Name: Purification de la M. magneticum Strain AMB-1 Protein magnétosome Associated MamAΔ41 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-25T16:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Apprenez la purification de la protéine MamAΔ41 associée aux magnétosomes chez Magnetospirillum magneticum AMB-1. Ce protocole combine chromatographie d'affinité, échange d'ions et exclusion stérique pour obtenir une protéine pure et homogène.

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Nous reconnaissons le Dr Amir Aharoni pour son soutien et Geula Davydov, Noam Grimberg et Chen Guttman, pour leurs conseils et commentaires.

1. Clonage et expression des gènes dans les mama E. coli Le gène mutant mamAΔ41 été amplifié en utilisant la réaction en chaîne polymérase (PCR) à partir d'ADN génomique de Magnetospirillum magneticum AMB-1, avec des amorces: 5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 'et 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3'. Dans les fragments d'ADN amplifié, un site Ncol a été introduit au codon d'initiation ATG et le codon de terminaison a été remplacé par un site SCOI. Les fragments ont été digérés avec Ncol et Sacl et clone dans les sites respectifs de pET52b (+), donnant lieu à pET52bMamAΔ41-amb1. Dans cette construction, le gène a été mamAΔ41 fusionnés dans le cadre avec le 10-His à la partie C-terminale. Le plasmide a été électroporés dans la souche E. coli BL21. E. coli souche BL21 hébergeant pET52bMamAΔ41 a été cultivé dans une auto-induction (15) support contenant de l'ampicilline (50 mg / ml) 310 ° K pendant 3 heures. La température de culture a ensuite été déplacé de 310 ° à 300 ° K et maintenu pour une période supplémentaire de 48 heures à 300 ° K. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 5465g pendant 10 min à 277 ° K. 8 litres de culture produit 60 grammes de granulés cellule humide. 2. Les calculs de bioinformatique Calculs de poids moléculaire (MW), selon la séquence des acides aminés et l'absorption prévue de 1mg/1ml de protéines dans 280nm, en utilisant le serveur ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). Pour 10His-Tag-MamAΔ41 l'MW 22529 Da (240 acides aminés) et pour MamAΔ41 (avec 9 acides aminés à gauche après son enlèvement par tag-thrombine), le Mw est 20596.5Da (187 acides aminés). L'absorption prévue de 1mg/1ml de protéines dans 280nm pour les 10His-Tag-MamAΔ41 est 0,595 et 0,579 MamAΔ41 est. En outre, la séquence d'acides aminés ne contient pas de résidus cystéine. Par conséquent, les agents réducteurs ne sont pas nécessaires pendant le processus de purification. 3. Purification de MamAΔ41 <ol><li> Pour la préparation de la solution mère, peser et préparer (200 ml chacune) dans les concentrations suivantes: imidazole (228,2 MW g / mol) solution 4M, NaCl (Mw 58,44 g / mol) solution de 5M, Tris-HCl (Mw 121,3 g / mol solution) 1M, ajuster le pH = 8. Ajouter l'eau bidistillée (DDW) et mélanger en utilisant un vortex jusqu'à la solution est claire. Solutions de filtration avec filtre à 0.22μm et garder à température ambiante. </li><li> Préparer et filtre 6 nouveaux tampons à partir des solutions mères (tableau 1). </li><li> Diluer et suspendre les cellules dans le tampon A volume en rapport 1:2, grammes de cellules à mémoire tampon (ml). </li><li> Ajouter 10 ul pour chaque 10gr de bactéries de DNase I (1 mg / ml) afin de briser des fragments d'ADN dans l'échantillon. Ajouter 1ml de chaque 20gr de bactéries sans EDTA cocktail inhibiteur de protéase. Incuber pendant 20 min sur la glace. </li><li> Perturbé les cellules en deux cycles de presse française à 25.000 psi. Contrairement à la sonication, la presse française est destiné à un volume élevé (10ml&gt;) d'extrusion cellulaire en forçant les cellules sous haute pression par un orifice mince. Le piston doit être refroidi sur la glace pendant dix minutes avant son utilisation et de montage en raison de l'accumulation de température. </li><li> Transférer les cellules lysées dans des tubes de 25ml et ultracentrifugeuse les équilibrer avec précision (50mg) avec le tampon A jusqu'à ce que l'échantillon atteint la ligne du cou le tube s. </li><li> Les débris cellulaires par centrifugation séparés Ultra à 270 000 g pendant 1 heure à 277 ° K. </li><li> Préparer une maison gravité Ni NTA colonne (2,5 cm de diamètre) en ajoutant 4 ml de Ni NTA résine, qui sont conserves dans l'éthanol à 20%, sur la colonne. Laissez la chute du liquide complètement, puis laver avec 40 ml de DDW et laisser tomber le liquide complètement. Pré-équilibrée de la résine dans la colonne avec 