Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Ce vidéo montre une méthode pour disséquer et cultiver des neurones moteurs commissuraux à partir de la moelle épinière embryonnaire. La procédure commence par la collecte d'embryons de rat E13, puis par la dissection des moelles épinières. Pendant la dissection, les moelles épinières sont ouvertes le long de la plaque du toit et préparées en configuration de livre ouvert.

Des bandes de tissu dorsal sont disséquées et recueillies dans un tube. Le tissu dorsal est dissocié en une suspension monocellulaire par la trypsine et une disruption mécanique. Les neurones commissuraux sont ensuite cultivés sur des lamelles en verre ou des boîtes de culture traitées au polylysine.

Ils peuvent ensuite être utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance et du guidage des axones. Salut, je suis Sebastian du Laboratoire de biologie moléculaire du développement neural à l'Institut de recherche clinique de Montréal. Salut, je suis Steve Moen, également du Laboratoire de biologie moléculaire du développement neural.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de disséquer et de cultiver des neurones commissuraux à partir de la moelle épinière embryonnaire. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de l'orientation des axones. Commençons donc.

Aujourd'hui, les moelles épinières seront disséquées à partir d'embryons de rat E 13 fraîchement prélevés, placés dans une boîte contenant du milieu L 15 pendant toute la durée de la dissection. Il est important de maintenir les embryons et les solutions sur de la glace. N'oubliez pas que, lors de toutes les étapes de dissection, il est essentiel de ne pas étirer la moelle épinière avec la pince en nickel, car cela pourrait entraver l'isolement d'une moelle épinière parfaitement intacte.

Sous un microscope stéréoscopique, séparez l'embryon de tous les tissus extra-embryonnaires et des membranes embryonnaires. Ensuite, placez un embryon dans la boîte de dissection. Utilisez des ciseaux microchirurgicaux pour enlever la tête et les parties postérieures aux angles indiqués ici.

Cela créera une surface plane qui facilitera le positionnement de l'embryon pour un accès aisé à la moelle épinière. Positionnez l'embryon avec le côté ventral vers le bas et l'extrémité antérieure orientée vers l'extérieur. Utilisez une pince pour fixer fermement l'embryon sur un côté.

Ne pincez pas ou n'ouvrez pas les forceps, sinon le tissu se déchirera avec la deuxième paire de forceps. Saisissez la peau sur le côté de la moelle épinière. Ajustez les extrémités des forceps de maintien.

Détacher la peau recouvrant le dos de l'embryon afin d'exposer la moelle épinière entourée de ses méninges, permettant ainsi de séparer partiellement le tissu situé à droite de la moelle épinière. Utiliser des pinces fermées pour piquer le tissu à partir du niveau des pinces de maintien. S'approcher au maximum de la moelle épinière sans la toucher.

Répétez plusieurs fois le long de la moelle épinière. Cela permettra d'attacher quelques ganglions de la racine dorsale et de perturber les organes ventraux. Laissez un peu de tissu attaché aux extrémités antérieure et postérieure en partant de l'extrémité antérieure.

Utilisez une aiguille en tungstène en forme de crochet pour couper les méninges et ouvrir la moelle épinière le long de la plaque du toit. Faites pivoter l'embryon de 180 degrés et dissociez le tissu du côté restant. En utilisant la même méthode.

Ensuite, détacher complètement le tissu situé sur le côté gauche de la moelle épinière, le côté qui avait été initialement perturbé à droite. Placer la moelle épinière sur le côté et utiliser une pince pour retirer la majeure partie du tissu mésenchymateux restant ainsi que les ganglions de la racine dorsale. Utiliser la pince pour soulever une petite languette de méninges. À ce stade, les méninges et la moelle épinière forment deux feuillets de tissu superposés.

Utilisez la pince pour fixer la partie la plus importante de la moelle épinière à l'extrémité antérieure. Saisissez les deux segments séparés à l’aide de la pince et détachez les méninges. Effectuez un mouvement régulier et continu, car un décollement irrégulier peut rompre la couche des méninges et/ou la moelle épinière.

Si la couche des méninges se rompt pendant le tirage, la portion de la moelle épinière qui reste attachée aux méninges est généralement irrécupérable. Bien qu'il soit parfois possible de la récupérer. Utilisez un embout en plastique pour transférer délicatement la moelle épinière isolée dans une boîte de milieu L15 contenant 10 % de sérum de cheval inactivé par la chaleur, placée sur de la glace, avant de traiter d'autres embryons.

Pensez à changer le milieu dans la boîte de dissection par du L 15 refroidi pour maintenir l'embryon au frais et aider à préserver l'intégrité du tissu. Récupérez les moelles épinières de tous les embryons avant de passer aux dissections de la moelle épinière dorsale. Pour commencer la dissection de la moelle dorsale, placez une moelle épinière fraîchement isolée dans une boîte de Pétri contenant du L 15 avec 10 % de sérum de cheval chauffé et activé.

