Name: Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Découvrez la dissection et la culture de neurones commissuraux de la moelle épinière dorsale d'embryons de rat E13. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance et du guidage axonal.

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Ce travail a été soutenu par des subventions des Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC), le chercheur Peter Lougheed Medical Research Foundation, le Programme de McGill en neuroingénierie, le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) et la Fondation canadienne pour l&#39;innovation (FCI ). Sébastien D. Langlois a été soutenue par de bourse de formation à la maîtrise de la Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) et par une Frederick Banting et Charles Prix du Meilleur études supérieures du Canada Bourses de maîtrise des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Nous sommes reconnaissants à Jessica Pham MT à l&#39;aide de chiffres.

<ol><li>Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. , 113-1111 (2003).</li>
<li>Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+ipsilateral+retinal+ganglion+cell+axons+at+the+optic+chiasm+requires+the+Shh+Receptor+Boc%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc.</a> Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).</li>
<li>Helms, A. W., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitors+of+dorsal+commissural+interneurons+are+defined+by+MATH1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression.</a> Development. 125, 919-928 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boc+is+a+receptor+for+sonic+hedgehog+in+the+guidance+of+commissural+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons.</a> Nature. 444, 369-373 (2006).</li>
<li>Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+guides+axons+through+a+noncanonical%2C+Src-family-kinase-dependent+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway.</a> Neuron. 62, 349-362 (2009).</li>
</ol>

Nous avons décrit une méthode de disséquer et de la culture des neurones commissuraux de la moelle épinière de rats embryonnaires. Cette procédure a été couramment utilisée dans notre laboratoire pour préparer les neurones de manière fiable pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du guidage axonal. Pour la biologie cellulaire et des expériences d&#39;immunochimie, la dissection d&#39;une litière suffisante produit des neurones. Lorsque plusieurs cellules sont nécessaires, comme dans de nombreuses expérie...

Dissection de la moelle épinière de rats dorsale embryonnaire (voir aussi tableau I) <ul><li> E13 grossesse scène du rat </li><li> 70% d&#39;éthanol </li><li> Ciseaux chirurgicaux, Outils Fine Science </li><li> Pinces, Dumont # 5, Outils Fine Science </li><li> Boîtes de Pétri </li><li> Milieu L-15 </li><li> Microscope à dissection, Leica </li><li> Pipettes de transfert en plastique </li><li> Microciseaux, Outils Fine Science </li><li> Aiguilles de tungstène et les détenteurs de broches (un crochet en forme de l&#39;aiguille, un L-formes d&#39;aiguille, une aiguille droite), Outils Fine Science </li><li> Cheval inactivés par la chaleur du sérum (HiHS) </li><li> 15 ml tubes en plastique </li></ul> Commissurales neurone de la culture (voir aussi tableau I) <ul><li> Incubateurs de culture de tissus (37 ° C, 5% de CO 2, à l&#39;humidité contrôlée) </li><li> Allemande des lamelles en verre Desag et / ou en plastique des boîtes de culture tissulaire </li><li> Poly-L-lysine, Sigma </li><li> Stérile milliQ H 2 O </li><li> Neurobasal, Invitrogen </li><li> Inactivés par la chaleur sérum fœtal bovin (HiFBS) </li><li> L-Glutamine </li><li> B27, Invitrogen </li><li> Pénicilline / streptomycine antibiotiques </li><li> Bain-marie à 37 ° C </li><li> Stérile pipettes Pasteur </li><li> Bunsen brûleur à gaz </li><li> HBSS, Ca 2 + / Mg 2 + libre, Invitrogen </li><li> DNAse, Worthington </li><li> MgSO 4 </li><li> Centrifugeuse </li><li> Hémacytomètre </li><li> Solution de bleu trypan </li></ul>

dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Neurones commissuraux ont été largement utilisées pour étudier les mécanismes sous-jacents guidage axonal pendant le développement embryonnaire, la moelle épinière. Les corps cellulaires de ces neurones sont situés dans la moelle épinière dorsale et leurs axones suivent des trajectoires stéréotypées pendant le développement embryonnaire. Axones commissuraux initialement projet ventralement vers la plaque de sol. Après avoir traversé la ligne médiane, ces axones tourner vers l&#39;avant et le projet vers le cerveau. Chacune de ces étapes est réglementée par l&#39;action de plusieurs signaux de guidage. Cultures hautement enrichi dans les neurones commissuraux sont idéalement adaptés à de nombreuses expériences aborder les mécanismes de pathfinding axone, y compris les essais de tournage, l&#39;immunochimie et la biochimie. Ici, nous décrivons une méthode de disséquer et de la culture des neurones commissuraux de la moelle épinière de rats E13 dorsale. Tout d&#39;abord, la moelle épinière est isolé et bandes dorsales sont disséquées. Le tissu dorsale est alors dissocié en une suspension de cellules par trypsinisation et les perturbations mécaniques. Les neurones sont étalées sur des lamelles en verre poly-L-lysine ou de culture de tissus plats. Après 30 heures<em&gt; In vitro</em&gt;, La plupart des neurones ont prolongé d&#39;un axone. La pureté de la culture (Yam<em&gt; Et al.</em&gt; 2009), généralement plus de 90%, peut être évaluée par immunomarquage avec le neurone marqueurs CDC, commissurale LH2 et TAG1 (Helms et Johnson, 1998). Cette préparation neuronale est un outil utile pour<em&gt; In vitro</em&gt; Les études des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance des axones commissuraux et des conseils lors du développement de la moelle épinière.

Cette vidéo montre une méthode de disséquer et de la culture des neurones commissuraux de la moelle épinière de rats E13 dorsale. Dissocié neurones commissuraux sont utiles pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance de l&#39;axone et d&#39;orientation.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Les neurones commissuraux ont été largement utilisés pour étudier les mécanismes sous-jacents au guidage axonal lors du développement embryonnaire de la moelle épinière. Les corps cellulaires...

