Dosage de la capacité des molécules de signalisation diffusibles à réorienter embryonnaires épinière axones commissuraux

Des explants de la moelle épinière dorsale sont disséqués à partir d'embryons de rat et cultivés dans un collagène tridimensionnel. Le gel est placé en opposition avec des cellules exprimant une molécule de signalisation candidate. La capacité de la molécule de signalisation à réorienter les axones en croissance au sein de l'explant spinal dorsal est évaluée par immunohistochimie.

Bonjour, je suis Virginia Hazen du laboratoire de Samantha Butler du département des sciences biologiques de l'Université de Californie du Sud. Je suis Keith Fun, également du laboratoire Butler. Et je suis Ken Ya Mai du laboratoire Butler.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de culture d'implants spinaux dorsaux et d'agrégats de cellules cost transfectées dans une matrice de collagène. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour évaluer la capacité de molécules candidates, appelées molécules de guidage, à orienter les neurones spinaux commissuraux. Dans cette expérience, nous examinerons la capacité de la protéine morphogénétique osseuse, ou BMP-7, à agir comme un chimiorépulsif.

Commençons. Préparez des agrégats de cellules co utilisés pour tester la trajectoire des axones commissuraux choraux provenant des cellules co. Transfectés avec le plasmide d'expression pour la molécule d'intérêt ici, la protéine morphogénétique osseuse ou BMP7.

Aspirez le milieu de la boîte et rincez les cellules avec un millilitre de PBS 1×. Éliminez le PBS et traitez les cellules avec un demi-millilitre de milieu de dissociation cellulaire sans enzyme pendant 15 minutes. Arrêtez la réaction en ajoutant un millilitre de milieu contenant du sérum de veau fœtal.

À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, passer les cellules en itérant jusqu’à ce qu’il n’en reste aucune sur la surface de la boîte de culture. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger pendant deux minutes. À 2000 tr/min, éliminer le surnageant et pipeter plusieurs fois de haut en bas pour resuspendre les cellules.

Dans 100 microlitres de milieu, déposez plusieurs gouttes de 20 microlitres de la solution cellulaire sur la face interne du couvercle d'une boîte de culture de 35 millimètres. Fermez le couvercle sur la boîte et placez-le dans l'incubateur pendant plusieurs heures afin de permettre l'agrégation des cellules. Pour préparer les implants de la moelle épinière dorsale, conservez-les frais après prélèvement.

Des embryons de rat E11 sur de la glace. Dans du milieu L15, à l’aide d’une aiguille en tungstène aiguisée, prélever une section de quatre à six somites à partir de la région tronculaire située juste en dessous du bourgeon du membre antérieur de chaque embryon. À l’aide d’une pipette en plastique, recueillir le tissu dans un puits d’une plaque de quatre puits.

Bien sûr, aucune boîte de Pétri sur glace. Lorsque tous les segments ont été disséqués, utilisez la pipette pour transférer les morceaux dans un deuxième puits de la boîte de Pétri contenant du milieu L 15 additionné de pâte à disque. Incubez le tissu à température ambiante pendant pas plus de cinq minutes.

Pour éviter la mort cellulaire, ne pas trop digérer le tissu. Ajouter un millilitre de milieu L 15 frais avec 5 % de sérum de chèvre inactivé par la chaleur dans le troisième puits de la plaque. Puis transférer les fragments de tissu dans ce puits.

À la fin de l'incubation dans l'espace de dissociation, laissez le tissu reposer sur de la glace pendant une heure. Pour faciliter la dissection ultérieure dans un tube de microcentrifugeuse, ajoutez 40 microlitres de milieu minimum essentiel 10 x à 360 microlitres de collagène. Et vortexez brièvement pour mélanger, puis centrifugez dans une microcentrifugeuse.

La solution sera jaune et doit être conservée sur de la glace autant que possible afin d'empêcher la prise du collagène. Pour chaque lot de collagène, ajouter une quantité de bicarbonate de sodium 0,8 molaire permettant de rendre la solution de collagène légèrement orangée. Mélanger la solution après chaque ajout. Lorsque la solution de collagène atteint cette couleur, elle restera liquide si elle est maintenue sur glace, mais sera prête à gélifier lorsqu'elle sera portée à température ambiante. Si la solution devient rose après mélange, recommencer avec un nouveau tube de collagène. Déposer 20 microlitres de collagène dans chaque puits d'une plaque propre à quatre puits sans milieu.

À l’aide de l’extrémité de la pipette, étaler le collagène pour former un petit tampon. Laisser le collagène prendre à température ambiante pendant environ 10 minutes. Sous le microscope stéréo, utiliser une aiguille au tungstène fraîchement aiguisée et une pince fine pour retirer à l’aide de l’aiguille au tungstène le mésoderme entourant la moelle épinière d’un embryon, puis enlever la partie ventrale de la moelle épinière, identifiable par la présence de la plaque du plancher.

