imagerie multi-photonique Time Lapse pour visualiser le développement en temps réel : visualisation des cellules de la crête neurale en migration dans les embryons de poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo présente un protocole d’imagerie time-lapse multiphotonique permettant de visualiser la migration des cellules de la crête neurale dans un embryon de poisson-zèbre en temps réel avec une haute résolution.

Visualisation de la migration des cellules de la crête neurale dans un embryon de poisson-zèbre à l’aide de l’imagerie multiphotonique en accéléré

L’imagerie du comportement dynamique des organites et d’autres structures subcellulaires in vivo peut faire la lumière sur leur fonction dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous présentons des méthodes de marquage génétique de deux organites, les centrosomes et les mitochondries, et d’imagerie de leur dynamique dans des embryons de poisson-zèbre vivants à l’aide de la microscopie à grand champ et confocale.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

Les protocoles décrits ici permettent d’étudier les propriétés électriques des cellules excitables dans les conditions physiologiques les moins invasives en utilisant des embryons de poisson-zèbre dans un système in vivo associés à un indicateur de tension génétiquement codé (GEVI) basé sur le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) exprimé sélectivement dans le type de cellule d’intérêt.

Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés

Une combinaison des techniques optiques avancées de lecture avec excitation de fluorescence multi-photons longue longueur d’onde de laser a été mis en œuvre pour capturer l’imagerie haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de la migration de la crête neurale en Tg (sox10:EGFP) et les embryons de poissons zèbres Tg (foxd3:GFP).

Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre

Nous faisons la démonstration d’une méthode qui tire parti de la microscopie confocale à balayage rapide pour effectuer une imagerie en direct des cellules microgliales dans le tectum optique du poisson-zèbre en développement, permettant ainsi l’analyse de la dynamique de ces cellules in vivo.

Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie chez l’embryon de poisson-zèbre

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour examiner l’activité neuronale dans les régions cérébrales du poisson-zèbre transgénique qui expriment des indicateurs calciques GCaMP à l’aide de la microscopie confocale.

In vivo Imagerie confocale par fluorescence de l’activité neuronale induite par la stimulation sensorielle chez des larves de poisson-zèbre partiellement restreintes

La jonction neuromusculaire larvaire du poisson-zèbre est un modèle intéressant pour l’étude de la physiologie synaptique. Il se prête à de nombreuses techniques expérimentales, notamment l’électrophysiologie et l’imagerie optique. Ici, nous décrivons un protocole d’imagerie de la transmission synaptique à l’aide d’une sonde à base de pHluorin sous un microscope à épifluorescence vertical.

Imagerie en direct du recyclage des vésicules synaptiques dans la jonction neuromusculaire de larves de poisson-zèbre disséquées

Découvrez l'imagerie en temps réel de neurones individuels et de cellules de la crête neurale dans les embryons de Danio rerio. Cette méthode par microscopie confocale permet d'étudier la motilité cellulaire et la dynamique de l'actine in vivo.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette dactine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d'actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

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