Retirez la partie antérieure plus large, qui comprend une portion du cervelet. Ensuite, étalez la moelle épinière à plat, comme un livre ouvert. Le tissu dorsal se situe dans les parties les plus latérales de la moelle épinière ainsi étalée, tout en fixant la moelle avec une aiguille droite en tungstène, en utilisant une aiguille en tungstène en forme de L pour découper une bande d’environ un cinquième de la largeur d’une moitié de la moelle épinière ; découper des bandes plus larges augmentera le rendement, mais réduira la pureté de la culture.

Transférez plusieurs bandes dorsales dans un tube conique de 15 millilitres contenant du milieu L 15 avec 10 % de sérum de cheval et placez le tube sur de la glace. Le reste de la procédure sera effectué près ou à l'intérieur de la hotte de culture tissulaire. Pour ces cultures, il est important de préparer les solutions et l'équipement à l'avance, généralement avant la dissection.

L'étape de transfert utilise des pipettes en verre poli au chalumeau de deux tailles, l'une ayant un diamètre égal à la moitié de la taille d'origine et l'autre légèrement plus petite. Avant de commencer, recouvrir les deux pipettes polies au chalumeau avec un milieu contenant du sérum en aspirant le milieu dans les pipettes et en laissant reposer pendant 30 secondes. Cette étape réduira le nombre de cellules qui adhèrent au verre pendant le transfert.

Commencez par vérifier que les bandes dorsales se sont déposées au fond du tube. Sous hotte à flux laminaire, retirez la majeure partie du surnageant SUP à l’aide d’une pipette simple. Rincez rapidement avec trois millilitres de HBSS froid sans magnésium ni calcium.

Laisser reposer la bande de tube neural dorsal pendant deux minutes. Ensuite, retirer l'HBSS à l'aide des pâtes. Amener le volume à 4,7 millilitres.

Avec du HBSS tiède, ajouter 0,3 millilitre de trypsine à 2,5 % pour obtenir une concentration finale de 0,15 % de Tryin et mélanger délicatement. Incuber dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant sept minutes, en effectuant un mélange doux une fois à mi-incubation. Une fois l'incubation terminée, ajouter de l'ADN pour une concentration finale de 150 unités par millilitre et du sulfate de magnésium pour une concentration finale de 0,15 %, puis mélanger brièvement.

Les sections du tube neural dorsal doivent maintenant être fragmentées. Centrifuger les fragments de tissu à 200 G pendant quatre minutes. Retirer le surnageant SUP à l’aide d’une pipette Pasteur en laissant environ 50 à 100 microlitres de liquide au fond du tube.

Frapper doucement le tube pour desserrer le culot. Ensuite, laver les cellules en ajoutant cinq millilitres de HBSS tiède. Laisser les cellules se déposer à température ambiante pendant deux minutes.

Faire centrifuger et laver à nouveau les cellules. Cette fois, les resuspendre dans deux millilitres de HBSS chaud. Utiliser une pipette polie au chalumeau de demi-diamètre pour triturer les cellules en aspirant et en rejetant lentement le liquide quatre à six fois, en dirigeant le liquide contre la paroi du tube afin de briser les agrégats plus gros et de réduire la mort cellulaire.

Évitez de faire des bulles et ne sur-enzymez pas. Utilisez la plus petite pipette en verre polie au chalumeau pour dissocier davantage les cellules en pipetant lentement de haut en bas trois à quatre fois de la même manière. Il n'est pas nécessaire de dissocier tous les agrégats cellulaires, car les agrégats ont tendance à se former à partir de cellules mortes présentes dans les débris.

Laisser reposer les fragments de tissu pendant une minute. Ensuite, retirer 20 microlitres du surnageant SUP, qui devrait contenir les cellules en suspension destinées au comptage dans un hémocytomètre ; les neurones doivent présenter une viabilité d'au moins 95 % selon le test au bleu de trypan. Placer les neurones dans le milieu de culture neurobasal à une concentration adaptée à votre application.

16 à 18 heures plus tard, changer le milieu pour un milieu de croissance basal neural afin d'éviter tout décollement. Retirer délicatement le milieu à l'aide d'une pipette, plutôt que de l'aspirer avec une pompe à vide. Voici quelques résultats représentatifs de neurones commissuraux isolés cultivés sur des lamelles en verre recouvertes de PLL : quatre heures après la mise en culture, les neurones ont adhéré à la surface ; 30 heures après la mise en culture.

La plupart des neurones possèdent des axones allongés dotés d'un cône de croissance visible. Ces neurones peuvent être facilement utilisés dans des expériences d'immunofluorescence. Dans cet exemple, les microtubules sont marqués en vert, l'actine en rouge et les NA en bleu.

Nous venons de vous montrer comment disséquer et cultiver des neurones commissuraux à partir de moelles embryonnaires. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que la pureté des neurones commissuraux dépend de l'épaisseur de la bande dorsale prélevée lors de la dissection. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.