Name: Enregistrements tableau multiélectrodes de lépithélium Vomeronasal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-01T16:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Apprenez l'enregistrement multiélectrode de l'épithélium vomeronasal chez la souris. Cette méthode utilise un bras robotique pour administrer des stimuli liquides et étudier l'activité neuronale sensorielle.

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Nous tenons à remercier les membres du Laboratoire Saint. Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national des troubles Surdité et Communication (R01 DC005964 à LA) et NSF IGERT 0548890 (AHA). Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les lois des États-Unis la protection des animaux et des National Institutes of Health et de directives ont été approuvées par les soins des animaux de Washington University et le Comité d&#39;utilisation.

Partie 1. Instrumentation enregistrement électrique <ol><li> Nous utilisons un large multiélectrodes planaires (ALA Scientific Instruments) avec 10 um électrodes plates de nitrure de titane isolé avec du nitrure de silicium. 60 électrodes sont disposées dans deux domaines constitué d'un quadrillage 5x6 avec le centre à centre espacement de 30 um. (D'autres configurations sont également possibles; électrodes avec une surface d'enregistrement 10 m de diamètre sont mieux que les grandes électrodes en termes d'isoler l'activité des neurones individuels.) </li><li> Les signaux électriques sont amplifiées (amplification 1000x) en utilisant un amplificateur de MEA 1060 (ALA Scientific Instruments). Les signaux sont acquis à 10 kHz en utilisant une carte d'acquisition de données (National Instruments) et de logiciels personnalisés d'acquisition de données (on peut également acheter des logiciels commerciaux). </li><li> Le tissu est maintenu sur l'AEM par un filet de nylon (53 um), qui est attaché à une insertion personnalisé qui s'adapte parfaitement à l'intérieur de l'anneau tubulaire de la culture de la MEA. </li></ol> Partie 2. Instrumentation distribution de liquide <ol><li> Le tissu nécessite surfusion continue, que nous garantissons en fournissant une solution de Ringer (115 de chlorure de sodium mM, 5 mM de chlorure de potassium, 2 chlorure de calcium mm, 2 de chlorure de magnésium mm, 25 bicarbonate de sodium mM, 10 mM d'HEPES et 10 mM de D-(+ )-glucose) à partir d'une pompe HPLC. Les stimuli sont présentés en effectuant des injections dans une vanne de CLHP et de commutation entre les actions accréditives et de la boucle. Tant la pompe HPLC et seringue d'injection du robot sont fournis avec la solution de Ringer. </li><li> La solution de Ringer est maintenu dans un bain d'eau chauffée (ISOTEMP 105) à 42 ° C toute l'expérience et est continuellement à barboter avec 95% d'O 2 / 5% CO 2. Un ballon séparé de Ringer sans glucose est préparé pour la sauvegarde de la pompe à seringue. Solution de Ringer est délivrée au tissu en utilisant une pompe HPLC 307 (Gilson) à un taux de 3 ml / min. Dans un typique 5-6 expérimentation heures, 1 L de solution de Ringer chaque est suffisante. </li><li> Tout au long de l'expérience, le tissu est continuellement perfusées avec 37 ° C une solution de Ringer. Une sonde radiateur est positionné directement au-dessus du tissu. </li><li> Les stimuli sont livrés avec le bras de Gilson 215 Handler liquide robotisé. Les stimuli sont stockés dans des flacons en verre de caoutchouc plafonnés, et sous le contrôle des logiciels de Gilson, le bras robotique fournit les stimuli à la ligne de perfusion alors que le taux de débit et pression constantes sont maintenues. </li><li> L'état de la vanne HPLC (boucle engagés / non engagé) est représenté par une tension électrique, qui est enregistré par l'ordinateur d'acquisition comme un canal supplémentaire pour assurer la synchronisation avec l'activité neuronale. </li></ol> Partie 3. Préparation de la MEA et dispositif de livraison de stimulation <ol><li> Avant de procéder à la dissection, remplissez le MEA bien avec BSA dans dH2O pendant au moins 5 minutes à température ambiante. </li><li> Rincez à l'aide de la MEA warm-buller solution de Ringer et le lieu de la MEA sur la glace. </li><li> Premier gestionnaire de liquide et pompe HPLC selon les instructions du fabricant. </li></ol> Partie 4. Dissection VNO <ol><li> Avant d'effectuer la dissection, remplissez 2 60x15 mm boîtes de Pétri avec une solution de Ringer et barbotage placer sur la glace. Remplissez également deux Sylgard revêtement des boîtes de Petri de la même taille avec une solution de Ringer et le placer sur la glace. Réfrigérer