Ce vidéo montre une méthode pour disséquer et cultiver des neurones moteurs commissuraux à partir de la moelle épinière embryonnaire. La procédure commence par la collecte d'embryons de rat E13, puis par la dissection des moelles épinières. Pendant la dissection, les moelles épinières sont ouvertes le long de la plaque du toit et préparées en configuration de livre ouvert.Des bandes de tissu dorsal sont disséquées et recueillies dans un tube. Le tissu dorsal est dissocié en une suspension monocellulaire par la trypsine et une disruption mécanique. Les neurones commissuraux sont ensuite cultivés sur des lamelles en verre ou des boîtes de culture traitées au polylysine.Ils peuvent ensuite être utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance et du guidage des axones. Salut, je suis Sebastian du Laboratoire de biologie moléculaire du développement neural à l'Institut de recherche clinique de Montréal. Salut, je suis Steve Moen, également du Laboratoire de biologie moléculaire du développement neural.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de disséquer et de cultiver des neurones commissuraux à partir de la moelle épinière embryonnaire. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de l'orientation des axones. Commençons donc.Aujourd'hui, les moelles épinières seront disséquées à partir d'embryons de rat E 13 fraîchement prélevés, placés dans une boîte contenant du milieu L 15 pendant toute la durée de la dissection. Il est important de maintenir les embryons et les solutions sur de la glace. N'oubliez pas que, lors de toutes les étapes de dissection, il est essentiel de ne pas étirer la moelle épinière avec la pince en nickel, car cela pourrait entraver l'isolement d'une moelle épinière parfaitement intacte.Sous un microscope stéréoscopique, séparez l'embryon de tous les tissus extra-embryonnaires et des membranes embryonnaires. Ensuite, placez un embryon dans la boîte de dissection. Utilisez des ciseaux microchirurgicaux pour enlever la tête et les parties postérieures aux angles indiqués ici.Cela créera une surface plane qui facilitera le positionnement de l'embryon pour un accès aisé à la moelle épinière. Positionnez l'embryon avec le côté ventral vers le bas et l'extrémité antérieure orientée vers l'extérieur. Utilisez une pince pour fixer fermement l'embryon sur un côté.Ne pincez pas ou n'ouvrez pas les forceps, sinon le tissu se déchirera avec la deuxième paire de forceps. Saisissez la peau sur le côté de la moelle épinière. Ajustez les extrémités des forceps de maintien.Détacher la peau recouvrant le dos de l'embryon afin d'exposer la moelle épinière entourée de ses méninges, permettant ainsi de séparer partiellement le tissu situé à droite de la moelle épinière. Utiliser des pinces fermées pour piquer le tissu à partir du niveau des pinces de maintien. S'approcher au maximum de la moelle épinière sans la toucher.Répétez plusieurs fois le long de la moelle épinière. Cela permettra d'attacher quelques ganglions de la racine dorsale et de perturber les organes ventraux. Laissez un peu de tissu attaché aux extrémités antérieure et postérieure en partant de l'extrémité antérieure.Utilisez une aiguille en tungstène en forme de crochet pour couper les méninges et ouvrir la moelle épinière le long de la plaque du toit. Faites pivoter l'embryon de 180 degrés et dissociez le tissu du côté restant. En utilisant la même méthode.Ensuite, détacher complètement le tissu situé sur le côté gauche de la moelle épinière, le côté qui avait été initialement perturbé à droite. Placer la moelle épinière sur le côté et utiliser une pince pour retirer la majeure partie du tissu mésenchymateux restant ainsi que les ganglions de la racine dorsale. Utiliser la pince pour soulever une petite languette de méninges. À ce stade, les méninges et la moelle épinière forment deux feuillets de tissu superposés.Utilisez la pince pour fixer la partie la plus importante de la moelle épinière à l'extrémité antérieure. Saisissez les deux segments séparés à l’aide de la pince et détachez les méninges. Effectuez un mouvement régulier et continu, car un décollement irrégulier peut rompre la couche des méninges et/ou la moelle épinière.Si la couche des méninges se rompt pendant le tirage, la portion de la moelle épinière qui reste attachée aux méninges est généralement irrécupérable. Bien qu'il soit parfois possible de la récupérer. Utilisez un embout en plastique pour transférer délicatement la moelle épinière isolée dans une boîte de milieu L15 contenant 10 % de sérum de cheval inactivé par la chaleur, placée sur de la glace, avant de traiter d'autres embryons.Pensez à changer le milieu dans la boîte de dissection par du L 15 refroidi pour maintenir l'embryon au frais et aider à préserver l'intégrité du tissu. Récupérez les moelles épinières de tous les embryons avant de passer aux dissections de la moelle épinière dorsale. Pour commencer la dissection de la moelle dorsale, placez une moelle épinière fraîchement isolée dans une boîte de Pétri contenant du L 15 avec 10 % de sérum de cheval chauffé et activé.Retirez la partie antérieure plus large, qui comprend une portion du cervelet. Ensuite, étalez la moelle épinière à plat, comme un livre ouvert. Le tissu dorsal se