Primaire cellules épithéliales bronchiques humaines Cultivé à partir d'explants

Dans cet article, nous décrivons un protocole de culture et d'expansion de cellules épithéliales bronchiques humaines à partir de segments bronchiques humains fraîchement isolés. Ce protocole comprend cinq sections : codage et grattage, plaques de culture de cent millimètres, réparation du tissu bronchique, explantation de greffons de tissu bronchique, passage de cellules épithéliales bronchiques humaines ciliées en croissance, et culture de cellules épithéliales bronchiques humaines sur transwells. Avant de commencer, notez que toutes les étapes sont réalisées dans une hotte de sécurité biologique.

Sauf indication contraire, veuillez lire la section sur les matériaux, les réactifs et la préparation, et assurez-vous que vous avez préparé les éléments essentiels. Les opérations suivantes doivent être effectuées : codage, préparation des solutions mères, culture, milieu, solutions de dissociation, revêtement et rayure. Les plaques de culture de cent millimètres doivent être réalisées dans le bst.

Gardez tout stérile. Placez des plaques de culture stériles de cent millimètres et la solution de revêtement. Dans la pipette BST, faites tournoyer deux millilitres de solution de revêtement dans une plaque de cent millimètres afin d'en recouvrir la base.

Veillez à ce que la solution de revêtement recouvre uniformément la base de la plaque. Aspirez la solution restante et utilisez-la pour revêtir une deuxième plaque de cent millimètres. Répétez cette opération pour autant de plaques que nécessaire.

Le nombre de plaques nécessaires varie en fonction du nombre d'explants tissulaires. Veillez à ce que la solution d'enduction recouvre uniformément la base des plaques. Tel que démontré.

Couvrez les plaques avec leurs couvercles. Laissez les plaques sécher dans l’incubateur pendant une à deux heures et aspirez la solution en excès avant utilisation pour l’explant de tissu bronchique. Les plaques de culture revêtues non utilisées peuvent être placées dans un sac stérile et conservées à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.

Utilisez des ciseaux, un scalpel et des pinces propres, petits et tranchants, nettoyés avec de l'éthanol à 70 %, et apportez dans le BSC des plaques recouvertes de rayures en appuyant fermement avec le scalpel pour former de petites entailles profondes, au moins quatre par plaque. Si les rayures ne sont pas assez profondes, les morceaux de tissu ne s'ancreront pas dans les seringues et flotteront à l'extérieur. Hors du BSC, placez le tissu dans une boîte de Pétri 3. Rincez soigneusement le tissu bronchique humain isolé dans du Bss.

Ouvrez les morceaux bronchiques. Placez le tissu dans le BS et transférez-le dans une plaque de culture tissulaire stérile de cent millimètres contenant du DMEM/F12 additionné de 1 % d’antibiotique-antimycotique. Utilisez de petites ciseaux pointus pour découper le tissu en morceaux cubiques de deux à trois millimètres.

Placer un morceau de tissu découpé au centre de chaque X à l’aide de pinces et appuyer. Laisser adhérer délicatement les morceaux de tissu ou les explants en forme de X à la plaque pendant quelques secondes. Ensuite, ajouter doucement 10 mils de milieu complet. Si le tissu flotte après l’ajout du milieu, utiliser les pinces pour pousser le tissu dans les sillons du X ou créer un nouveau X. Il peut être nécessaire de fabriquer de nouveaux X si les sillons ne sont pas suffisamment profonds.

Placer les plaques dans l’incubateur et changer le milieu toutes les trois à quatre journées jusqu’à ce que les tissus soient prêts à être transplantés. Lorsque des cellules épithéliales suffisantes ont poussé autour des tissus pour couvrir des zones d’un à deux centimètres, ce qui prend environ quatre semaines, utiliser des plaques de 100 mm revêtues et rayées.

Étant donné que certains explants tissulaires pourraient ne pas réussir, le nombre de plaques dépend du nombre de fragments de tissu que vous transplanterez. Si vous utilisez des plaques préalablement revêtues et conservées à quatre degrés Celsius, portez-les à température ambiante avant utilisation. À l’aide de pinces, prélevez délicatement le tissu depuis la plaque d’origine et placez-le au centre de l’axe de la nouvelle plaque, puis appuyez doucement. Les tissus sans prolifération doivent être éliminés.

Laisser le tissu adhérer à la plaque. Ajouter du milieu pendant quelques secondes et incuber. Ajouter comme décrit précédemment pour l'exemple X.

Donc, deux millilitres de solution mère de trypsine et d'EDTA pour chaque plaque de culture tissulaire de cent millilitres. Diluer la solution mère avec six millilitres de PBS stérile 0,01 molaire et deux millilitres de solution mère dans six millilitres de PBS, pour une concentration finale de trypsine de 250 microgrammes par millilitre et d'EDTA de cent microgrammes par millilitre. Après avoir transféré les explants dans une nouvelle plaque, aspirer le milieu des plaques à l’aide d’anneaux de cellules d’un à deux centimètres.

Ajoutez huit millilitres de gouttes tièdes diluées et un volume équivalent de solution à chaque plaque de cent millimètres. Incubez ensuite à 37 degrés Celsius pendant trois à quinze minutes. Vérifiez fréquemment.