40 ml de tampon A. </li><li> Appliquer la fraction soluble de l'ultra-centrifugation des tubes sur la gravité Ni NTA colonne. Laissez la chute de fluide, de recueillir à écoulement continu (protéines non) et de préserver au 277K. </li><li> Recueillir un échantillon de granulés à partir des tubes ultra-centrifugation en utilisant un petit pourboire à la ferraille le culot. Mélangez du bout de 50 pl de 5% β-mercaptoéthanol dans le tampon d'échantillon 2X SDS-PAGE. </li><li> Laver la colonne avec 100 ml de tampon B. Laissez la chute de fluide, de recueillir accréditives et de préserver au 277K. </li><li> Préparer 15 tubes Eppendorf marqués (1,5 ml). </li><li> Élution - vanne colonne serrée, puis charger 1ml de tampon C sur la colonne; incuber pendant 3 min, puis en ouvrant la vanne et le débit-à travers la collecte. Répétez cette étape trois fois. </li><li> Eluer reste de la suspension au incrément de 1 ml de tampon C et fermer la vanne. </li><li> Mesurer DO à 280nm des fractions et d'évaluer l'emplacement du pic de protéine, et si la DO est toujours&gt; 0,3, les échantillons supplémentaires sont nécessaires. </li><li> Analyse SDS-PAGE des fractions collectées. Une telle analyse devrait être effectuée aussi avec les échantillons suivants, protéines non accréditives, lavez accréditives et ultra-centrifugation de l'échantillon à granulés. Mélanger 10 ul de chaque échantillon avec 10 ul de 5% β-mercaptoéthanol dans le tampon d'échantillon 2X SDS-PAGE. Charger les échantillons sur 15% SDS-PAGE et courir pendant 45 min à 180 volts. </li><li> Tache le gel dans 15 ml de solution InstantBlue, agiter pendant 1 heure. Assurez-vous que la boîte en plastique est recouvert et protégé de la lumière. </li><li> Évaluer un gel, si l'expression de protéines est élevé et spécifique selon les bandes indicatif, fusion sélectionnées fractions éluées. </li><li> Afin de supprimer les 10-His-tag, ajouter la thrombine bovine (10 unités / ul), 10 ul thrombine par 1 mg de protéine, selon la recommandation du fabricant pour l'échantillon combiné. </li><li> La dialyse est utilisée pour l'enlèvement imidazole excès et à diminuer les concentrations de NaCl pour les niveaux nécessaires pendant l'échange d'ions contraignant. Pour la dialyse, couper la longueur désirée de 7 kDa de poids moléculaire coupé tube à dialyse (MWCO). Laver avec DDW et faire un noeud à une extrémité (ou le sceau avec des clips). Transfert solution de protéines fusionnées sur le sac, tout en laissant peu d'espace en haut et en pince en place. </li><li> Immerger le tube de dialyse en mémoire tampon de 4 litres de dialyse frais (tampon D). Incorporer lentement la solution pendant la nuit à 277 ° K. </li><li> Sortez le tube de dialyse du bécher, faire une petite coupure et le transfert à la protéine de tube 50ml. </li><li> Chromatographie échangeuse d'ions: assembler pré-emballés MonoQ 4.6/100 PE colonne chromatographie liquide rapide (FPLC). Laver la colonne avec 5 volumes de colonne (CV) d'eau filtrée DDW. Équilibrée de la colonne avec 5 CV de tampon D. </li><li> Laver la boucle d'injection avec DDW (deux volumes en boucle) et de répéter avec le tampon D. Charge de la protéine dans la boucle d'injection. </li><li> Injecter l'échantillon de protéine (débit de 1 ml / min) et commencer à recueillir des fractions pour SDS-PAGE de détection des protéines non borné. </li><li> Si le volume protéine initiale (étape 3.23) est plus grande que la boucle d'injection, répétez les étapes 3.25 à 3.26, sans se laver la boucle, jusqu'à ce que tout l'échantillon est chargé sur la colonne. </li><li> Laver la colonne avec 3 CV de tampon C afin d'éliminer les protéines non borné. </li><li> Eluer la protéine avec un gradient linéaire de 60 min 40 2000mm NaCl entre les tampons de D &amp; E (lorsque E tampon de 100% est la fin de la pente), débit 1 ml / min (bien que des débits plus élevés peuvent être utilisés dans le coût de la volumes plus importants, mais moins concentré pics de protéine,). Recueillir des pics de protéines tels qu'ils apparaissent dans le chromatogramme 280nm. </li><li> Nettoyer pré-emballés pour la fabrication de colonnes selon recommandation. </li><li> Analyse SDS-PAGE des fractions collectées. Une telle analyse doit être effectuée avec les échantillons suivants, sans limite d'écoulement des protéines et des protéines grâce à des pics accréditives. Exécutez le SDS-PAGE et coloration que mentionné dans les étapes 3.17 à 3.18. </li><li> Évaluer un gel de protéines des bandes existence à la Mw prédite selon la protéine pré-teint marqueur. Fusionner les fractions