Analyse de la composition globale de la paroi cellulaire végétale (biomasse lignocellulosique) Partie II: Glucides

La détermination de la composition en polysaccharides matriciels et de la teneur en cellulose cristalline des parois cellulaires végétales commence par du matériel végétal séché, qui est soumis à diverses extractions. Le matériau résultant est constitué uniquement de parois cellulaires, puis est divisé pour déterminer la composition en polysaccharides de la matrice. Le matériau de la paroi est traité avec un acide faible pour hydrolyser, des polysaccharides non cristallins, qui sont principalement les hémocelluloses dans leurs monosaccharides.

Les monosaccharides sont ensuite dérivés en acétates d’aldol volatils correspondants, qui sont ensuite analysés et quantifiés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse pour la détermination de la cellulose cristalline. Les parois de contenu sont traitées avec le réactif graphique, un mélange d’acides qui enlève les composants non cristallins de la paroi. La cellulose cristalline restante est dégradée en son monomère glucose, qui peut être dosé de manière cholique.

La détermination de la teneur et de la composition de la lignine est démontrée dans une autre publication vidéo de J intitulée Analyse complète de la composition des parois cellulaires végétales, première partie de la lignine. Bonjour, je m’appelle Marcus Pauley, je suis responsable de l’installation d’analyse du mur au Centre de recherche sur la bioénergie des Grands Lacs, ici à l’Université d’État du Michigan. Je suis Cliff Foster, directeur de l’installation d’analyse de la paroi cellulaire.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer comment déterminer la composition des polysaccharides présents dans le matériau de la paroi cellulaire végétale, c’est-à-dire la cellulose dans diverses celluloses Homo. Ici, au Centre de recherche sur la bioénergie des Grands Lacs, nous développons une technologie pour convertir ces sucres en biocarburants. Afin d’identifier une matière première végétale optimale, nous devons d’abord évaluer le type et l’abondance de sucres présents dans cette biomasse.

Dans une autre vidéo intitulée Analyse complète de la composition des parois cellulaires végétales, première partie Lignine, nous nous concentrerons sur l’analyse des polyphénols. Alors commençons. Commencez cette procédure en isolant les parois cellulaires.

Broyez environ 60 à 70 milligrammes de matière végétale séchée avec des billes d’acier inoxydable de 5,5 millimètres dans un tube à bouchon à vis TED SAR de deux mils. En utilisant un broyeur REM comme alternative à haut débit, utilisez un robot de broyage et de distribution appelé mur de l’œil, comme décrit dans la première partie. Une fois le broyage terminé, retirez les billes d’acier.

Continuez à isoler les parois cellulaires et à éliminer l’amidon résiduel comme indiqué dans la première partie et décrit dans le protocole écrit qui l’accompagne. Pesez deux milligrammes de matériau de paroi cellulaire d’amidon SD dans un tube sared à deux broyeurs. Le robot du mur de l’œil est un moyen à haut débit d’effectuer cette tâche.

Le robot prend un tube contenant de la matière végétale moulue et perce un trou au fond du tube. Le tube percé est ensuite placé sur une mangeoire VI. Un tube vide est placé sur une balance et déplacé sous l’alimentateur VI à travers des vibrations, le matériau percole à travers le trou du tube supérieur chargé dans le tube inférieur vide jusqu’à ce que la quantité souhaitée de matériau soit accumulée.

Ajoutez 100 microgrammes d’acétol comme étalon interne. Rincez les parois du tube avec de l’acétone pour recueillir le matériau de la paroi cellulaire au fond du tube et évaporez l’acétone très doucement sous l’effet d’un flux d’air. Ensuite, effectuez une hydrolyse d’acide faible.

Ajoutez soigneusement 250 microlitres d’acide trichloracétique ou TFA à chaque échantillon, en vous assurant qu’aucune matière n’est éclaboussée sur les parois du tube. Fermez hermétiquement les tubes et incubez à 121 degrés Celsius dans un bloc chauffant pendant 90 minutes. Ensuite, refroidissez les blocs chauffants et les échantillons sur de la glace et centrifugez les tubes à 10 000 tr/min pendant 10 minutes.

Transférez 100 microlitres du surnageant acide contenant les sucres solubilisés du polysaccharide matriciel dans des flacons à bouchon à vis, en veillant à ne pas perturber le matériau en granulés. La pastille peut être utilisée pour le dosage de la cellulose cristalline. Évaporez le TFA dans un tube de verre sous un léger courant d’air dans un dispositif d’évaporation.

Ajoutez 300 microlitres de deux propanol pour éliminer l’excès de vortex acide et évaporez à 25 degrés Celsius. Répétez l’opération trois fois au total. Afin de permettre l’identification des monosaccharides par chromatographie en phase gazeuse, effectuer une dérivitation de l’acétate d’aldol.