une 50mL supplémentaire de warm-buller Ringer pour une utilisation lors de la dissection. </li><li> La souris est sacrifiée par asphyxie CO 2 suivie par dislocation cervicale. </li><li> Faire des incisions bilatérales du côté de la bouche, parallèle à la ligne de la mâchoire, à l'arrière de la tête. Rejoignez les deux coupes le long du dos de la nuque et retirez la partie dorsale de la tête, laissant la mâchoire inférieure attachée à la souris. </li><li> Avec des ciseaux fins, coupés entre le tissu et de chaque côté de l'os maxillaire supérieur pour séparer les tissus de l'os. </li><li> En utilisant une pince # 3, décoller le tissu palais à exposer la cavité nasale. </li><li> L'utilisation de petits ciseaux ou un scalpel, couper entre et de chaque côté de la tige 2 dents de devant pour libérer la capsule voméronasal de l'os. </li><li> En utilisant une pince # 3, ramasser la capsule voméronasal par l'os plat et le placer dans la boîte de Pétri sur la glace. Les étapes à travers l'immersion devrait être effectué en moins de 3 minutes. </li><li> Placer le plat sous un stéréomicroscope, éclairé par la lumière réfléchie. Retirez la capsule osseuse d'un VNO à un moment à l'aide n ° 3 pinces. Utilisez une main pour stabiliser la capsule osseuse par serrage de l'extrémité caudale et l'autre main pour éplucher l'os loin du VNO, en prenant soin de ne pas endommager le VNO. </li><li> Lorsque l'os est enlevé, le transfert du VNO à une boîte de Pétri Sylgard couché. Utilisez le plat reste pour le VNO autres. Mettre l'éclairage à lumière transmise. </li><li> L'utilisation de micro-ciseaux ou # 5 forceps, séparer le VNO à partir du vaisseau sanguin en coupant le long du bord de tIl VNO. À ce stade, vous aurez la feuille de neurones complètement séparé du vaisseau sanguin. </li><li> Placez le VNO à la place de côté (dendritiques) interne. En utilisant une pince # 3, ancrer le VNO à l'Sylgard à un coin du tissu. Peler l'épithélium neuronal de la lame basale en utilisant un petit fragment d'une lame de rasoir en téflon tenue avec une pince. En tenant la lame à un angle faible (&lt;30 ° de la surface de plat) est le meilleur. </li><li> En utilisant une pipette en verre, le transfert de la pièce de l'épithélium neural de l'antenne à l'AEM. Position du VNO sur le dessus de l'électrode sur le terrain avec le côté jusqu'à dendritiques. Retirer l'excès de solution de Ringer avec une pipette. Placez le porte-mailles du tissu dans le puits de la matrice de tenir le VNO en place, et le remplir d'une solution de Ringer réfrigérée est. </li></ol> Partie 5. Enregistrement <ol><li> Placez la MEA dans un MEA 1060 amplificateur et la position de la sonde chauffe directement au-dessus du tissu. </li><li> Pour confirmer le placement correct de sonde de chauffage, de stimuler avec une solution de Ringer contenant 50 mM de potassium (substitué pour le sodium équimolaire) pendant 2 secondes. Ajustez le positionnement de minimiser la latence de la réponse neuronale à la solution de potassium. </li><li> Superfuse le tissu avec une solution de Ringer chauffée pendant 45 minutes à 1 heure avant l'enregistrement pour permettre au tissu de s'acclimater. </li><li> Les signaux électriques sont sauvegardées sur le disque en utilisant un logiciel d'enregistrement personnalisés. </li></ol> Partie 6. Analyse des données <ol><li> Hors analyse des données peut être fait en utilisant les enregistrements d'électrode premières. Par exemple, nous mesurons les changements cadence de tir de cellules enregistrées en réponse à des ligands particulier. Les ensembles de données qui en résultent sont grands et peuvent être utilisés pour traiter de nombreuses questions différentes; familiarité avec un langage de programmation ou d'analyses (C, Matlab, R, Python, ou similaire) est nécessaire. </li></ol> Partie 7. Les résultats représentatifs Cette préparation est généralement assez stable pour enregistrer à partir de 6 heures, ce qui donne une grande quantité de données (6 heures d'enregistrement de 60 électrodes). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig1tmb.jpg" alt="Figure 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"></a> Figure 1. Un instantané de l'activité simultanée à travers une moitié du tableau est montré. La fenêtre de temps s'étend de 400 ms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig2tmb.jpg" alt="Figure 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"></a> Figure 2. Dans une expérience typique, nous stimulons par des composés d'intérêt particulier pour les 10 secondes. Cette trace est un exemple d'une réponse à 100 fois l'urine de souris dilué femelle.