d'élution sélectionnées qui contiennent la protéine d'intérêt. </li><li> Dialyser les échantillons fusionnés, afin de réduire les concentrations de NaCl nécessaire pour la chromatographie d'exclusion stérique. Effectuer la dialyse comme mentionné dans les étapes 3.21 à 3.23 contre le tampon F. </li><li> Concentrer l'échantillon de protéines en utilisant un Vivaspin-15 10 000 MWCO à 8 mg / ml dans une centrifugeuse de table, 4000 rpm. Valider la concentration en mesurant le désir de DO à 280nm au Quartz cuvette. Si la protéine est trop concentré, il diluer avec le tampon F et de mesurer à nouveau. </li><li> Assemblez l'exclusion de taille pré-emballés colonne, HiLoad 26/60 Superdex 200, le FPLC; laver la colonne avec 3 CV de l'eau filtrée DDW. Équilibrée de la colonne avec 3 CV de tampon F. </li><li> Laver boucle d'injection avec DDW 5ml (deux volumes en boucle), suivi par le même volume avec le tampon F. Ne chargez pas plus de 4 ml de l'échantillon de protéine dans la boucle d'injection. </li><li> Injecter l'échantillon de protéine (débit de 3,5 ml / min) et commencer à recueillir des fractions de protéines de pointe, tels qu'ils apparaissent sur le chromatogramme on 280nm. Laissez les flux de tampon jusqu'à ce qu'il atteigne le volume de la colonne. </li><li> Si le volume protéine initiale (étape 3.23) est plus grande que la boucle d'injection, répétez les étapes 3.25 à 3.26, sans se laver la boucle, jusqu'à ce que tout l'échantillon est chargé sur la colonne. </li><li> Nettoyer pré-emballés colonne selon la recommandation de fabrication. </li><li> Analyse SDS-PAGE des fractions collectées. Une telle analyse devrait être effectuée avec des pics de protéines des échantillons. Exécutez le SDS-PAGE et coloration que mentionné dans les étapes 3.17 à 3.18. </li><li> Évaluer un gel: si les pics de protéines spécifiques, dans le Mw correcte prédite selon la protéine pré-teint marqueur et une seule bande est visible de fusion sélectionnées fractions éluées de la protéine pertinents. </li><li> Concentré de protéines en utilisant un échantillon de Vivaspin-15 10 000 MWCO à&gt; 20 mg / ml dans une centrifugeuse de table, 4000 rpm. Valider la concentration en mesurant le désir de DO à 280nm. Le MamAΔ41 purifiée est ensuite concentré à 26,5 mg / ml pour la cristallisation. </li> &lt;li&gt; Confirmer la pureté de l'échantillon et l'identification de protéines en utilisant Matrix-assisted laser desorption / ionisation (MALDI-TOF). <li> Si la protéine est purifiée selon le spectromètre de masse et SDS-PAGE, divisez le MamAΔ41 concentré pour pré-marqués des tubes Eppendorf, 25-50 pl protéine dans chaque. </li><li> Flash congelés dans l'azote liquide et conserver à 193 ° K. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Lorsque ce protocole est fait correctement on devrait obtenir hautement purifiée, des échantillons de taille homogène et concentrée en protéines. Ces échantillons de protéines sont alors prêts pour des essais de cristallisation ainsi que des études biochimiques, tels que la cinétique enzymatique, l'affinité de liaison et plus encore. Décrites ici sont des résultats représentatifs des principales étapes dans le protocole de purification. SDS-PAGE analyse du profil d'élution de Ni-NTA colonne d'affinité devraient révéler hautement plus protéine exprimée dans la fraction soluble à MW appropriée de ~ 22 kDa (figure 1). Cette analyse SDS-PAGE devrait également révéler minimum si aucune protéine dans les protéines non borné accréditives, lavez accréditives et ultra-centrifugation de l'échantillon à granulés. Si de grandes bandes de la protéine appropriée apparaissent dans ces échantillons on devrait envisager la préparation mauvais tampon, les problèmes de rupture des cellules ou des problèmes dans la culture d'auto-induction des conditions et de croissance. Chromatographie échangeuse d'ions est préformé de façon à séparer entre nos protéines souhaitable à d'autres protéines de E. coli qui étaient liés à la résine de nickel (due à des interactions électrostatiques ou histidine / négatif aminés des boucles acides riches en protéines) et non coupés His-tag protéines souhaitable. Cette colonne sépare les protéines en fonction de leur affinité de liaison à la résine chargée positivement dans l'augmentation des concentrations de NaCl. Protéine hautement chargées négativement vont éluer des concentrations plus élevées de NaCl apposer à modérée celles chargées négativement. Les avantages de cette colonne sont haut débit et capacité de liaison. Le chromatogramme d'échange d'ions (Figure 2) révèle une bonne