Tout d’abord, réduisez les monosaccharides à leurs aldols à cycle ouvert correspondants, qui sont ensuite acétylés. Consultez le protocole écrit ci-joint pour obtenir des instructions détaillées. Chaque étape de la procédure suit le protocole précédemment montré, l’ajout de l’incubation du réactif l’évaporation sous un courant d’air, suivie de l’élimination de l’excès de réactif par diverses étapes de lavage.

Dans les dernières étapes, les acétates d’aldol sont extraits. Tout d’abord, ajoutez 500 microlitres d’acétate d’éthyle et remuez légèrement. Ensuite, ajoutez deux mils d’eau, bouchez les tubes et le vortex, centrifugez les tubes à 2000 tr/min pendant cinq minutes pour obtenir des couches séparées claires avec de l’acétate d’éthyle sur le dessus contenant les acétates d’Al Dettol et de l’eau sur le fond pipette 50 microlitres de couche d’acétate d’éthyle dans des flacons GCMS avec inserts dilués en ajoutant 100 microlitres d’acétone dans le flacon GC et le flacon GC peut être stocké à quatre degrés Celsius.

Si l’analyse GCMS n’est pas effectuée immédiatement, injectez les échantillons dans un photographe de chrominance en phase gazeuse équipé d’un spectromètre de masse quadruple. Pour la chronique et les détails de la course, veuillez consulter le protocole écrit ci-joint. Le matériau de départ pour déterminer la teneur en cellulose cristalline peut être un matériau de paroi cellulaire isolé ou un matériau de paroi déjà traité avec l’acide faible TFA, soit immédiatement après le traitement à l’acide, soit sous forme séchée stockable.

Après avoir éliminé l’excès de TFA avec de l’iso propanol comme indiqué précédemment, ajoutez à la pastille de TFA dans les deux sars M pour tuber un M de réactif up degra composé d’acide acétique, d’acide nitrique et d’eau, ajoutez un rapport de volume à volume de huit à un à deux. Fermez hermétiquement le tube et chauffez-le sur un bloc chauffant à 100 degrés Celsius pendant 30 minutes. À la suite de ce traitement, il ne reste que de la cellulose cristalline dans la pastille.

Tous les autres polysaccharides sont des échantillons froids hydrolysés dans le bloc sur de la glace à température ambiante ou plus froide. Ensuite, centrifugez les échantillons à 10 000 tr/min pendant 15 minutes après la centrifugation, jetez le surnageant en veillant à ce que la pastille ne soit pas perturbée et qu’aucun matériau de la pastille ne soit retiré. À cette fin, laissez environ 150 microlitres de surnageant dans le tube, lavez le granulé plusieurs fois à l’eau.

Ensuite, effectuez une hydrolyse avec l’acide sulfurique concentré afin d’hydrolyser complètement le cristal et la pastille de cellulose en glucose. Commencez par ajouter 175 microlitres d’acide sulfurique à 72 % dans le tube de sarta et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation initiale, agitez l’échantillon et incubez pendant 15 minutes supplémentaires.

Ajoutez ensuite 825 microlitres d’eau et de vortex et centrifugez les échantillons à 10 000 tr/min pendant cinq minutes. Il peut y avoir des matières brunes et solubles, principalement de la lignine restant dans le tube tandis que le glucose est dans le surnageant. La teneur en glucose du surnageant est mesurée à l’aide du dosage Colormetric anthone.

Ce test est effectué dans une plaque de microtitration en polystyrène de 96 puits. Réparer une courbe standard de glucose en double en suivant les instructions du protocole écrit ci-joint. Préparez les échantillons en combinant 10 microlitres de chaque échantillon, supernat et 90 microlitres d’eau dans des puits séparés de la même plaque de microtitration que la finition standard en ajoutant 200 microlitres de réactif fraîchement préparé et jeté.

Ensuite, chauffez la plaque pendant 30 minutes à 80 degrés Celsius dans un four avec un dissipateur de chaleur en aluminium. Observez que les échantillons contenant du glucose passent du jaune au bleu-vert lorsque le chauffage est terminé. Laissez la plaque refroidir à température ambiante et secouez soigneusement.

Lisez l’absorption à 625 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaque de microtitration. La teneur en glucose, élément constitutif de la cellulose, est calculée sur la base de l’absorbance par rapport à la courbe standard établie sur la même plaque. Voici quelques résultats représentatifs de l’analyse des polysaccharides d’un morceau de bois de peuplier.

Les pics de chromatogramme en phase gazeuse sont identifiés par les profils de masse et/ou les temps de rétention des étalons. Les monosaccharides sont quantifiés sur la base de courbes standard. L’analyse des polysaccharides matriciels montre une grande abondance de xylose représentant l’hémicellulose xam, mais d’autres sucres sont également présents.

Selon l’analyse, 40 % du matériau du peuplier est constitué de cristal et de cellulose. Veuillez noter que ces contenus et compositions peuvent varier d’une plante à l’autre ou entre différentes anatomies de plantes. Nous venons de vous montrer comment déterminer la teneur en polysaccharides et l’analyse de la composition de la biomasse cellulosique de lignano pour l’analyse du polyphénol lignine.

Écoutez la première partie. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.