Enregistrements tableau multiélectrodes de l'épithélium Vomeronasal

Des réseaux planaires à plusieurs électrodes sont utilisés pour enregistrer à partir de l’organe nasal UL. Le VNO est retiré de la souris de sorte que le neuroépithélium reste intact. Tout d’abord, la capsule VNO est retirée de la souris.

Ensuite, le neuroépithélium est isolé de la capsule osseuse, du vaisseau sanguin et de la lame basale. Le tissu est placé dans le MEA avec le bouton dendritique vers le haut. Une fois cette configuration terminée, nous utilisons un bras robotique pour administrer des stimuli liquides aux tissus.

Bonjour, je m’appelle Hannah Arnon et je travaille dans le laboratoire de Tim Fully au Département d’anatomie et de neurobiologie de la Faculté de médecine de l’Université de Washington. Je suis Cheyenne Fu, également du laboratoire sacré. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’enregistrement multi-électrodes de l’organe nasal en V.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les propriétés sensorielles ou les neurones récepteurs dans le système accessoire. Alors commençons. Les enregistrements électriques sont obtenus à l’aide d’un réseau planaire de multiélectrodes ou de MEA avec des électrodes plates en nitrure de titane de 10 micromètres isolées au nitrure de silicium.

60 électrodes sont disposées en deux champs constitués d’une grille de cinq par six avec un espacement centre à centre de 30 micromètres. À l’aide d’un amplificateur MEA 10 60, les signaux électriques sont amplifiés. Des signaux de 1000 fois sont nécessaires à 10 kilohertz.

À l’aide d’une carte d’acquisition de données et d’un logiciel d’acquisition de données personnalisé, le tissu est maintenu sur le MEA par un treillis en nylon, qui est attaché à un insert personnalisé, qui s’adapte parfaitement à l’intérieur de la culture. Pour apporter la MEA, maintenant que nous avons vu les mesures, voyons comment faire la dissection VNO. Avant d’effectuer la dissection, remplissez le puits de MEA avec de l’albumine sérique bovine ou de la BSA, rincez ensuite le MEA à l’aide d’une solution de sonnette chaude à bulles et placez-le sur de la glace.

Pour vous préparer à la dissection, remplissez deux boîtes de Pétri de 60 x 15 millimètres avec une solution de sonnerie à bulles et placez-les sur de la glace. Remplissez également deux boîtes de Pétri recouvertes d’un protège-seuil de la même taille avec une solution de sonnerie et placez-les sur de la glace. Réfrigérez 50 millilitres supplémentaires de bagues à bulles pour les utiliser pendant la dissection.

Commencez avec une souris sacrifiée en faisant des incisions bilatérales du côté de la bouche parallèlement à la mâchoire jusqu’à l’arrière de la tête. Joignez les deux entailles le long de la nuque et retirez la partie dorsale de la tête, en laissant la mâchoire inférieure attachée à la souris à l’aide de ciseaux fins. Coupez entre le tissu et l’un ou l’autre côté de l’os supérieur de la mâchoire pour séparer le tissu de l’os.

Ensuite, utilisez la pince numéro trois pour décoller le tissu du palais, en exposant la cavité nasale à l’aide de petits ciseaux ou d’un scalpel coupé entre et de chaque côté des deux dents de devant supérieures pour libérer la capsule nasale vulnérable de l’os à l’aide de la pince numéro trois. Ramassez la capsule nasale vulnérable par l’os plat et placez-la dans la boîte de Pétri sur de la glace. Les étapes précédentes par immersion du VNO dans des sonneries réfrigérées doivent être effectuées en moins de trois minutes.

Pour éviter la mort des tissus, placez la parabole sous un stéréomicroscope éclairé par une lumière réfléchie. Utilisez la pince numéro trois pour retirer la capsule osseuse d’un VNO à la fois. Utilisez une main pour stabiliser la capsule osseuse en la saisissant par l’extrémité du carpolot, et l’autre main pour retirer l’os du VNO en prenant soin de ne pas endommager le VNO.

Une fois l’os retiré, transférez le v et le o dans une boîte de Pétri enrobée de cigare. Utilisez le reste du plat pour l’autre VNO. Passez à l’éclairage en utilisant la lumière transmise à l’aide de micro-ciseaux.

Ou la pince numéro cinq. Séparez le VNO du vaisseau sanguin en coupant le long du bord du VNO. À ce stade, vous aurez la feuille neurale complètement séparée du vaisseau sanguin.

Placez le VNO avec le côté interne vers le haut à l’aide de la pince numéro trois. Ancrez le VO à la protection en S dans un coin du tissu à l’aide d’un petit fragment d’une lame de rasoir recouverte de téflon maintenue par une pince. Pelez l’épithélium neural de la lame basale en tenant la lame à un angle peu profond à moins de 30 degrés de la surface de la boîte.

Fonctionne le mieux. À l’aide d’une pipette en verre. Transférez le morceau d’épithélium neural de la parabole à la MEA, positionnez le VNO au-dessus du champ d’électrodes avec le côté dendritique vers le haut.

Retirez l’excès de solution de bague à l’aide d’une pipette, puis placez le porte-tissu en maille dans le puits du réseau pour maintenir le vno en place. Remplissez le puits avec une solution de sonnerie réfrigérée avec dissection terminée. Pour commencer une session d’enregistrement, placez le MEA dans un amplificateur MEA 10 60 et positionnez la sonde chauffante directement au-dessus du tissu pour confirmer que la chauffe est correcte.

Stimulation du placement de la sonde avec une solution de sonnerie contenant 50 millimolaires de potassium pendant deux secondes. Ajustez le positionnement pour minimiser la latence de la réponse neuronale à la solution de potassium. Le tissu nécessite une superfusion continue, ce qui est réalisé en fournissant une solution de bague à partir d’une pompe HPLC.

Fusionnez le tissu avec une solution de sonnerie chauffée pendant 45 minutes à une heure avant l’enregistrement pour permettre au tissu de s’acclimater. Les stimuli sont délivrés à l’aide du bras robotique Gilson two 15 liquid handler. Ils sont présentés en effectuant des injections dans une valve HPLC et en basculant entre le débit et la boucle Sous le contrôle du logiciel Gilson, le bras robotique délivre les stimuli à la ligne de profusion tout en maintenant un débit et une pression constants.

L’état de la vanne HPLC est représenté par une tension électrique, qui est enregistrée par l’ordinateur d’acquisition comme un canal supplémentaire. Pour assurer la synchronisation avec l’activité neuronale, les signaux électriques sont enregistrés sur disque à l’aide d’un logiciel d’enregistrement personnalisé. Nous allons maintenant vous montrer quelques résultats représentatifs du réseau multi-électrodes VNO. Enregistrement.

Cette procédure produit de grandes quantités de données en raison du grand nombre d’électrodes, et la préparation reste généralement stable pendant environ six heures. Voici un exemple de 400 millisecondes de données provenant de la moitié de la MEA. Cette procédure est utile pour mesurer la réponse des neurones sensoriels aux ligands montrés ici est la réponse à de l’urine de souris femelle 100 fois diluée enregistrée à partir d’une seule électrode.

L’urine a été délivrée pendant 10 secondes comme indiqué par la barre noire. Notez l’augmentation du déclenchement après la présentation d’un stimulus. Nous venons de vous montrer comment effectuer des enregistrements multi électro array sur la souris VNO lors de l’exécution de cette procédure.

Il est important de ne pas oublier d’être patient. Donc c’est tout. Merci de votre visionnage et bonne chance dans vos expériences.