séparation entre les populations des protéines 3 en augmentant la concentration de NaCl. Analyse SDS-PAGE est nécessaire afin de déterminer MW de chaque population, d'isoler le souhaitable et l'évaluation si étapes de purification sont nécessaires. La première population est MamAΔ41 (~ 20 kDa) alors que la deuxième population est MamAΔ41 + Son Tag (~ 22 kDa) qui n'était pas clivé par la thrombine bovine et la troisième population est indétectable dans SDS-PAGE en raison de la faible concentration. Si les pics de protéines ne sont pas clairement séparés on devrait envisager la préparation mauvais tampon ou de changer la pente du gradient de NaCl. Chromatographie d'exclusion stérique est préformé de façon à séparer entre nos protéines souhaitable à d'autres protéines de la cellule de E. coli qui étaient liés à la résine Ni-NTA et n'ont pas été séparés pendant chromatographie échangeuse d'ions. Cette colonne sépare les protéines selon leur taille. Protéines de grande taille seront éluer dans les plus petits volumes d'élution par rapport aux petits qui seront élues dans des volumes plus importants. Le chromatogramme colonne (figure 3) révèle une bonne séparation de la protéine souhaitable car une population principale. La population semble éluer en taille avec un monomère approprié MW de ~ 20 kDa. La présence de la bande ~ 80 kDa (E.coli protéine typique qui lie résine Ni-NTA) est détecté en SDS-PAGE avant le chargement de la colonne et disparaît au cours de cette course. Puisque la concentration de cette protéine ~ 80 kDa est faible au départ, sa population ne figure pas dans le chromatogramme en raison de sa dilution et analyse SDS-PAGE est nécessaire pour déterminer l'efficacité de la purification. Nous recommandons de charger un échantillon dilué et concentré sur le pic principal de la SDS-PAGE ainsi on pourrait sûrement déterminer la présence d'une protéine pure dans la MW appropriée. A ce stade, la protéine est purifiée et son homogénéité doivent être évaluées par MALDI-TOF. Cette analyse a révélé une protéine en MW de 20347 Da et une autre dans Mw de 10 176 Da (Figure 4). La protéine ~ 10 kDa est la protéine ~ 20 kDa doublé facturés. Le MW prévue de MamAΔ41 avec les 9 acides aminés à gauche après son enlèvement a été Tag-20596.5 Da. En la comparant à la MALDI-TOF obtenu MW nous avons constaté qu'ils sont 248 Da à part. Cette dissemblance peut entraîner des erreurs de mesure MALDI-TOF et / ou en raison de la dégradation commune de la première méthionine et la seconde la glycine. Pour conclure, la protéine est hautement purifié et peut être utilisé pour d'autres expériences. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844table.jpg" alt="Tableau 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 1"> Tableau 1. Formulations tampon. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Représentant analyse SDS-PAGE de la purification sur colonne Ni-NTA De droite à gauche;. P-ultra-centrifugeuse granulés (3,11 étape du protocole), W-lavage (3,12 étape du protocole), U-sans limite protéines (3,10 étape du protocole), E- cinq voies d'élution SAMPLes (3,14 étape du protocole), M - marqueur protéique (les chiffres indiquent MW). La flèche indique MamAΔ41. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Analyse de la chromatographie échangeuse d'ions étape (a) L'échange d'ions (colonne MonoQ) chromatogramme; Bleu - 280nm absorption, représente la concentration de protéines, vert-de NaCl de concentration, Rouge - indication des fractions collectées. (B) Représentant analyse SDS-PAGE de l'étape de purification par échange d'ions. De gauche à droite, M - marqueur protéique (les chiffres indiquent Mw), A6 - fraction premier pic, fraction du pic A8-seconde. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Analyse par chromatographie d'exclusion de taille (a) l'exclusion Taille (colonne Superdex 200) chromatogramme; Bleu - 280nm absorption, représente la concentration de protéines, l'indication rouge de fractions collectées. (B) Représentant analyse SDS-PAGE d'étape de purification d'exclusion de taille. De gauche à droite; M-protéine marqueur (les chiffres indiquent MW), Prei-pré-injecté l'échantillon, A4-6 fraction combinée recueillies auprès de la première crête, A4-6D-dilué fraction recueillie à partir de la pointe. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Matrix-assisted laser desorption / ionisation (MALDI-TOF) spectre de masse de purifier MamAΔ41. La matrice est acide sinapique (SA). MamAΔ41 montré à 20347 Da, également représentée est l'espèce doublé chargé de MamAΔ41 à 10176 Da.

