Name: Préparation des Courges drosophile chromosomes polytènes pour marquage de lanticorps (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Apprenez la technique de squash pour préparer les chromosomes polytènes de Drosophila melanogaster en vue d'un marquage par anticorps. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique et la structure chromatinienne.

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Nous remercions Mme V. Lephart pour l&#39;entretien des stocks de volée Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé de subvention (GM62916) et la National Science Foundation subvention (MCB0817107).

Le protocole suivant pour la préparation des chromosomes polytènes de squash est adaptée de la procédure décrite dans Johansen et al. (2009). 1. Culture de larves de drosophile troisième stade Afin d'obtenir optimale chromosomes polytènes de haute qualité des préparations de squash, des conditions de culture sont essentiels fréquentés (c'est à dire, placer environ 20 ponte des mouches femelles dans une norme de 4 bouteille volée "et changer pour une nouvelle bouteille chaque jour). Sélectionnez la plus grosse des individus de la première récolte de l'escalade troisième stade larvaire pendant qu'ils sont encore nomades, mais juste avant la nymphose. Nous avons régulièrement la culture à 21 ° C mais 18 ° C donnera plus gros chromosomes qui peuvent être plus adaptés à certaines fins, comme par exemple lorsque la bande / interbandes régions ont besoin d'être visualisés à haute résolution. 2. Matériaux de squash polytènes <ul><li> Pinces à dissection Drummond (2) </li><li> Boîtes de Pétri (60 x 15 mm) </li><li> Lames de microscope givré (n ° 12-544-3 Fisher) (poly-lysine) </li><li> 22 x 22 mm glisse n ° couvrent 15 (Fisher n ° 12-520B) (enduits de Sigmacote; Sigma # SL2) </li><li> 22 x 40 mm glisse n ° couvrent 15 (Fisher n ° 12-530B) </li><li> Kim-lingettes </li><li> Microscope à contraste de phase avec l'objectif 20X </li><li> Petite Dewar (par exemple, fiole à vide ou un thermos bouteille) </li><li> Pince longue </li><li> Lames de rasoir </li><li> Coplin Jarre </li><li> Caoutchouc-Maid ou le plateau de Tupperware (ou équivalent Bac plombable) </li><li> Parafilm (coupé en carrés 22 mm) </li><li> 175 g de poids </li></ul> 3. Fixatifs et solutions <ol><li> Stocks de formaldéhyde 5X. Préparer une nouvelle solution de 0,74 g. paraformaldéhyde dans 4,0 ml de dH 2 O et avec 28 l de KOH 1N. Chaude à 65 ° C pour dissoudre le paraformaldéhyde et stocker ensuite sur la glace. </li><li> Fixateur 1. Préparer une nouvelle solution de 0,5 ml PBS 10X, 50 pl Triton X-100, 3,45 ml dH 2 O et 1,0 ml d'un stock de formaldéhyde 5X. Chaud pour disperser le Triton X-100 et l'utilisation en 1 heure. </li><li> Fixateur 2. Préparer une nouvelle solution de 1,5 ml dH 2 O, 2,5 ml d'acide acétique glacial et 1,0 ml d'un stock de formaldéhyde 5X et d'utiliser moins de 1 heure. </li><li> Solution d'acide Lactoacetic. Préparer une solution de 1 ml d'acide lactique, 2 ml dH 2 O, et 3 ml d'acide acétique. </li></ol> 4. Préparation polytènes de squash chromosome: <ol><li> Rincer à l'eau et les larves de transfert à PBS dans une boîte de culture tissulaire pour la dissection. </li><li> Saisir l'extrémité de la bouche des crochets avec une paire de pinces, tenir le corps environ 2 / 3 du chemin vers le bas avec l'autre paire, et tirez sur la bouche des crochets de sorte les glandes salivaires sont exposés. Séparer les glandes salivaires du cerveau et des yeux antennaire disques, et de disséquer le cadavre de graisse et les tissus associés par les glandes. </li><li> Ajouter 200 microlitres de fixateur 1 dans le premier puits d'une lame de deux dépression bien et 200-300 microlitres de 2 fixatif pour bien deux. Transfert une paire de glandes salivaires à la fois pour une même fixateur dans un et incuber pendant le temps requis pour l'épitope cible, habituellement environ 1-2 minutes. (Remarque: certains épitopes, comme pour la plupart des modifications des histones, peuvent nécessiter 5 minutes ou plus de fixation.) </li><li> Pince en utilisant le transfert des glandes salivaires à 2 fixateur dans le puits 2 et incuber pendant deux minutes. </li><li> Transfert des glandes à 10-30 ul de solution d'acide Lactoacetic sur une lamelle propre Sigmacoted. Abaissez délicatement une lame de microscope polylysine enduit sur ​​la lamelle et, sans appliquer une pression verticale, ramasser la lamelle afin glandes sont entre la lame et la