situe dans les parties les plus latérales de la moelle épinière ainsi étalée, tout en fixant la moelle avec une aiguille droite en tungstène, en utilisant une aiguille en tungstène en forme de L pour découper une bande d’environ un cinquième de la largeur d’une moitié de la moelle épinière ; découper des bandes plus larges augmentera le rendement, mais réduira la pureté de la culture.Transférez plusieurs bandes dorsales dans un tube conique de 15 millilitres contenant du milieu L 15 avec 10 % de sérum de cheval et placez le tube sur de la glace. Le reste de la procédure sera effectué près ou à l'intérieur de la hotte de culture tissulaire. Pour ces cultures, il est important de préparer les solutions et l'équipement à l'avance, généralement avant la dissection.L'étape de transfert utilise des pipettes en verre poli au chalumeau de deux tailles, l'une ayant un diamètre égal à la moitié de la taille d'origine et l'autre légèrement plus petite. Avant de commencer, recouvrir les deux pipettes polies au chalumeau avec un milieu contenant du sérum en aspirant le milieu dans les pipettes et en laissant reposer pendant 30 secondes. Cette étape réduira le nombre de cellules qui adhèrent au verre pendant le transfert.Commencez par vérifier que les bandes dorsales se sont déposées au fond du tube. Sous hotte à flux laminaire, retirez la majeure partie du surnageant SUP à l’aide d’une pipette simple. Rincez rapidement avec trois millilitres de HBSS froid sans magnésium ni calcium.Laisser reposer la bande de tube neural dorsal pendant deux minutes. Ensuite, retirer l'HBSS à l'aide des pâtes. Amener le volume à 4,7 millilitres.Avec du HBSS tiède, ajouter 0,3 millilitre de trypsine à 2,5 % pour obtenir une concentration finale de 0,15 % de Tryin et mélanger délicatement. Incuber dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant sept minutes, en effectuant un mélange doux une fois à mi-incubation. Une fois l'incubation terminée, ajouter de l'ADN pour une concentration finale de 150 unités par millilitre et du sulfate de magnésium pour une concentration finale de 0,15 %, puis mélanger brièvement.Les sections du tube neural dorsal doivent maintenant être fragmentées. Centrifuger les fragments de tissu à 200 G pendant quatre minutes. Retirer le surnageant SUP à l’aide d’une pipette Pasteur en laissant environ 50 à 100 microlitres de liquide au fond du tube.Frapper doucement le tube pour desserrer le culot. Ensuite, laver les cellules en ajoutant cinq millilitres de HBSS tiède. Laisser les cellules se déposer à température ambiante pendant deux minutes.Faire centrifuger et laver à nouveau les cellules. Cette fois, les resuspendre dans deux millilitres de HBSS chaud. Utiliser une pipette polie au chalumeau de demi-diamètre pour triturer les cellules en aspirant et en rejetant lentement le liquide quatre à six fois, en dirigeant le liquide contre la paroi du tube afin de briser les agrégats plus gros et de réduire la mort cellulaire.Évitez de faire des bulles et ne sur-enzymez pas. Utilisez la plus petite pipette en verre polie au chalumeau pour dissocier davantage les cellules en pipetant lentement de haut en bas trois à quatre fois de la même manière. Il n'est pas nécessaire de dissocier tous les agrégats cellulaires, car les agrégats ont tendance à se former à partir de cellules mortes présentes dans les débris.Laisser reposer les fragments de tissu pendant une minute. Ensuite, retirer 20 microlitres du surnageant SUP, qui devrait contenir les cellules en suspension destinées au comptage dans un hémocytomètre ; les neurones doivent présenter une viabilité d'au moins 95 % selon le test au bleu de trypan. Placer les neurones dans le milieu de culture neurobasal à une concentration adaptée à votre application.16 à 18 heures plus tard, changer le milieu pour un milieu de croissance basal neural afin d'éviter tout décollement. Retirer délicatement le milieu à l'aide d'une pipette, plutôt que de l'aspirer avec une pompe à vide. Voici quelques résultats représentatifs de neurones commissuraux isolés cultivés sur des lamelles en verre recouvertes de PLL : quatre heures après la mise en culture, les neurones ont adhéré à la surface ; 30 heures après la mise en culture.La plupart des neurones possèdent des axones allongés dotés d'un cône de croissance visible. Ces neurones peuvent être facilement utilisés dans des expériences d'immunofluorescence. Dans cet exemple, les microtubules sont marqués en vert, l'actine en rouge et les NA en bleu.Nous venons de vous montrer comment disséquer et cultiver des neurones commissuraux à partir de moelles embryonnaires. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que la pureté des neurones commissuraux dépend de l'épaisseur de la bande dorsale prélevée lors de la dissection. Voilà donc tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Ce test évalue la capacité d'une molécule de signalisation, voici protéine morphogénétique osseuse 7 (BMP-7), à réorienter les axones commissuraux. Un explant de la moelle épinière embryonnaire dorsal est cultivée adjacente à un agrégat de cellules COS sécrétant des facteurs de croissance candidat. Réorienté axones commissuraux croissante au sein de l'explant sont visualisées par immunohistochimie.