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Purification des protéines est l&#39;étape principale dans toutes les protéines biochimiques ou des études structurales. Comme chaque protéine est unique avec son propre comportement, on a besoin de définir ses propriétés et de modifier en conséquence sa purification. Protéine cible doit être analysé comme une première étape vers la purification à l&#39;aide d&#39;outils bioinformatiques. Ils sont utilisés pour calculer la cible point isoélectrique, d&#39;évaluer son besoin de réduction / oxydation environnement et de s...

<table><tbody><tr><td>Presse française</td><td>Équipement</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-078A</td><td></td></tr><tr><td>Cellule de pression</td><td>Équipement</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Équipement</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Discovery 90SE</td><td></td></tr><tr><td>Rotore</td><td>Équipement</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Ti60</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d'ultracentrifugation ; Bouteille PC + Couvercle Essai 26,3 ml</td><td>Équipement</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>BC-355618</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de chromatographie en verre, diamètre 2,5 cm, Econo-Column</td><td>Équipement</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2521</td><td></td></tr><tr><td>Résine Ni-NTA His Bind</td><td>Équipement</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>M0063428</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Équipement</td><td>Amersham</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette en quartz</td><td>Équipement</td><td>Hellma</td><td>104-QS</td><td></td></tr><tr><td>Chromatographie liquide à haute performance - AKTA purifier 10</td><td>Équipement</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>Colonne d'échange d'ions &amp;#8211; MonoQ 4,6/100 PE</td><td>Équipement</td><td>GE Healthcare</td><td>10025543</td><td></td></tr><tr><td>Colonne pré-remplie de filtration sur gel - HiLoad 26/60 Superdex 200</td><td>Équipement</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1071-01</td><td></td></tr><tr><td>Centricon - Vivaspin15 &amp;#8211; 10 000 MWCO</td><td>Équipement</td><td>Sartorius AG</td><td>VS1501</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Équipement</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>IEC CL30R</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Équipement</td><td>Bruker Corporation</td><td>Reflex IV</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (hydroxyméthyl)aminométhane</td><td>Réactif</td><td>BioLab</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Réactif</td><td>FRUTROM</td><td>235553470</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Réactif</td><td>Alfa Aesar</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d'inhibiteurs de protéases sans EDTA</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8849</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I (désoxyribonucléase I)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Thrombine bovine</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP25432</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Réactif</td><td>BioLab</td><td>07132391</td><td></td></tr><tr><td>S dodécylsulfate (SDS)</td><td>Réactif</td><td>BioLab</td><td>19822391</td><td></td></tr><tr><td>Bêta-mercapto&amp;#8211;éthanol</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Réactif</td><td>Expedeon</td><td>1SB01L</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur protéique coloré PageRuler</td><td>Réactif</td><td>Fermentas</td><td>SM0671</td><td></td></tr></tbody></table>

purification de la m. magneticum strain amb-1 protein magnétosome associated mamaΔ41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Bactéries magnétotactique constituent un groupe diversifié de micro-organismes aquatiques qui sont capables de s&#39;orienter le long des champs géomagnétiques. Ce comportement est considéré comme une aide leur recherche d&#39;environnements adaptés<em&gt; (1)</em&gt;. Cette capacité est conférée par l&#39;magnétosome, un organite intracellulaire qui se compose d&#39;un assemblage linéaire de la chaîne des vésicules lipidiques de chaque mesure de biomineralize et joignez un ~ 50-nm cristaux de magnétite ou greigite. Une composante principe de la magnétosome qui a été montré pour être requis pour la formation de vésicules fonctionnelle est maman. Maman est une très abondante magnétosome protéine associée qui est l&#39;un des plus caractérisé magnétosome protéines associées<em&gt; In vivo</em&gt;<em&gt; (2-6)</em&gt;. Cet article se concentre sur la purification de la maman, qui en dépit d&#39;être étudiée<em&gt; In vivo</em&gt;, Aucun des détails clairs fonctionnelles ou structurales ont été identifiées pour elle. L&#39;analyse bioinformatique a suggéré que Mama est une répétition de tétra-tricopeptide (TPR), contenant des protéines. TPR est un motif structural trouve que cette partie ou d&#39;une plus grande formation de pli dans une large gamme de protéines, il sert de modèle pour les interactions protéine-protéine et sert de médiateur complexes multi-protéiques<em&gt; (7)</em&gt;. TPR sont impliqués dans de nombreuses tâches essentielles dans le processus eucaryotes organite cellulaire et de nombreuses voies de bactéries<em&gt; (8-14).</em&gt; Afin de comprendre Mama, un TPR uniques contenant des protéines, la protéine hautement purifiée est nécessaire dans un premier temps. Dans cet article, nous présentons le protocole de purification d&#39;un mutant stable Mama suppression (MamAΔ41) de<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

Mama est un unique protéines associées magnétosome qui a été montré pour être impliqués dans l&#39;activation magnétosome. Nous présentons ici le protocole de purification de Mama mutant de délétion (MamAΔ41) de<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

Purification de la M. magneticum Strain AMB-1 Protein magnétosome Associated MamAΔ41

Les bactéries magnétotactiques constituent un groupe diversifié de microorganismes aquatiques capables de s'orienter le long des champs géomagnétiques. Ce comportement est...