lamelle. Immédiatement faciliter la lyse cellulaire et chromosomique propagation en prenant soin saisir la lamelle avec une pince sur un bord et doucement se déplaçant légèrement en arrière, en essayant de minimiser toute pression verticale sur le tissu. Sinon, utiliser le côté gomme d'un crayon ou même un doigt pour déplacer doucement la lamelle en arrière. Notez que tout retard dans le déplacement de la lamelle en arrière est susceptible de diminuer la propagation des armes chromosomiques comme ils auront tendance à devenir plus rigides à l'exposition à la solution d'acide Lactoacetic. Opacité de la solution est souvent une bonne indication de la séparation des cellules. Tapotant doucement la lamelle oblique (pour éviter une pression verticale) avec le côté gomme d'un crayon à quelques reprises peut aussi aider à propager chromosomiques. </li><li> Examine immédiatement le tissu sous un microscope à contraste de phase avec un objectif 20 ou 40x pour déterminer si les chromosomes sont bien réparties. </li><li> Lorsque la propagation chromosomique est suffisant, mettre la diapositive avec le côté lamelle sur une pile de nettoyage Kim-lingettes. Placez une seconde Kim-tampon sur le dessus et aplatir les chromosomes en plaçant votre pouce sur l'endroit où la lamelle est positionné et en appuyant fermement, en évitant tout mouvement horizontal de la lamelle qui cisaillementles chromosomes. </li><li> Examinez la lame à nouveau sous le microscope afin de déterminer si la préparation est adaptée pour l'usage prévu. Si les chromosomes ont déménagé de façon significative sur les écraser, utiliser moins de volume de solution d'acide Lactoacetic dans vos préparations ultérieures. Répétez les étapes 4.1 à 4.8 jusqu'à ce qu'un nombre suffisant de diapositives appropriées ont été obtenues. Placez 175 g de poids sur la lamelle de la glisse. </li><li> Remplir un petit Dewar (par exemple, une bouteille thermos) à l'azote liquide. En utilisant une pince à long, tremper glisser dans l'azote liquide 2 jusqu'à l'arrêt ébullition, retirez diapositives et utiliser immédiatement le bord d'une lame de rasoir propre à un coin flip off à la lamelle. Si diapositive sera utilisée immédiatement, placer dans un bocal de Coplin avec du PBS à 4 ° C. Sinon recueillir les glisser dans une jarre de Coplin remplie d'éthanol à 95%. Examiner la lamelle une fois le gel est sublimé pour confirmer que le tissu adhère à la diapositive et ne pas rester avec la lamelle. Répéter avec le reste de la glisse jusqu'à ce que toutes les diapositives sont stockées soit dans du PBS (pour une utilisation au sein de plusieurs heures) ou de l'éthanol (pour le stockage à long terme). </li></ol> Les résultats représentatifs La première étape critique pour l'obtention de haute qualité de la préparation de squash polytènes est de faire croître les larves grasses avec des noyaux des glandes salivaires grands. La seconde est une bonne technique à la procédure épandage, qui peut prendre un peu de pratique. Une astuce pour réussir la propagation améliorée est de trouver le volume minimal de solution d'acide lactoacetic pendant l'étape de l'écrasement. Cela favorisera la propagation suffisante de chromosomes sans générer des forces excessives streaming qui peuvent se laver les bras du chromosome loin. Il est également intéressant de noter que tout retard dans le déplacement de la lamelle en arrière permettra de réduire la propagation des armes chromosomiques, ils deviennent plus rigides lorsqu'ils sont exposés à la solution d'acide Lactoacetic. Si tout va bien, il devrait y avoir de nombreux bien répartis chromosomes polytènes. La figure 1 montre un exemple d'une telle préparation, double marqué avec un marqueur pour les régions interbandes en vert et avec un colorant qui colore les régions bagué en bleu. Si l'insuffisance d'épandage est obtenue, les chromosomes se ressemblent petites boules, comme le montre la figure 2. D'autre part, si une trop grande propagation a eu lieu, le chomosomes sera trop mince et étendu ou, dans certains cas, fragmentée en petits morceaux comme le montre la figure 3. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Préparation de squash polytènes doubles étiquetés avec l'anticorps de la JIL-1 histone kinase H3S10 (en rouge) et Hoechst (bleu). <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Courges polytènes avec la propagation insuffisante. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Courges polytènes avec trop de propagation.

