Name: Modèle murin de CD40-activation des cellules B (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Découvrez l'activation et l'expansion des cellules B murines par CD40 à partir de splénocytes de souris C57BL/6. Cette méthode permet d'étudier l'induction des réponses immunitaires et les applications immunothérapeutiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions le Dr Clemens gentiment Wendtner pour fournir lignée cellulaire tmuCD40-Ligand-HeLa.

Le protocole pour la génération de cellules murines B CD40-activé (mCD40B) à partir de splénocytes est divisé en deux parties: la partie A montre la préparation d'murin CD40 ligand (CD40L) exprimant des cellules HeLa (HeLa tmuCD40L), qui sera utilisé comme plate- liés cellules nourricières. Partie B décrit la réelle murin CD40-B de la culture. A. Préparation de cellules nourricières (tmuCD40L HeLa) Les cellules HeLa tmuCD40L est une adhérente lignée humaine de cellules épithéliales, qui ne devrait jamais devenir complètement confluentes. Les cellules sont donc découpé deux fois par semaine. La culture sur plus de six semaines n'est pas recommandée. <ol><li> Retirer ancien milieu de la culture primaire avec une pipette stérile et laver les cellules avec 10 ml de PBS 1x. Aspirer le PBS après le lavage. </li><li> Ajouter 4 mL de 1x trypsine / EDTA dans un flacon de 75 cm2 pendant 10-15 minutes à 37 ° C. Utilisez tapotant doucement pour détacher les cellules. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu de type sauvage et pivotant doucement pour arrêter la digestion à la trypsine. </li><li> Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml avec une pipette stérile et le spin des cellules vers le bas à 265 xg pendant 7 minutes. </li><li> Retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 10 mL de milieu de type sauvage. Comptez le nombre de cellules d'une aliquote de la suspension cellulaire et préparer trois tubes de 50 ml avec le nombre approprié de cellules: <ol><li> 2,5 x 10 6 cellules pour une sous-culture </li><li> 0,4 x 10 6 cellules / puits pour l'irradiation utilisée pour la culture de cellules CD40-B murines </li><li> restant à geler (si nécessaire). </li></ol></li><li> Faites tourner les cellules vers le bas à 265 xg pendant 7 minutes. </li><li> Enlever le surnageant. <ol><li> Pour repiquage: resuspendre 2,5 x 10 6 cellules dans 10 ml milieu de sélection dans un flacon de 75 cm2 de culture de cellules (2,5 x densité cellulaire 10 5 cellules / ml) et incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2. Fractionner les cellules deux fois par semaine. </li><li> Pour la culture de cellules CD40-B murines: Vous avez besoin de 2,4 x 10 6 cellules pour une plaque de 6 puits. Resuspendre les cellules HeLa tmuCD40L en milieu sauvage à une densité de 0,2 x 10 6 cellules / ml et les irradier à 78 Gy. Planche 2 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits et les incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. Utilisez cette assiettes préparées pour la stimulation des lymphocytes B lors tmuCD40L cellules HeLa sont adhérentes (au moins 4 heures: vérifier l'adhérence à l'aide du microscope, ne pas attendre plus de 24 h pour commencer la stimulation des lymphocytes B). (Continuer avec B.) </li></ol></li></ol> B. murin CD40-culture de cellules B I. Préparation des splénocytes pour CD40-stimulation (jour 0): S'il vous plaît noter: avant de continuer de s'assurer que les cellules nourricières sont adhérentes. Toujours ajouter de nouvelles solutions d'murin immédiatement interleukine-4, β-mercaptoéthanol et cyclosporine A au milieu de croissance avant l'utilisation. <ol><li> Disséquer la rate de souris C57BL / 6 (haplotype H-2b) et il laver deux fois dans 10-20 ml de DMEM complété avec Gentamycine [15μg/mL] en le transférant avec une pointe de pipette 10 ml d'un tube à l'autre. Évitez les contaminants transfert (par exemple les cheveux) de la souris. Hacher la rate en passant à travers une passoire cellulaire (100 microns) et rincez avec un autre filtre de 10 mL de milieu. Isoler splénocytes à 265 xg pendant 7 min à température ambiante, les remettre en suspension dans 7mL muCD40-B milieu cellulaire, et les lymphocytes séparés par centrifugation de densité de Ficoll. Pour ce faire des cellules couche sur 5 ml souris Pancoll (préchauffé à la température ambiante) dans un tube de 15 ml et centrifuger à 450 xg pendant 30 min sans frein à la température ambiante. </li><li> Prélever la plupart de la couche supérieure, laissant intacte la couche de lymphocytes à l'interface. Transfert couche de lymphocytes dans un nouveau tube de 50 ml, laver une fois avec 30 ml de DMEM avec Gentamycine [15μg/mL] en faisant tourner le bas à 265 xg pendant 7 min pour éliminer d'autres cellules. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu B mCD40-linge. Déterminer le nombre de cellules dans une aliquote de la suspension cellulaire. Déterminer le nombre de cellules en comptant une aliquote de la suspension cellulaire. </li><li> Isoler le montant requis de cellules à 265 xg pendant 7 minutes. Pour une plaque à 6 puits 5 x 10 6 cellules / puits sont nécessaires, donc 30 x 10 6 cellules par plaque. </li><li> Retirer le surnageant et remettre les lymphocytes à 1,25 x 10 6 cellules / ml dans mCD40-B milieu de culture fraîchement complété avec 1 U / ml d'interleukine-4 comme facteur de croissance, 100 M β-mercaptoéthanol et 0,63 g / mL cyclosporine A pour prévenir la excroissance de cellules T (concentrations données se référer à un milieu de culture ml!). </li><li> Retirer le surnageant de la plaque de 6 puits de pré-incubées avec des cellules HeLa tmuCD40L. </li><li> Ajouter délicatement 4 mL de la suspension lymphocytaire (1,25 x 10 6 cellules / ml) dans chaque puits de la plaque de 6 puits. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li> Au jour 3 reculture les cellules (Continuer avec II.1.). </ol> II. Repiquage de cellules mCD40B (3 jours et ensuite deux fois par semaine): <ol><li> Grappe des piles à Moisson mCD40B par vigoureusement aspiration et refoulement avec une pipette de 10 ml et de les mettre dans un tube de 50 ml. </li><li> Isoler à 265 xg pendant 7 minutes et remplacer complètement le surnageant avec mCD40-B milieu de lavage. Alors que le comptage des cellules du montant d'une aliquote, tourner les cellules vers le bas à 265 xg pendant 7 minutes. Resuspendre les cellules dans mCD40B mCD40-B milieu de culture à une concentration de 0,75 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Ajouter de nouvelles solutions d'murin de l'interleukine-4 à une concentration de 1 U / ml, 100 M β-mercaptoéthanol et 0,63 g / mL cyclosporine A dans le milieu. </li><li> Retirer le surnageant dans une plaque de 6 puits de pré-incubées avec des cellules HeLa irradiées tmuCD40L. </li><li> Ajouter délicatement 4 mL de la suspension cellulaire mCD40B (0,75 x 10 6 cellules / ml) dans chaque puits de la plaque de 6 puits. </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Encore une fois les cellules sous-culture tous les 3-4 jours pour finir avec très pure murin cellules B CD40-activé après un total de 14 jours. </li></ol> C. Dépannage: Que faire si le CD40-B cellules ne poussent pas? <ol><li> Avez-vous vérifié l'expression du ligand CD40 des cellules nourricières? </li><li> Les cellules de la plaque liée alimentation utilisée pour la stimulation de plus de 24h? </li><li> Yat-il une contamination par des mycoplasmes? </li><li> Était la solution interleukine-4 utilisé pour la supplémentation fraîchement dégelé et at-elle avoir l'activité biologique approprié? </li><li> Etait-β-mercaptoéthanol et la cyclosporine A a ajouté de la concentration correcte? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="Figure 1 a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1 une"> Figure 1a. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="Figure 1 b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1 b"> Figure 1b. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="Figure 1 d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1 d"> Figure 1d. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li>
<li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li>
<li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+Ligand-activated%2C+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. S. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li>
</ol>