Le processus de purification commence par des pastilles cellulaires exprimant la Mame. La disruption de la membrane cellulaire de la protéine recombinante Delta 41 est suivie par la séparation des fractions soluble et insoluble. Afin d'extraire la protéine recombinante soluble, la chromatographie d'affinité sépare la protéine recombinante marquée des autres protéines cellulaires.La chromatographie d'échange d'ions sépare mamma Delta 41 des autres protéines cellulaires qui subsistent après la chromatographie d'affinité et la chromatographie par exclusion stérique. La chromatographie permet en outre de séparer mamma Delta 41 et de révéler son état oligomérique. Enfin, la pureté et l'homogénéité de la protéine recombinante sont analysées.Bonjour, je suis Raza, responsable du laboratoire XVA au sein du département des sciences de la vie à l'université Benon du Négatif. Je suis également Natalie du laboratoire Z. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de purification de protéines recombinantes.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les protéines associées au magnétisme. Commençons donc au début de ce protocole. La protéine MAME Delta 41 est exprimée sous forme d'une protéine de fusion 10 hiss.Dans des cellules BL21 E. coli, cultiver les cellules dans un milieu d'induction automatique contenant de l'Epi Brazilin à 310 K pendant trois heures. Ensuite, abaisser la température de culture à 300 K et laisser les cellules incuber pendant 48 heures. Après l'incubation, récolter les cellules par centrifugation, décantation du surnageant et peser le culot cellulaire obtenu.Huit litres de culture devraient produire environ 60 grammes de culot cellulaire humide. Avant la purification des protéines, préparez 200 millilitres de solutions de tige contenant quatre molarités d'ile, cinq molarités de chlorure de sodium et une molarité de tris HCl à pH 8.À l’aide d’eau distillée doublement ou DDW, vortexer les solutions jusqu’à ce qu’elles deviennent limpides, puis les filtrer à l’aide d’un filtre de 0,22 micromètre. Filtrer les solutions mères fraîchement préparées, ainsi que les tampons A à F, comme décrit dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo. Pour commencer la purification des protéines, resuspendre les cellules dans le tampon A selon un rapport de un à deux entre la masse cellulaire et le volume de tampon.Pour chaque 10 grammes de bactéries, ajouter 10 microlitres d'ADN, un pour digérer tous les fragments d'ADN présents dans l'échantillon. Ensuite, ajouter un millilitre d'EDT, un cocktail inhibiteur de protéase gratuit. Pour chaque 20 grammes de bactéries, incuber la solution pendant 20 minutes sur de la glace.Après l'incubation, lyser les cellules à l'aide de deux cycles de pression française à 25 000 PSI. En raison de l'augmentation de la température, le piston doit être refroidi sur de la glace pendant 10 minutes avant utilisation. Transférer les cellules lysées dans des tubes d'ultracentrifugation de 25 millilitres.Remplissez les tubes jusqu’à la ligne du col avec le tampon A et équilibrez-les avec précision. Ensuite, séparez les débris cellulaires par ultracentrifugation. Pendant ce temps, montez une colonne à gradient au nickel NTA en ajoutant quatre millilitres de résine au nickel NTA sur une colonne en verre de 2,5 centimètres.Préparez la résine pour la purification des protéines conformément aux instructions du fabricant et de S. Une fois les échantillons centrifugés, versez la fraction soluble provenant des tubes d'ultracentrifugation sur la colonne au nickel NTA. Récupérez les protéines non liées dans la fraction d'écoulement.Continuer à laver la colonne avec 100 millilitres de tampon B et recueillir l'écoulement. Conserver les fractions d'écoulement à 277 K. Éluer la protéine dans 15 tubes Eppendorf numérotés de 1,5 millilitre. Fermer la vanne de la colonne et charger un millilitre de tampon C sur la colonne.Après un temps d'incubation de trois minutes, ouvrez la vanne et récupérez l'écoulement. Répétez cette étape trois fois. Continuez à éluer la protéine par ajouts successifs de un millilitre de tampon, sans incubation de trois minutes.