Dosage de la capacité des molécules de signalisation diffusibles à réorienter embryonnaires épinière axones commissuraux

Nous démontrons comment disséquer et à la culture chiches E4 et E6 ganglionnaires statoacoustic explants de la moelle épinière. Les explants sont cultivés dans un milieu sans sérum dans des gels de collagène 3D pour 24 heures. Réactivité neurites est testé avec support du facteur de croissance complété et revêtu de protéine avec des perles.

Dissection et la culture de cellules de ganglions et de Chick Statoacoustic explants moelle épinière dans des gels de collagène pour des essais de neurites

La vidéo montre l’isolement des motoneurones oculomoteurs, trochléaires et spinaux à partir d’un embryon de souris transgénique. L’embryon exprime des motoneurones marqués avec une protéine fluorescente verte (GFP) pour une visualisation et une identification faciles. Les motoneurones sont isolés chirurgicalement sous un microscope à fluorescence et maintenus dans un milieu de culture.

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Trancher les cultures de faciliter la manipulation du développement embryonnaire par le gène et les perturbations pharmacologiques. Toutefois, les conditions de culture doivent veiller à ce que le développement normal de procéder à l'intérieur de l'environnement réduit de la tranche. Nous illustrons un protocole qui facilite le développement normal de la moelle épinière se poursuivre pendant au moins 24 heures.

Embryon de poulet moelle épinière culture Tranche Protocole

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Le plancher est une structure essentielle des neurones de la moelle épinière en développement, fournissant des signaux diffusibles de progéniteurs et la différenciation. Nous décrivons une méthode pour produire des varangues milieu conditionné, à appliquer au tissu de la moelle épinière frais, et d'évaluer les conséquences sur les protéines d'intérêt par la biochimie.

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Les lamproies récupérer locomotion après une lésion complète de la moelle épinière. Cependant, certains neurones spinaux en saillie sont de bons régénérateurs et d'autres non. Cet article illustre les techniques de larves logements de la lamproie marine (et les adultes récemment transformées), la production complètes transections de la moelle épinière et le cerveau wholemount préparation et la moelle épinière pour l'hybridation in situ.

Spinal Cord Injury complète et cerveau Protocole Dissection pour Wholemount suite<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans des larves de la lamproie marine

modèles de culture cellulaire fournissent un contrôle détaillé sur les conditions environnementales et fournissent ainsi une plate-forme puissante pour élucider de nombreux aspects de la biologie des cellules neuronales. Nous décrivons un procédé rapide, peu coûteux et fiable afin d'isoler, de dissocier et de la culture des neurones sensoriels de l'embryon de poulet. Détails de la préparation des substrats et immunocytochimie sont également fournis.

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Ici, nous présentons un protocole qui est basée sur des tranches de moelle épinière en culture sur des réseaux multi-électrode à étudier la régénération fonctionnelle de connexions propriospinaux in vitro.

Enquêter Régénération fonctionnelle en organotypiques médullaires Co-cultures Cultivé sur des tableaux multi-électrodes

Cette étude présente une technique pour l'isolement des neurones de la souris néonatale WT. Il nécessite une dissection soigneuse de la moelle épinière de la souris néonatal, suivie de la séparation des neurones du tissu de la moelle épinière par un clivage mécanique et enzymatique.

L&#39;isolement et la culture des neurones de la moelle épinière chez les souris néonatales

Ce travail présente un protocole pour produire des cultures cellulaires homogènes des neurones moteurs oculomoteurs, trochléaires et spinaux primaires. Ces cultures peuvent être utilisées pour des analyses comparatives des caractéristiques morphologiques, cellulaires, moléculaires et électrophysiologiques des neurones moteurs oculaires et spinaux.

Isolement et culture des neurones oculomoteurs, trochlear et moteurs rachidiens de l'islmnprénatal :GFP Souris transgéniques

Découvrez la dissection et la culture de neurones commissuraux de la moelle épinière dorsale d'embryons de rat E13. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance et du guidage axonal.

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