À l'extrémité ventrale, la lame basilaire est légèrement plus épaisse que la lame dorsale située au bord dorsal. Dans cet exemple, la moelle épinière est orientée avec le côté ventral vers le bas. Coupez soigneusement le tissu en travaillant parallèlement à la lame basilaire et éliminez le cinquième ventral de la moelle épinière.

Utilisez l'aiguille pour diviser verticalement en deux le lambeau de moelle épinière dorsale. Veillez à ce que les bords soient coupés le plus proprement possible et recoupez-les au besoin. Utilisez une pipette buccale équipée d'un tube capillaire en verre de 0,5 millimètre de diamètre pour transférer chaque lambeau x sur un coussinet de collagène séparé.

Avec l'aiguille en tungstène, découper l'agrégat de cellules co-transfectées en carrés d'une largeur approximativement équivalente à celle du bord latéral de la moelle épinière dorsale. Explication. Utiliser une pipette à bouche pour transférer l'un des carrés sur le tampon de collagène avec l'x explication. Utiliser la pipette à bouche pour aspirer tout liquide excédentaire.

Ne pas trop aspirer, car une petite quantité de liquide facilitera l'application ultérieure de collagène ; appliquer quatre microlitres de collagène activé sur le tampon. Utiliser l'aiguille en tungstène pour déplacer le collagène au-dessus des implants sans toucher directement le tissu. En déplaçant l'aiguille dans le collagène, orienter chaque x explan de manière à ce que l'agrégat de cellules co soit adjacent à sa bordure latérale.

Laisser la collagène prendre pendant 15 à 20 minutes. Répéter le processus d'application avec quatre microlitres supplémentaires de collagène afin de s'assurer que l'explant x est complètement entouré de collagène avant de passer à l'embryon suivant dans une hotte de culture tissulaire avec 0,5 millilitre de milieu, puis cultiver pendant 30 à 40 heures. Dans une étuve placée dans une hotte aspirante, fixer les explants avec 0,5 millilitre de solution de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 45 minutes. Garder le tissu sur de la glace, puis rincer deux fois avec 0,5 millilitre de la solution de blocage et de perméabilisation.PBTN.

Incuber les explants x dans la solution de blocage à quatre degrés Celsius, de préférence toute la nuit. Utiliser des pinces pour retirer l'explant X du puits et placer chacun dans un puits d'une plaque de 48 puits.

Ajoutez 200 microlitres d'anticorps primaire dans chaque puits. Pour visualiser les axones commissuraux, utilisez l'anticorps anti-ttag de souris et, afin de déterminer si la transfection croisée entre cellules a réussi, incluez un anticorps dirigé contre la molécule testée. Incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Lavez chaque échantillon cinq fois dans la solution de blocage PBTN, chaque lavage durant une heure, à quatre degrés Celsius. Éliminez le PBTN et ajoutez 200 microlitres d'anticorps secondaire à chacun. Recouvrez la plaque de papier d'aluminium pour éviter la décoloration et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Lavez les échantillons cinq fois dans du PBTN comme précédemment. Transférez chaque explant sur une lame porteuse à trois cupules. Éliminez le milieu de montage excédentaire Invecta Shield et couvrez avec une lamelle.

Conserver les lames dans un dossier ou une boîte protégé de la lumière, à quatre ou à moins 20 degrés Celsius, jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être visualisées au microscope. Nous allons maintenant présenter quelques images représentatives d'explants X après leur culture, fixation, coloration et acquisition par microscopie confocale. Le panneau A montre qu'un explant X de la plaque du toit, délimité en blanc, peut réorienter les axones choraux positifs pour la marque tag un à l'écart de celle-ci, démontrant ainsi que la plaque du toit est la source d'un chimiorépulsif axonal. Le panneau B montre que les cellules CO sécrétant la molécule de signalisation M tact, la protéine morphogénétique osseuse ou BMP7, peuvent repousser les axones carcéraux de manière similaire à la plaque du toit.

Les axones des cellules ne sécrétant que le plasmide d'expression n'ont aucun effet sur l'orientation des axones. Nous venons de vous montrer comment disséquer, orienter et cultiver un explant de moelle épinière et provoquer l'agrégation de cellules afin de déterminer si une molécule de signalisation candidate possède une activité de réorientation des axones. Lors de cette procédure, il est important de garder le collagène sur glace le plus longtemps possible et d'entourer complètement l'explant de collagène afin qu'il n'entre pas en contact direct avec le milieu de culture.

Et enfin, cultiver uniquement pendant le temps nécessaire à l’allongement des axones jusqu’au bord ventral de l’exp. x. Voilà, c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.I.