Synthèse et d'étalonnage des nanosondes phosphorescent pour l'imagerie oxygène dans les systèmes biologiques

Nous présentons la conception de sondes phosphorescentes pour l'oxygène basées sur des DER de porphyrine de platine et de palladium. Les sondes sont constituées de cœurs de métalloporphyrine encapsulant des dendrons et une couche périphérique hydrophile de polyéthylène glycol ; la construction des sondes et leurs étalonnages seront illustrés dans cet article. Bonjour, je m'appelle Luis Sinks.

Je travaille avec le professeur Sergei OV au sein du département de biochimie et de biophysique de l'Université de Pennsylvanie. Je suis Emmanuel Losis, également originaire de Vina. Je viens aussi de là, et je suis Sergei. Les mesures biologiques d'oxygène par phosphorescence et extinction utilisent des sondes phosphorescentes exogènes, qui sont introduites directement dans le milieu d'intérêt.

Les sondes sanguines ou interstitielles constituent la seule composante invasive du protocole de mesure nécessitant une attention particulière quant à leur conception. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de synthèse et d'étalonnage de nanosondes phosphorescentes dendritiques destinées à la mesure de l'oxygène dans des systèmes biologiques. Nous utilisons cette procédure pour synthétiser et caractériser des sondes destinées à des mesures d'oxygène semi-quantitatives et doubles.

Commençons. Avant de commencer à concevoir des sondes, examinons d'abord la théorie fondamentale sous-jacente à la phosphorescence des sondes. La phosphorescence provient de l'état triplet à longue durée de vie.

La molécule sonde doit être conçue pour offrir un rendement quantique élevé de l'état triplet et pour émettre de la phosphorescence plutôt que de la fluorescence. L'excitation des sondes se produit par un photon, ou, dans le cas de sondes spéciales à renforcement biphotonique, par un mécanisme à deux photons. L'excitation à un photon fournit généralement une résolution spatiale moindre, mais nécessite un instrument plus simple et peut être utilisée dans des mesures ponctuelles avec des phosphorimètres à fibre optique basés sur des LED.

À l’état triplet, la sonde peut entrer en collision avec des molécules d’oxygène, ce qui peut désactiver l’état triplet selon un processus appelé extinction. Par conséquent, en présence d’oxygène, la durée de vie de la phosphorescence est réduite. En raison de cette extinction, la dépendance de la durée de vie de l’état triplet par rapport à la quantité d’oxygène dans l’environnement est décrite par l’équation de Stern-Volmer.

Dans les expériences in vivo, la sonde est administrée dans le sang ou le liquide interstitiel d'un animal, et la surface du tissu est illuminée avec une lumière d'une longueur d'onde appropriée afin de porter la sonde à son état triplet excité. Afin de mesurer la durée de vie phosphorescente, les photons phosphorescents émis sont comptés en fonction du temps. Par exemple, après l'impulsion d'excitation, 3 609 photons peuvent être collectés durant les cinq premières microsecondes, 1 421 photons durant les cinq microsecondes suivantes, et ainsi de suite jusqu'à ce qu'aucun photon ne soit détecté.

Les nombres dans les compartiments tracés en fonction du temps donnent le décroissement de la phosphorescence, qui est analysé pour obtenir la durée de vie de la phosphorescence. En imagerie, cette procédure est appliquée à chaque pixel de l'image, produisant des cartes de durée de vie phosphorescente. Les mesures de durées de vie sont insensibles aux hétérogénéités de la répartition de la sonde dans tout l'objet, ce qui est courant pour les échantillons biologiques.

Examinons maintenant comment construire des sondes. Commencez la procédure de synthèse en ajoutant un aldéhyde aromatique à une solution tétra hydro iso indole de 0,01 molaire. Agitez le mélange réactionnel pendant 10 minutes à l'obscurité et à température ambiante.

Ensuite, ajoutez du borure de trifluorodathylate et continuez à agiter pendant deux heures supplémentaires. Ajoutez ensuite du dichlorure de cyanobenzoquinone ou DDQ, ce qui entraîne un changement de couleur, passant du rouge pâle au vert foncé. Laissez le mélange toute la nuit sous agitation continue. Le lendemain, lavez et séchez la solution, puis concentrez-la sous vide.

La cristallisation du résidu donne le produit cible sous forme d'une poudre verte. Les rendements sont généralement d'environ 50 %. Ensuite, traitez la base libre de porphyrine avec de l'acétate de palladium. Surveillez la conversion par spectroscopie UV-visible.

La conversion est terminée lorsque la bande d'absorption du Dion située entre 468 et 472 nanomètres disparaît. La porphyrine est isolée par chromatographie sur colonne sur gel de silice. Pour préparer la tétrabenzoporphyrique de palladium, oxyder la tétracycloporyphrine de palladium.

Lors de la réflexion, la couleur passe du rouge foncé au vert profond, évaporez le solvant, diluez le résidu avec du dichlorométhane, lavez, séchez et concentrez la phase organique sous vide. Après chromatographie sur gel de silice, isolez la tétrabenzoporphyrazine de palladium sous forme de poudre bleu-vert. Ensuite, hydrolysez les groupes périphériques éthers du tétrabenzoporphyrazine de palladium.

Traitez d'abord l'ester de tétra benzo porphyrine avec une base dans du tétra hydro purine. Poursuivez ensuite l'hydrolyse par une base aqueuse, précipitez la porphyrine par ajout d'acide chlorhydrique et séchez-la sous vide. Cette étape achève la synthèse de la porphyrine.