<ol><li>Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-mediated+transcription+at+active+loci+does+not+require+histone+H3S10+phosphorylation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila.</a> Development. 135, 2917-2925 (2008).</li>
<li>DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+GFP-fusion+proteins+on+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dros.+Inf.+Serv%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes.</a> Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).</li>
<li>Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+transcription+and+epigenetic+chromatin+modification+in+Drosophila+polytene+chromosome+squash+preparations+using+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies.</a> Methods. 48, 387-397 (2009).</li>
</ol>

L&#39;inclusion d&#39;acides acétique et lactique dans les protocoles conventionnels de fixation facilite la résolution de squash et deux interbandes bras chromosomique propagation mais malheureusement, certains épitopes ne survivent pas à ce traitement. Un exemple d&#39;un tel épitope est H3S10ph (Cai et al., 2008). Depuis traitement à l&#39;acide a aussi l&#39;inconvénient qu&#39;il désaltère la fluorescence intrinsèque des protéines étiquetées GFP, DiMario et al. (2006) a récemment développé une bas...

préparation des courges drosophile chromosomes polytènes pour marquage de l&#39;anticorps

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophile a longtemps été un modèle de système de prédilection pour étudier la relation entre la structure de la chromatine et la régulation des gènes en raison des avantages cytologique fournie par le géant de chromosomes polytènes salivaires des glandes du stade larvaire tiers. Dans ce tissu les chromosomes subissent de nombreux cycles de réplication, en l&#39;absence de la division cellulaire donnant naissance à environ 1000 exemplaires. L&#39;ADN reste alignée après chaque cycle réplicatif résultant dans des chromosomes fortement agrandie qui fournissent une occasion unique de mettre en corrélation la morphologie chromatine avec la localisation des protéines spécifiques. En conséquence, il a été un haut niveau d&#39;intérêt dans la définition des modifications épigénétiques présents à des gènes différents et à différentes étapes du processus de transcription. Un outil important pour de telles études est l&#39;étiquetage des chromosomes polytènes avec des anticorps à l&#39;enzyme, facteur de transcription, ou la modification des histones d&#39;intérêt. Ce protocole vidéo illustre la technique de squash utilisés dans le laboratoire de Johansen pour préparer la drosophile chromosomes polytènes pour l&#39;étiquetage des anticorps.

Ce protocole vidéo illustre la technique de squash utilisés dans le laboratoire de Johansen pour préparer<em&gt; Drosophile</em&gt; Chromosomes polytènes pour l&#39;étiquetage des anticorps.

Préparation des Courges drosophile chromosomes polytènes pour marquage de l&#39;anticorps

La drosophile est depuis longtemps un système modèle privilégié pour étudier la relation entre la structure de la chromatine et la régulation génique en raison de la cytologie...