À l'aide d'un spectrophotomètre UV, localisez le pic protéique dans les fractions en mesurant la densité optique à 280 nanomètres. Enfin, effectuez une analyse par électrophorèse SDS-PAGE des fractions recueillies. La protéine non liée passe dans l'éluat de lavage, le flux total et un échantillon de culot obtenu par ultracentrifugation provenant du gel.Déterminez quelles fractions éluées présentent des concentrations élevées de protéines, puis mélangez les fractions sélectionnées. Pour éliminer la marque à 10 histidines, ajoutez 10 microlitres de thrombine bovine par milligramme de protéine au prélèvement combiné. Ensuite, dialysez l'échantillon contre le tampon D afin d'éliminer l'excès d'imidazole et de réduire la concentration en chlorure de sodium.En prévision de la chromatographie d'échange d'ions, coupez un morceau de tubing dialysant d'un poids moléculaire de coupure de sept kilodaltons à la longueur souhaitée. Lavez le tubing avec de l'eau doublement distillée (DDW) et formez un sac en faisant un nœud à une extrémité. Transférez la solution protéique digérée par la thrombine dans le sac, en laissant un espace libre au sommet. Serrez l'extrémité du tubing dialysant avec une pince. Immergez le tube de dialyse dans quatre litres de tampon D refroidi. Après une dialyse effectuée toute la nuit, agitez lentement la solution pendant la nuit à 277 K, puis retirez le tube du bécher. Effectuez une petite incision et transférez la protéine dans un tube Falcon de 50 millilitres. Une chromatographie d'échange ionique est utilisée pour purifier davantage la protéine memay Delta 41. Connectez une colonne pré-remplie mono Q4 0,6 100 PE à un système de purification FPLC ACTA.Lavez la colonne avec cinq volumes de colonne (VC) d'eau doublement distillée filtrée, puis équilibrez la colonne avec cinq VC de tampon D. Lavez la boucle d'injection avec deux volumes de boucle d'eau doublement distillée, suivis de deux volumes de boucle de tampon D. Chargez la protéine dans la boucle d'injection. Injectez l'échantillon de protéine à un débit de un millilitre par minute et commencez à recueillir les fractions. Celles-ci seront utilisées pour la détection par électrophorèse SDS-PAGE des protéines non liées.Continuez à charger et à injecter la protéine jusqu'à ce que tout l'échantillon soit chargé sur la colonne. Lavez la colonne avec trois volumes de colonne de tampon D. Pour éliminer les protéines non liées, éluez la protéine sur une période de 60 minutes à un débit de un millilitre par minute, en utilisant un gradient linéaire de chlorure de sodium allant de 40 millimolaire à deux molaire. Récupérez les pics protéiques au fur et à mesure de leur apparition sur le chromatogramme à 280 nanomètres, une fois que 100 % du tampon E ont été atteints.Nettoyez la colonne prepec conformément aux recommandations du fabricant. Réalisez une analyse par électrophorèse SDS-PAGE des fractions FPLC recueillies, y compris les protéines non liées et les fractions de passage du pic protéique, en utilisant des marqueurs pré-étalonnés. Évaluez les bandes protéiques afin d'identifier les fractions contenant la protéine au poids moléculaire prédit de Mame.Fusionner les fractions sélectionnées en prévision de la chromatographie d'exclusion par taille. La concentration en chlorure de sodium des échantillons fusionnés est abaissée par dialyse contre le tampon f, comme décrit précédemment. Après une dialyse nocturne.Utilisez une centrifugeuse de table pour concentrer l'échantillon protéique à l'aide d'un concentrateur centrifuge doté d'une coupure de poids moléculaire de 10 000. Concentrez la protéine jusqu'à huit milligrammes par millilitre à 4 000 tr/min. Validez la concentration souhaitée en mesurant l'OD à 280 nanomètres dans une cuvette en quartz.Montez la colonne pré-remplie de taille 200 à exclusion par taille haute charge 26 60 superdeck sur un système de purification FPLC ACTO. Lavez la colonne avec trois volumes de colonne d'eau filtrée et équilibrez-la avec trois volumes de colonne du tampon F. Lavez la boucle d'injection avec deux volumes de boucle d'eau désionisée (DDW), suivis du même volume de tampon F. Une fois que la FPLC a été lavée et équilibrée, chargez l'échantillon protéique dans la boucle d'injection. Injectez l'échantillon protéique et commencez à recueillir les fractions correspondant au pic protéique au fur et à mesure de leur apparition sur le chromatogramme à 280 nanomètres.Laisser s'écouler le tampon jusqu'à atteinte du volume