Les expériences ont été réalisées en conformité avec les directives nationales et européennes pour garder des animaux de laboratoire. Se référant à la loi allemande du bien-être des animaux les animaux ont été contrôlés régulièrement par les autorités compétentes.

Modifications de ce protocole sont possibles, notamment sur l&#39;origine du CD40-stimulus et le type de souche de souris utilisée, également dans la production à rendement efficace de cellules murines B CD40-activé. Ahmadi et al. ont montré des résultats similaires pour les fibroblastes de souris transfectées avec CD40-ligand murin. Dans ce contexte de présentation xéno-antigènes peut être exclu avec certitude, mais des études intensives concernant la sécurité et la toxicité in vivo a donné aucun signe d&#39;i...

A. Préparation des médias: <table border="1"><tbody><tr><td> Cellules nourricières type de support sauvages </td><td> Milieu de sélection de cellules Feeder </td><td></td></tr><tr><td> Réactifs </td><td> Concentration </td><td> Réactifs </td><td> Concentration </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 300 pg / mL </td><td> L-Glutamine </td><td> 300 pg / mL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycine B </td><td> 0,2 mg / ml </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B milieu de lavage </td><td> mCD40-B milieu de culture </td></tr><tr><td> Réactifs </td><td> Concentration </td><td> Réactifs </td><td> Concentration </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 580 pg / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 580 pg / ml </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> 4,5 mg / ml </td><td> Le glucose </td><td> 4,5 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0.1mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Réactifs Divers: <table border="1"><tr><td> Réactifs </td><td> Société </td><td> Ordonnance n </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> AAP </td><td> Cat No H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Sélectionnez Delta </td><td> Art Pas 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Aucun chat DE14-802C </td></tr><tr><td> Tampon HEPES </td><td> AAP </td><td> Cat No S11-001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> AAP </td><td> Aucun chat P02-015 </td></tr><tr><td> Recombinant murin interleukine-4 </td><td> Immunotools </td><td> Cat No 12340045 </td></tr><tr><td> Cyclosporine A </td><td> Novartis </td><td> Cat No 0078-0109-01 NDC </td></tr><tr><td> Trypsine / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C. Fournitures diverses: <table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Société </td><td> Ordonnance n </td></tr><tr><td> Stérile pipette </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-même la plaque </td><td> NUNC </td><td> Cat No 140675 </td></tr><tr><td> 50mL tube conique </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Cat No 352070 </td></tr><tr><td> Flacon de culture tissulaire </td><td> Sarstedt </td><td> Aucun chat 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

modèle murin de cd40-activation des cellules b

Murine Model of CD40-activation of B cells

La recherche sur les cellules B CD40 a montré que l&#39;activation améliore leur capacité de présentation antigénique. Lorsqu&#39;ils sont stimulés par l&#39;interleukine-4 et CD40 ligand (CD40L), les lymphocytes B humains peut être étendu sans difficulté à partir de petites quantités de sang périphérique dans les 14 jours pour très grandes quantités de très-pur-CD40 des cellules B (&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Cellules par patient) provenant de donneurs sains ainsi que des patients atteints de cancer<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Cellules CD40-B expriment des molécules importantes ganglion homing et peuvent attirer les cellules T<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 5</sup&gt;. En outre, ils prennent efficacement, le processus et présentent les antigènes aux cellules T<sup&gt; 6,7</sup&gt;. Cellules CD40-B ont été montrés pour non seulement naïve écoute, mais également d&#39;élargir la mémoire des lymphocytes T<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Par conséquent CD40-activé des cellules B (CD40-cellules B) ont été étudiés comme une source alternative de l&#39;immuno-stimulation des cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC) à base de cellules immunotherapy1, 5,10. Afin d&#39;étudier plus avant si les cellules CD40-B induisent des réponses efficaces cellules T in vivo et d&#39;étudier le mécanisme sous-jacent, nous avons établi un système de culture cellulaire pour la génération de cellules murines B CD40-activé. Utiliser splénocytes ou purifiée cellules B de souris C57BL / 6 pour les CD40-activation, les conditions optimales ont été identifiées comme suit: A partir de splénocytes de souris C57BL / 6 (haplotype H-2b) de lymphocytes sont purifiées par centrifugation sur gradient de densité et de co-cultivées avec des cellules HeLa cellules exprimant recombinant murin CD40-ligand (tmuCD40L HeLa)<sup&gt; 11</sup&gt;. Les cellules sont repiquées tous les 3-4 jours et les composants clés tels que CD40L, l&#39;interleukine-4,-mercaptoéthanol et la cyclosporine A sont reconstituées. Dans ce protocole, nous montrons comment obtenir pleinement activé murin CD40-cellules B (mCD40B) avec APC-phénotype similaire aux humains CD40 des cellules B (figure 1a, b). CD40-stimulation conduit à une excroissance rapide et l&#39;expansion de la très pure (&gt; 90%) CD19 + cellules B dans les 14 jours de culture cellulaire (figure 1c, d). Pour éviter la contamination par des cellules non transfectées, l&#39;expression du ligand CD40 murin sur les transfectants doit être contrôlée régulièrement (figure 2). Murin CD40-activé des cellules B peut être utilisé pour étudier activation des cellules B et la différenciation ainsi que d&#39;étudier leur potentiel de fonctionner comme APC in vitro et in vivo. Par ailleurs, ils représentent un outil prometteur pour l&#39;établissement de la vaccination thérapeutique ou préventive contre les tumeurs et aideront à répondre aux questions concernant la sécurité et l&#39;immunogénicité de cette approche<sup&gt; 12</sup&gt;.

Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure d&#39;activation de CD40-et à l&#39;expansion des cellules B murines à partir de splénocytes de souris C57BL / 6, qui peut être utilisé comme un modèle de cellule présentatrice d&#39;antigène (APC) pour étudier l&#39;induction de l&#39;immunité.

Modèle murin de CD40-activation des cellules B

Les recherches sur les lymphocytes B ont montré que l'activation de CD40 améliore leur capacité de présentation de l'antigène. Lorsqu'ils sont stimulés avec l'interleukine-4 et le ligand de CD40...

Bonjour, je m'appelle Tanya Wig et je suis étudiante en doctorat travaillant au laboratoire d'immunologie tumorale et d'immunologie de la transplantation au centre hospitalier universitaire de Cologne. Mes recherches portent principalement sur les cellules B humaines activées par le CD40 et leur capacité à induire des réponses immunitaires in vivo. Initialement, les cellules B humaines exprimant le CD40 ont été produites comme alternative aux cellules dendritiques en tant que cellules présentatrices d'antigènes.Ces cellules sont destinées à être utilisées à des fins d'immunothérapie. Dans un contexte clinique, les cellules B CD40 sont générées sous signalisation CD40 et stimulation par l'IL-4. Selon ce système, elles peuvent être amplifiées pendant plusieurs semaines. Après avoir optimisé la génération de cellules B CD40 humaines à partir de PBMC dans notre laboratoire, nous avons transféré ce principe avec succès aux souris, et c'est ce que je souhaite vous montrer aujourd'hui.À partir de la rate, nous générons des cellules B activées par le CD40 murin en 14 jours de culture cellulaire. Les principales étapes consistent d'abord en la préparation des cellules nourricières : nous utilisons pour cela une lignée cellulaire Heer transfectée avec le ligand murin du CD40, qui est adhérente, irradiée à 78 gray et mise en culture dans des plaques à six puits. Ensuite, nous démarrons la culture des cellules B murines CD40 en utilisant des splénocytes purifiés fraîchement obtenus de souris C57BL/6, qui sont traités par l'interleukine-4 murine, le macabéthanol et la ciclosporine A. Ces cellules sont ensuite transférées sur les cellules nourricières irradiées dans des plaques à six puits.Cette procédure est répétée tous les trois à quatre jours jusqu'au jour 14 de la culture cellulaire. Pour obtenir des cellules B marines activées par CD 40 hautement pures, nous commençons la génération de cellules B marines activées par CD 40 en utilisant des splénocytes fraîchement purifiés de souris LXi thromb SP. Tout d'abord, nous lavons les splénocytes en resuspendant les cellules dans 50 millilitres de milieu de lavage pour cellules B marines CD 40.Ensuite, centrifuger les cellules pendant sept minutes à 1300 tr/min correspondant à 260,5 g pour la détermination du nombre de cellules. Resuspendre soigneusement les cellules dans 10 millilitres de milieu de lavage marin CD 40 B, puis mélanger les cellules par vortexage. Déterminer ensuite le nombre de cellules.Faire centrifuger la quantité nécessaire de cytes pendant sept minutes à 1300 tr/min, ce qui correspond à 260 5G, en utilisant une plaque à six puits. Vous avez besoin de cinq fois 10 à la puissance six cellules par puits, soit 30 fois 10 à la puissance six cellules par plaque. Resuspendre la quantité requise à 1,25 fois 10 puissance six cellules par millilitre dans un milieu de culture marin CD 40 B.Ensuite, complétez fraîchement la suspension cellulaire avec l'IL marine quatre à une concentration de une unité par millilitre pour la stimulation, la cyclosporine A à une concentration de 0,63 microgramme par millilitre pour inhiber la prolifération des cellules T, et 100 micromolaire de Beamer CAPTA éthanol. La suspension cellulaire est désormais prête à être stimulée avec des cellules feer. Nous utilisons des cellules healer transfectées avec le ligand CD 40 marin pour stimuler la survie cellulaire, la différenciation et la prolifération, car la lignée cellulaire heer peut survivre en culture pendant plusieurs mois.La perte de l'expression du ligand CD40 marin doit être exclue régulièrement par fox. La lignée cellulaire adhérente de soigneur transfectée pour le ligand CD40 est cultivée à 37 degrés avec 5 % CO2 dans un milieu de sélection enrichi en facteur de croissance B à une concentration de 0,2 milligramme par millilitre. Pour la sélection, cette lignée cellulaire épithéliale adhérente ne doit jamais devenir complètement confluente et doit être divisée deux fois par semaine afin de séparer les cellules adhérentes.Aspirez le milieu de lavage une fois avec 10 millilitres de PBS. Faites tourner doucement et ajoutez quatre millilitres de trypsine-EDTA dans un flacon de 75 centimètres carrés. Incubez le flacon de cinq à 10 minutes à 37 degrés dans l'incubateur.Retirez à nouveau le flacon. Tapez doucement pour détacher les cellules du plastique. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu biotype, faites tourner délicatement et transférez les cellules dans un tube de 50 millilitres.Faire centrifuger les cellules nourricières pendant sept minutes à 1300 tr/min correspondant à 260 5G. Resuspendre soigneusement les cellules en culot dans 10 millilitres de milieu de type sauvage afin de déterminer le nombre de cellules pour une sous-culture. Répartir 2,5 fois 10 à la puissance 6 cellules dans 10 millilitres de milieu de sélection et les transférer dans un flacon de 75 centimètres carrés. Incuber les cellules nourricières à 37 degrés dans 5 % de CO2 pour la stimulation CD40. Prendre le reste des cellules nourricières et les irradier de façon létale avec 78 Gy afin d'arrêter leur prolifération.Effectuez une dilution des cellules nourricières dans un milieu de type sauvage à une densité cellulaire de 0,2 × 10⁶ cellules par litre et mettez deux millilitres par puits dans une plaque à six puits. Laissez les cellules redevenir adhérentes avant de les utiliser comme cellules stimulatrices, en les incubant pendant 24 heures à 37 °C et 5 % CO₂, pour la stimulation des cytes avec un ligand proche du CD40. Vérifiez au microscope si les cellules nourricières ensemencées la veille sont adhérentes.Si les cellules nourricières sont adhérentes, retirez soigneusement le surnageant de chaque puits, puis transférez délicatement quatre millilitres de la suspension cellulaire SPOC, ajustée peu avant à 1,25 × 10⁶ cellules par millilitre, dans chaque puits pour la stimulation, et incubez la plaque à 37 °C et 5 % CO₂. Au jour quatre, sous-cultivez à nouveau les cellules B CD40 murines pour le premier sous-culture des cellules B CD40 activées au jour quatre, puis effectuez des sous-cultures suivantes toutes les trois à quatre jours. Récupérez délicatement les cellules en amas à partir de la plaque à six puits en les resuspendant à l’aide d’une pipette de 10 millilitres. Rassemblez les cellules B CD40 murines dans un tube de 50 millilitres et centrifugez les cellules pendant sept minutes à 1300 tr/min (correspondant à 260 × g). Remplacez complètement le milieu par du milieu de lavage pour cellules B CD40 murines.Et pour déterminer le nombre de cellules des lymphocytes B marins CD40, nous suspendons les lymphocytes B marins CD40 à une densité cellulaire de 0,75 × 10⁶ cellules par millilitre dans un milieu de culture spécifique pour les lymphocytes B marins CD40. Ensuite, nous complétons à nouveau la suspension cellulaire avec de l'IL-4 marin fraîchement ajouté à une concentration de 1 unité par millilitre, de la ciclosporine A à une concentration de 0,63 µg/mL et du beam up à l'éthanol à 100 µM. Bien entendu, les cellules nourricières irradiées doivent à nouveau être vérifiées quant à leur adhérence au microscope juste avant utilisation.Si les cellules nourricières sont adhérentes, retirez soigneusement le surnageant de chacune. Transférez ensuite la suspension de cellules B marines CD40 préparée peu de temps auparavant dans chaque puits pour stimulation. Le sous-culture est répétée de manière identique toutes les trois à quatre jours, deux fois par semaine, afin d'obtenir des cellules B marines CD40 activées hautement pures au jour 14 de la culture.À ce stade, les lymphocytes B CD40 marins expriment des molécules co-stimulatrices telles que CD80, CD86 et les molécules CMH de classe I et II, ce qui peut être vérifié par Fox lors de la génération. Les cellules que nous avons produites peuvent être utilisées pour des recherches sur l'activation, la différenciation et la fonction des lymphocytes B, par exemple afin d'étudier leur potentiel dans des applications immunothérapeutiques.

murine-model-of-cd40-activation-of-b-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Génération de l&#39;homme CD40-B activés cellules

Dans cette vidéo, nous démontrons l’activation des macrophages dérivés de la moelle osseuse en réponse au lipopolysaccharide bactérien et à l’immunoglobuline intraveineuse.