<ol><li>Dulac, C., Torelo, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals%3A+from+genes+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li>
<li>Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+Vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Responses of Vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li>
<li>Nodari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfated+steroids+as+natural+ligands+of+mouse+pheromone-sensing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons.</a> J Neurosci. 28, 6407-6418 (2008).</li>
</ol>

Enregistrements array multiélectrodes nous permettent la possibilité de surveiller l&#39;activité simultanée d&#39;une population importante de neurones. C&#39;est un outil utile pour sonder les propriétés d&#39;un système sensoriel, en particulier le VNO. Contrairement au système olfactif principal, le VNO détecte les stimuli en phase liquide. En outre, le VNO est un tissu hétérogène. Il ya environ 300 types différents de récepteurs chez la souris une, sans doute avec des profils de réponse différents. Enreg...

enregistrements tableau multiélectrodes de l&#39;épithélium vomeronasal

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Comprendre les circuits neuronaux nécessite des méthodes pour enregistrer à partir de nombreux neurones simultanément. Pour<em&gt; In vitro</em&gt; Les études, une seule technologie actuellement disponible est planaire array multiélectrodes (MEA) d&#39;enregistrement. Ici, nous documenter l&#39;utilisation des AME pour étudier la souris voméronasal organe (VNO), qui joue un rôle essentiel dans la détection des phéromones et des indices sociaux via une population diversifiée de neurones sensoriels exprimant des centaines de types de récepteurs. Combinant l&#39;enregistrement MEA avec un gestionnaire robotique de liquide pour administrer des stimuli chimiques, les réponses sensorielles d&#39;une population importante et diversifiée de neurones peuvent être enregistrées. La préparation nous permet d&#39;enlever le neuroépithélium intacte du VNO de la souris et stimuler avec une batterie de produits chimiques ou des ligands potentiels tout en surveillant l&#39;activité électrique des neurones pendant plusieurs heures. Par conséquent, cette technique sert comme une méthode utile pour évaluer l&#39;activité du ligand ainsi que d&#39;explorer les propriétés des neurones récepteurs. Nous présentons les techniques nécessaires pour préparer l&#39;épithélium voméronasal, l&#39;enregistrement des AEM, et une stimulation chimique.

Multiélectrodes array (MEA) enregistrements fournissent une méthode pour étudier l&#39;activité électrique des grandes populations de neurones. Ici, nous présentons les détails d&#39;une préparation de la MEA pour enregistrer à partir de l&#39;épithélium de souris voméronasal tout en stimulant le tissu.