Cette procédure commence par la culture de larves de drosophiles au troisième stade larvaire en jeûne dans une bouteille à mouches. À l’aide de deux paires de pinces, les glandes salivaires sont disséquées à partir des larves. Les glandes salivaires sont ensuite fixées avec succès dans deux fixateurs différents sur une lame porte-objectif à deux alvéoles.Enfin, les glandes sont écrasées dans une solution d'acide lacto-acétique entre une lamelle et une lame de microscope. Bonjour, je suis le Dr. Kristen Johansen du Département de biochimie, de biophysique et de biologie moléculaire de l'Université d'État de l'Iowa. Bonjour, je suis l'étudiante diplômée assistante d'enseignement dans le laboratoire de Johansen.Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de réaliser des préparations de chromosomes polytènes de drosophile, adaptées à l'étiquetage par anticorps. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les modifications épigénétiques des histones ainsi que leur relation avec la structure de la chromatine et l'expression des gènes. Commençons donc.Pour obtenir des chromosomes polytènes de qualité optimale destinés à des préparations au squasch de haute qualité, des conditions de culture peu denses sont essentielles. Placez environ 20 mouches femelles pondeuses dans un flacon standard de quatre pouces et transférez-les dans un nouveau flacon chaque jour. Une culture à 21 degrés Celsius convient pour la plupart des applications, mais une incubation à 18 degrés Celsius produira des chromosomes plus épais, qui peuvent être plus adaptés à certaines expériences, par exemple lorsque des régions interbandes interdites doivent être visualisées avec une résolution élevée.Sélectionnez les individus les plus gras parmi la première récolte de larves de troisième stade grimpantes. Tandis qu'elles errent encore, mais juste avant la nymphose, les larves sont facilement visibles sur la paroi du flacon, au-dessus du milieu nutritif. Utilisez une pince pour placer les larves sur une boîte de culture tissulaire.Pour chaque cycle de dissociation, rincez deux à trois larves ensemble à l'eau avant de les transférer dans une boîte de Pétri propre contenant du PBS pour la dissection. Le PBS doit recouvrir les larves, mais le temps n'est pas critique. Étant donné que les larves peuvent survivre pendant des heures dans ces conditions, placez la boîte contenant les larves dans le PBS sur la platine d'un microscope stéréoscopique, avec une paire de pinces.Saisir la pointe des crochets buccaux tout en maintenant le corps. À environ deux tiers de la distance vers le bas, utiliser une deuxième paire de pinces pour tirer sur les crochets buccaux afin d'exposer les glandes salivaires. Séparer les glandes salivaires du cerveau, des yeux et des disques ténaux, puis disséquer le corps adipeux et tous les autres tissus associés.Ajoutez 200 microlitres de fixateur un dans le premier puits d'une lame à deux puits et de 200 à 300 microlitres de fixateur. Deux dans le puits deux. Transférez une paire de glandes salivaires à la fois dans le fixateur un du puits un et incubez pendant la durée requise pour l'épitope cible, généralement environ une à deux minutes, à l'aide de pinces. Transférez les glandes salivaires pour les fixer deux par deux, puis incubez-les pendant deux minutes. À l’aide de pinces, transférez les glandes sur une lame couvre-objet propre, recouverte de sigma, contenant 10 à 30 microlitres de solution d’acide lacto-acétique fraîchement préparée. Abaissez délicatement une lame de microscope recouverte de polylysine sur la lame couvre-objet.Soulevez délicatement la lame en exploitant l'adhérence du liquide au verre pour saisir la lamelle sans appliquer de pression verticale. Pour préparer l'étalement immédiat des chromosomes, saisissez soigneusement le bord de la lamelle avec une pince et déplacez-la doucement légèrement d'avant en arrière. Là encore, en minimisant la pression verticale sur le tissu, le léger mouvement de va-et-vient de la lamelle est essentiel pour séparer correctement les cellules individuelles de la glande salivaire.Tapoter doucement la lame couvre-objet obliquement avec la gomme d'un crayon peut également aider à répartir la solution ; un trouble de la solution est souvent un bon indicateur de la séparation des cellules. Examiner rapidement le tissu au microscope à contraste de phase afin de vérifier que les chromosomes sont bien étalés, ce qui se manifeste par des bras chromosomiques clairement séparés et étendus. Si les chromosomes n'apparaissent pas bien étalés lors du premier examen.Il est possible de répéter les légers tapotements sur la lame couvre-objet jusqu'à l'obtention d'une dispersion suffisante. Placez la lame, côté couvre-objet vers le bas, sur une pile de lingettes Kim propres. Déposez une lingette propre par-dessus la préparation.Placez un pouce sur l'emplacement du couvre-objet et appuyez fermement directement vers le bas. Évitez tout mouvement horizontal, qui pourrait cisailler les chromosomes. Réexaminez la lame au microscope pour déterminer sa convenance pour l'expérience en cours.Répétez la dissection et la préparation des chromosomes en écrasé pour obtenir un nombre suffisant de lames. Placez un poids de 175 grammes sur le couvre-objet des lames à l’aide de pinces longues. Plongez une lame préparée dans un petit récipient d’azote liquide et maintenez-la jusqu’à ce que l’ébullition cesse.Retirez la lame et utilisez immédiatement le bord d’un scalpel propre sous le coin de la lamelle pour la faire basculer. Placez la lame dans un bocal Coplin rempli de PBS froid pour une utilisation immédiate, ou rempli d’éthanol à 95 % pour une conservation plus longue. Une fois que la couche de givre s’est sublimée, examinez la lamelle afin de confirmer que le tissu est resté sur la lame.La première étape cruciale pour obtenir une préparation de squis de NEI de haute qualité consiste à élever des larves bien grasses possédant de gros noyaux dans les glandes salivaires. La seconde étape réside dans une bonne technique lors de la procédure d'étalement, qui peut nécessiter un certain entraînement. Un conseil pour améliorer le succès de l'étalement consiste à déterminer le volume minimal de solution d'acide lacto-acétique à utiliser lors de l'étape de compression.Cela favorisera une dispersion suffisante des chromosomes sans générer de forces de courant excessives qui pourraient emporter les bras chromosomiques. Il est également important de noter que tout retard dans le déplacement du couvre-objet d'avant en arrière réduira l'étalement des bras chromosomiques, car ceux-ci deviennent plus rigides lorsqu'ils sont exposés à la solution d'acide lacto-acétique. Si tout se déroule correctement sur chaque lame, on devrait observer de nombreux chromosomes polytènes bien étalés.Ici, nous présentons un exemple d'une telle préparation doublement marquée avec un marqueur des régions interbandes en rouge et un colorant qui colore les régions bandées en bleu. Si l'étalement obtenu est insuffisant, les chromosomes auront l'aspect de petites boules comme illustré ici. En revanche, si l'étalement est excessif, les chromosomes seront trop minces et étirés, ou dans certains cas fragmentés en petits morceaux comme montré ici.Nous venons de vous montrer comment réaliser des préparations par écrasement de chromosomes polytènes de drosophile. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se souvenir de commencer par la larve grasse. Voilà tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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