Activation de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris en réponse à des anticorps

Ici, nous présentons un protocole pour induire une inflammation colique chez la souris par transfert adoptif de lymphocytes Tsyngéniques à haute teneur en CD4+CD45RB dans des receveurs déficients en lymphocytes T et B. Les caractéristiques cliniques et histopathologiques imitent les maladies inflammatoires de l’intestin humain. Cette méthode permet d’étudier l’initiation de l’inflammation colique et la progression de la maladie.

Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Haute</sup&gt; T cellules dans des souris immunodéficientes

Le transfert de lymphocytes bm12 chez un receveur C57BL/6 est un modèle établi de lupus érythémateux disséminé. Nous décrivons ici comment initier une maladie à l’aide de ce modèle et comment caractériser les cellules auxiliaires folliculaires T, les cellules B du centre germinatif et les plasmocytes par cytométrie en flux.

Le bm12 inductible modèle du lupus érythémateux disséminé (SLE) dans C57BL / 6

Les lymphocytes sont les principaux acteurs des réponses immunitaires adaptatives. Ici, nous présentons un protocole de purification des lymphocytes pour déterminer les fonctions physiologiques des molécules souhaitées dans l’activation des lymphocytes in vitro et in vivo. Les procédures expérimentales décrites conviennent pour comparer les capacités fonctionnelles entre les lymphocytes témoins et les lymphocytes génétiquement modifiés.

Isolement et activation de murins Lymphocytes

Macrophages dérivés de monocytes DC (RCSCND) peut détecter de petites quantités de molécules associées à risque et sont donc facilement apprêté. Nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement des RCSCND de sang et de tumeurs et de leur mise en route avec les complexes immuns tout en soulignant des précautions qui doivent être menées afin d’éviter leur activation prématurée.

Protocole d’isolement de cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes de souris et leur Activation ultérieure In Vitro avec tumeur Complexes immuns

Nous présentons ici un protocole pour le dosage in vivo de l’activation des lymphocytes (cellules T) T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation Th1 induite par la moelle osseuse de GM-CSF (BM)-dérivé des cellules dendritiques (CD). En outre, ce protocole décrit BM et T-cellule d’isolement, la génération de DC et DC et les cellules T transfert adoptif.

Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse

Le protocole détaille un modèle in vitro de carcinome murine de l'allongement défectueux non génétique de transcription. Ici, l'inhibition chronique de CDK9 est employée pour réprimer l'allongement productif de l'ARN Pol II le long des gènes pro-inflammatoires de réponse pour imiter et étudier le phénomène cliniquement surdes tecertainement, présent dans environ 20% de tous les types de cancer.

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TE definitely ) in Cancers A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdefinitely) in Cancers

Ici, nous décrivons une méthode pour la surexpression rétrovirale et le transfert adoptif des cellules murines B-1a pour examiner in vivo la migration et la localisation de cellules de B-1a. Ce protocole peut être étendu pour divers essais fonctionnels en aval, y compris la quantification de la localisation de cellules B-1a du donneur ou l’analyse des facteurs sécrétés dérivés de cellules de donneurs après le transfert d’adoption.

Surexpression rétrovirale de CXCR4 sur les cellules murine B-1a et transfert adoptif pour la migration ciblée de cellules B-1a à la moelle osseuse et à la production d’IgM

Nous décrivons ici une analyse simple de l’hétérogénéité du compartiment des cellules B immunitaires murines dans le péritoine, la rate et les tissus de la moelle osseuse par cytométrie en flux. Le protocole peut être adapté et étendu à d’autres tissus de souris.

Caractérisation cytométrique en flux du développement des lymphocytes B murins

Découvrez l'activation et l'expansion des cellules B murines par CD40 à partir de splénocytes de souris C57BL/6. Cette méthode permet d'étudier l'induction des réponses immunitaires et les applications immunothérapeutiques.

Modèle murin de CD40-activation des cellules B

Explorer plus de vidéos