Enregistrements tableau multiélectrodes de l&#39;épithélium Vomeronasal

La compréhension des circuits neuraux nécessite des méthodes permettant d'enregistrer l'activité de nombreux neurones simultanément. Pour les études in vitro, l'une des technologies actuellement disponibles est...

Des réseaux plats de microélectrodes sont utilisés pour enregistrer l'activité de l'organe nasal UL. Le VNO est prélevé de la souris de manière à ce que l'épithélium neurosensoriel reste intact. Premièrement, la capsule du VNO est retirée de la souris.Ensuite, l'épithélium nerveux est isolé de la capsule osseuse, des vaisseaux sanguins et de la lame basale. Le tissu est placé sur la MEA avec le côté du bourgeon dendritique orienté vers le haut. Une fois ce montage terminé, nous utilisons un bras robotisé pour administrer des stimuli liquides au tissu.Bonjour, je suis Hannah Arnon du laboratoire de Tim Wholly, Département d'anatomie et de neurobiologie à l'École de médecine de l'Université de Washington. Je suis Cheyenne Fu, également du laboratoire Holy. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'enregistrement par réseau de microélectrodes de l'organe voméro-nasal.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les propriétés sensorielles ou les neurones récepteurs du système atoire accessoire. Commençons donc. Les enregistrements électriques sont obtenus à l’aide d’un réseau plan de microélectrodes, ou MEA, comportant des électrodes plates en nitrure de titane de 10 micromètres, isolées par du nitrure de silicium.Soixante électrodes sont disposées en deux champs constitués d'une grille de cinq par six, avec un espacement centre à centre de 30 micromètres. À l'aide d'un amplificateur MEA 10 60, les signaux électriques sont amplifiés. Des signaux amplifiés 1000 fois à 10 kilohertz sont requis.À l'aide d'une carte d'acquisition de données et d'un logiciel personnalisé d'acquisition de données, le tissu est maintenu contre la MEA par un filet en nylon, qui est fixé à un insert sur mesure s'ajustant parfaitement à l'intérieur de la culture. Pour passer à l'utilisation de la MEA, maintenant que nous avons vu les MEA, voyons comment réaliser la dissection du VNO. Avant d'effectuer la dissection, remplissez le puits de la MEA avec de l'albumine de sérum bovin ou BSA, rincez ensuite la MEA à l'aide d'une solution de Ringer tiède et oxygénée, puis placez-la sur de la glace.Pour préparer la dissection, remplissez deux boîtes de Pétri de 60 par 15 millimètres avec une solution de Ringer saturée en bulles et placez-les sur de la glace. Remplissez également deux boîtes de Pétri de même taille recouvertes de sill guard avec de la solution de Ringer et placez-les sur de la glace. Refroidissez en outre 50 millilitres supplémentaires de solution de Ringer saturée en bulles destinée à être utilisée pendant la dissection.Commencez par un rat sacrifié en effectuant des incisions bilatérales depuis les côtés de la bouche, parallèlement à la ligne de la mâchoire, jusqu’à l’arrière de la tête. Reliez les deux incisions à l’arrière du cou et retirez la partie dorsale de la tête, en laissant la mâchoire inférieure attachée au rat à l’aide de ciseaux fins. Incisez entre le tissu et chaque côté de l’os maxillaire supérieur afin de séparer le tissu de l’os.Ensuite, utilisez une pince n°3 pour détacher le tissu du palais, en exposant la cavité nasale à l’aide de petites ciseaux ou d’un scalpel en incisant entre et de chaque côté des deux incisives supérieures afin de libérer la capsule nasale fragile de l’os à l’aide de la pince n°3. Saisissez la capsule nasale fragile par l’os plat et placez-la dans la boîte de Pétri sur glace. Les étapes précédentes, jusqu’à l’immersion du VNO dans la solution de Ringer froide, doivent être réalisées en moins de trois minutes.Pour éviter la nécrose du tissu, placez la boîte sous un microscope stéréo éclairé avec une lumière réfléchie. Utilisez une pince de numéro trois pour retirer la capsule osseuse d'un organe voméronasal (VNO) à