Laisser la trypsine trop longtemps endommagera les cellules. Examiner les plaques au microscope pour s'assurer que la majorité des cellules ont été détachées ; les cellules deviendront rondes et se détacheront comme illustré à huit Mils de chaleur. Ajouter 10 % de FCS dans le milieu par plaque afin d'inactiver la solution d'EDTA.

Combiner les volumes de toutes les plaques dans un seul tube ou dans des tubes séparés selon les tissus. Compter les cellules à l’aide d’un centrifugeuse Hema Cytometer à cent G pendant cinq minutes. Un culot cellulaire se formera au fond du tube ; remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu complet jusqu’à la concentration cellulaire souhaitée.

Placer deux à trois millions de cellules par flacon T 75 et ajouter le milieu complet selon les besoins. Incuber et changer le milieu. Toutes les trois à quatre semaines, les cellules atteignent une croissance subconfluente dans les flacons D 75.

Environ quatre semaines plus tard, les cellules doivent être levées et mises en culture ou utilisées en dessous de la confluence pour éviter la sénescence. Commencez par préparer les membranes perméables des transwells. Utilisez des inserts de 6,5 millimètres qui s'adaptent dans des plaques multipuits de 24 puits.

Ajouter du milieu des deux côtés de la membrane. Six dixièmes de millilitre au fond et 0,1 millilitre en haut. Incuber une heure dans l'incubateur de culture cellulaire.

Retirez soigneusement le milieu des deux côtés de la membrane. Commencer par le volume basal comporte un risque de détérioration facile de la membrane. Par conséquent, pipetez le milieu le long de la paroi de l'insert de culture, en utilisant le volume recommandé.

Ne pas le faire entraînera une fuite du milieu vers d'autres puits destinés au semis des cellules. Après la pré-incubation du support perméable, pipeter soigneusement la suspension cellulaire sur la face apicale de la membrane pour des puits de 6,5 millimètres, en ajoutant 0,1 ml de suspension cellulaire sur la face apicale de la membrane. Pipeter 0,6 ml de milieu sur la face basolatérale de la membrane.

Alimentez les cellules du côté épical et basal pendant 10 jours. Pour établir un échange de culture bien différencié, changez le milieu deux fois par semaine. En utilisant la méthode démontrée, retirez le volume basal.

Remplacez d'abord le volume épical, ajoutez 0,6 mils de milieu du côté basal de la membrane. Cette méthode favorise l'attachement des cellules à la membrane et empêche les cellules d'être exposées à l'air pendant de longues périodes. Changez rapidement le milieu et remettez au laboratoire de culture.

Créez une interface air-liquide au jour 10 en éliminant le milieu AAL et en remplaçant 0,6 ml de milieu sur le côté basal de la membrane. Maintenez les cellules à l'interface air-liquide pendant six semaines en changeant le milieu deux fois par semaine. Des cellules ciliées commenceront à apparaître quatre semaines après la création de l'interface.

Interface liquide. Les cellules atteindront une différenciation uniforme en cellules ciliées. Six semaines après la création de l'interface liquide de l'oreille.

Segments bronchiques humains avec des cellules épithéliales saines provenant d'explants et de greffes. Dans notre étude, des cultures réussies à partir d'explants de tissu bronchique ont été obtenues dans huit des neuf tissus. Comme l'une des cultures d'explants s'est infectée, les anneaux de cellules épithéliales ont atteint un rayon de un à deux centimètres en trois à quatre semaines.

Des explants X réussis ont été cultivés à nouveau jusqu'à six fois. Toutes les cultures réussies montrent des signes de migration cellulaire dans les 48 heures suivant le début des greffes, ou des explants X comme le montrent les cellules B qui présentent un aspect pavé distinctif propre à ces cellules épithéliales, tel qu'illustré dans B. Et dans les figures suivantes, la coloration immunohistochimique de préparations de cytosine provenant de cellules issues d'explants et de cellules semées sur des lamelles révèle que toutes les cellules étaient positives pour la cytokeratine spécifique de l'épithélium. Des cellules bronchiques humaines en sous-culture, cultivées jusqu'à confluence partielle dans des flacons T75, sont présentées ici. Remarquez l'aspect pavé.

Les cellules bronchiques humaines en sous-culture ont montré une immunomarquage uniformément positif pour la kératine et l'E-Cad. Un immunomarquage avec des anticorps spécifiques dirigés contre d'autres types cellulaires n'a révélé aucune indication de contamination des cultures par des fibroblastes, des cellules mésenchymateuses ou endothéliales. Pour plus de détails, veuillez vous référer à la figure cinq et à sa légende dans le texte. Les cellules cultivées sur des membranes polyester perméables ou des transwells, avec ou sans interface liquide, se différencient en épithélium cilié comme le montre cet exemple ; jetez les cellules et leurs ou transplantations si des cellules présentant une morphologie différente, comme indiqué ici, commencent à apparaître. Dans ce protocole, nous présentons des méthodes détaillées pour la culture et l'expansion de cellules épithéliales bronchiques primaires humaines.

Des études basées sur des cellules humaines sont nécessaires pour déterminer les voies importantes des mécanismes des maladies pulmonaires humaines et pour le dépistage toxicologique et pharmacologique de nouveaux médicaments. Nous espérons que les méthodes décrites ici vous encourageront à cultiver des cellules épithéliales bronchiques humaines à partir d'explants et à utiliser ces cellules dans vos systèmes d'étude. Merci et bonne chance.