Examinons maintenant comment synthétiser les entrons. Avant l'assemblage des sondes, les entrons, qui sont les branches du Danemark, doivent être préalablement synthétisés. Nous utilisons l'aéro-gly, les mêmes DERs, qui peuvent être facilement préparés à partir de matériaux étudiants peu coûteux par des méthodes sans chromatographie.

Des dendrimères portant des groupes amines en leurs points focaux sont ensuite fixés aux groupes carboxyles du phy, que nous venons de vous montrer comment synthétiser. Puis, les groupes esters situés en périphérie du DME sont hydrolysés de manière analogue aux groupes carboxyliques situés en périphérie de la porphyrine. À ce stade, à partir de l'acide polycarboxylique de porphyrine DME, un ou deux sondes bi-photons peuvent être synthétisés afin d'obtenir les sondes bi-photons.

Tout d'abord, greffer de façon divergente quelques fragments d'antenne à deux photons sur plusieurs groupes carboxyle situés à la périphérie du dimère. Puis procéder à la modification des résidus d'acide carboxylique restants sur le dimère. Commencer par ajouter un excès de 1,25 fois celui du HBTU à une solution fortement concentrée du monomère de porphyrine et agiter le mélange réactionnel à température ambiante pendant 10 minutes.

Ajoutez maintenant de la diisopropyléthylamine et de la méthoxy-polyéthylèneglycolamine. Agitez le mélange réactionnel pendant deux jours à température ambiante, puis ajoutez de l'éther éthylique. Séparez le précipité par centrifugation et re-précipitez-le plusieurs fois à partir de tétrahydrofurane en ajoutant de l'éther éthylique.

Enfin, purifiez la sonde par chromatographie d'exclusion stérique sur des billes de polystyrène en utilisant le tétrahédran comme solvant. Examinons maintenant la caractérisation et l'étalonnage de la sonde. Les spectres d'absorption et d'émission de la sonde sont obtenus à l'aide de solutions de sonde d'une concentration d'un micromolaire dans des conditions ambiantes, à l'aide d'un spectrophotomètre standard et d'un fluorimètre en régime permanent.

Ensuite, pour obtenir le tracé de calibration Stern-Ulmer, qui nous permet de relier la durée de vie de la sonde à la concentration en oxygène, placez une solution de la sonde dans un vial cylindrique spécial. Le vial est placé à l'intérieur d'une chambre thermostatée, elle-même située dans une enceinte opaque à la lumière comportant des orifices pour les fibres optiques d'excitation et d'émission. Fermez le vial avec un bouchon dans lequel est insérée une électrode à oxygène de type Clark très sensible.

Le bouchon comporte également deux ports d'aiguille pour l'entrée et la sortie d'Argonne. Régler la température entre 36 et 37 degrés Celsius et laisser le mélange sous agitation jusqu'à ce qu'il atteigne l'équilibre. Connecter la fibre d'excitation à la prise d'excitation d'un phosphomètre numérique contrôlé par un ordinateur.

La source lumineuse et le phos périphérique correspondent à une LED haute puissance dont la sortie est contrôlée par une carte numérique vers analogique de 333 kilohertz. La fibre d'émission est connectée à un autre port optique du phos périphérique, qui est couplé à une photodiode à avalanche sensible aux infrarouges. La sortie de la photodiode est amplifiée et envoyée vers le canal ad de la même carte de commande, permettant ainsi une synchronisation entre les canaux d'excitation et d'émission.

Le logiciel de commande conçu sur place génère des impulsions d'excitation de durée souhaitée, suivies de la collecte de la décroissance de la phosphorescence. La sortie de l'électrode à oxygène est amplifiée et dirigée vers une autre carte analogique-numérique sur le même ordinateur. Il s'agit d'une carte basse fréquence, avec une fréquence maximale de un kilohertz, utilisée pour enregistrer le courant de l'électrode à des instants précis, généralement dix fois par seconde.

Une fois la température de la solution équilibrée, le périmètre phos et les programmes de l'électrode sont initialisés simultanément. Pour effectuer des mesures toutes les 10 secondes, leurs sorties sont enregistrées de manière synchronisée dans deux fichiers distincts. Ensuite, Argonne est connecté au port d'entrée du bouchon d'étanchéité.

Lorsque l'argon circule sur la surface de la solution agitée, il remplace progressivement l'oxygène. Cela entraîne une diminution du courant de l'électrode et une augmentation de la durée de vie du phosphore, mesurée à l'aide du phos-périmètre. Généralement, l'oxygène est entièrement éliminé de la solution.

Environ deux heures après l'achèvement du titrage, les données de l'électrode et les durées de vie du phosphore sont importées dans un programme standard d'analyse, qui produit un graphique de l'inverse de la durée de vie du phosphore en fonction de la pression partielle d'oxygène. Ce graphique est ajusté par une droite à l'aide de la méthode des moindres carrés, la pente de cette droite fournissant la constante de piégeage de l'oxygène. La durée de vie phosphorescente est obtenue soit à partir de cet ajustement, soit directement à partir de la mesure à pression d'oxygène nulle.

Le titrage peut être répété à l'aide d'une solution de la sonde en présence d'albumine, une protéine présente dans le plasma sanguin afin de simuler les conditions rencontrées dans le sang d'un animal in vivo. Les tracés de Stern-Volmer obtenus devraient être identiques si le RE protège la sonde. Eh bien, et les groupes PEG isolent la sonde du contact avec l'albumine.

La suggestion ici consiste à sélectionner des étapes dans la synthèse de l'oxygène, puis à traiter les sondes et à les étalonner. Lors de l'étalonnage, il est important de s'assurer que les conditions sont aussi proches que possible de celles du système biologique étudié.

Il est important de s'assurer que la molécule sonde n'est pas affectée par des biomolécules, telles que l'albumine. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.