la fois. Stabilisez la capsule osseuse en la tenant par l'extrémité caudale d'une main, et de l'autre main, détachez délicatement l'os de l'organe voméronasal en prenant soin de ne pas endommager ce dernier.Une fois l'os retiré, transférez le v et le o dans une boîte de Pétri recouverte de cellophane. Utilisez l'autre boîte pour le second VNO. Passez à l'éclairage en lumière transmise à l'aide de ciseaux microchirurgicaux.Ou une pince numéro cinq. Séparez l'organe voméronasal du vaisseau sanguin en coupant le long du bord de l'organe voméronasal. À ce stade, vous aurez complètement séparé la feuille nerveuse du vaisseau sanguin.Placer le VNO avec le côté interne vers le haut à l’aide de la pince numéro trois. Fixer le VO au garde S à un coin du tissu à l’aide d’un petit fragment de lame de rasoir revêtue de téflon maintenu par une pince. Détacher l’épithélium nerveux de la lame basale en tenant la lame selon un angle faible inférieur à 30 degrés par rapport à la surface de la boîte. Fonctionne le mieux. À l’aide d’une pipette en verre, transférez le fragment d’épithélium neural de la boîte vers la MEA et positionnez le VNO au-dessus du champ d’électrodes avec le côté dendritique vers le haut.Retirez la solution de Ringer en excès à l’aide d’une pipette, puis placez le support de tissu en treillis dans le puits de la matrice afin de maintenir le VNO en position. Remplissez le puits avec de la solution de Ringer froide une fois la dissection terminée. Voyons comment enregistrer. Pour commencer une session d’enregistrement, placez la MEA dans un amplificateur MEA 10 60 et positionnez la sonde chauffante directement au-dessus du tissu afin de vérifier le bon fonctionnement du chauffage.Placer la sonde en stimulant avec une solution de Ringer contenant 50 millimolaire de potassium pendant deux secondes. Ajuster le positionnement afin de minimiser la latence de la réponse neuronale à la solution de potassium. Le tissu nécessite une superfusion continue, réalisée en fournissant une solution de Ringer à partir d'une pompe HPLC.Fusionner superficiellement le tissu avec une solution de Ringer chauffée pendant 45 minutes à une heure avant l'enregistrement, afin de permettre au tissu de s'acclimater. Les stimuli sont administrés à l'aide du bras robotique Gilson deux 15 manipulateur de liquides. Ils sont présentés en effectuant des injections dans une vanne HPLC et en alternant entre le passage direct et la boucle, sous le contrôle du logiciel Gilson. Le bras robotique délivre les stimuli dans la ligne de perfusion, tandis qu'un débit et une pression constants sont maintenus.L'état de la vanne HPLC est représenté par une tension électrique, qui est enregistrée par l'ordinateur d'acquisition comme un canal supplémentaire. Afin d'assurer la synchronisation avec l'activité neuronale, les signaux électriques sont sauvegardés sur le disque à l'aide d'un logiciel d'enregistrement personnalisé. Nous allons maintenant vous montrer quelques résultats représentatifs de l'enregistrement par matrice de microélectrodes du NOV.Cette procédure produit de grandes quantités de données en raison du grand nombre d'électrodes, et le montage reste généralement stable pendant environ six heures. Voici un exemple de 400 millisecondes de données provenant d'une moitié de la MEA. Cette procédure est utile pour mesurer la réponse des neurones sensoriels aux ligands ; ci-dessous figure la réponse à de l'urine de souris femelle diluée cent fois, enregistrée à partir d'une seule électrode.L'urine a été délivrée pendant 10 secondes, comme indiqué par la barre noire. Remarquez l'augmentation de la fréquence de décharge après la présentation du stimulus. Nous venons de vous montrer comment effectuer des enregistrements multiples par réseau d'électrodes sur l'organe voméro-nasal de la souris lors de cette procédure.Il est important de garder à l'esprit qu'il faut être patient. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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