mort de la colonne. Nettoyer la colonne préremplie selon les recommandations du fabricant. Réaliser une analyse par électrophorèse SDS-PAGE des fractions recueillies et analyser le gel.La protéine doit apparaître au poids moléculaire prédit correct selon le marqueur de protéines présent et un seul bande doit être visible. Fusionner les fractions de protéine pures et concentrer l'échantillon de protéine à plus de 20 milligrammes par millilitre à l'aide d'un concentrateur centrifuge doté d'une coupure de poids moléculaire de 10 000 et d'une centrifugeuse de table. Valider la concentration souhaitée en mesurant l'OD à 280 nanomètres.Confirmez la pureté et l'identité de l'échantillon de MAME delta 41 à l'aide de la spectrométrie de masse par désorption/ionisation par laser assistée par matrice en mode D-tof. Enfin, divisez la protéine MAME delta 41 concentrée et purifiée en aliquotes dans des tubes Eppendorf préalablement étiquetés, avec un volume de 25 à 50 microlitres chacun. L'échantillon peut être congelé rapidement dans de l'azote liquide et stocké à 193 K. Ce protocole doit permettre d'obtenir un échantillon de protéine MAME Delta 41 concentré, très pur et homogène en taille. L'analyse par électrophorèse SDS-PAGE du profil d'élution sur colonne au nickel NTA révèle des concentrations élevées de la protéine memay delta 41 10 hiss dans les fractions élutées, d'une masse d'environ 22 kilodaltons.L'analyse par électrophorèse SDS-PAGE révélera également toute protéine MAME Delta 41 présente dans l'écoulement des protéines non liées, dans les fractions de lavage et dans l'échantillon du culot obtenu par ultracentrifugation. Si de fortes bandes apparaissent autour de 22 kilodaltons dans ces échantillons, un dépannage est nécessaire. Une chromatographie d'échange d'ions est réalisée afin de séparer la protéine MAME Delta 41 des autres protéines présentes dans l'échantillon par échange d'ions.Avec des concentrations croissantes de chlorure de sodium, le chromatogramme d'échange d'ions révèle une bonne séparation entre deux populations de protéines. L'analyse de concentration des échantillons par électrophorèse SDS-PAGE révèle la masse moléculaire de chaque population. Le premier pic correspond à MAME delta 41, tandis que le second pic correspond à la protéine MAME delta 41 10 hiss qui n'a pas été clivée par la thrombine bovine.Si la chromatographie d'échange d'ions ne permet pas d'obtenir des pics protéiques entièrement résolus, vérifiez la préparation des tampons et la pente du gradient de chlorure de sodium. La dernière étape de la purification de MAME delta 41 est la chromatographie d'exclusion stérique. Le chromatogramme révèle un pic unique éluant à 20 kilodaltons.La détermination de la taille appropriée du monomère de la protéine MAME Delta 41 par MALDI-TOF est effectuée afin de vérifier la protéine MAME delta 41 purifiée. Cette analyse révèle deux espèces, l'une représentant la protéine chargée simplement à 20 347 Daltons et l'autre représentant la protéine chargée doublement à 10 176 Daltons. La masse moléculaire prédite pour la protéine recombinante MAME delta 41 après retrait de la marque histidine est de 20 597 Daltons.La faible différence de 250 Dalton peut être due à la dégradation courante de la première méthionine au niveau de la deuxième glycine. Les résultats révèlent une protéine MAME delta 41 fortement purifiée. Elle peut être utilisée pour des expériences ultérieures.Nous venons de vous montrer comment purifier une protéine recombinante de syllabine. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'ajuster les tampons à vos protéines spécifiques et d'effectuer ces expériences aussi rapidement que possible. Voilà donc tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Collecte, l&#39;isolement et l&#39;enrichissement des bactéries présentes naturellement magnétotactique de l&#39;Environnement

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Apprenez la purification de la protéine MamAΔ41 associée aux magnétosomes chez Magnetospirillum magneticum AMB-1. Ce protocole combine chromatographie d'affinité, échange d'ions et exclusion stérique pour obtenir une protéine pure et homogène.

Purification de la M. magneticum Strain AMB-1 Protein magnétosome Associated MamAΔ41

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