Name: Dosage de la capacité des molécules de signalisation diffusibles à réorienter embryonnaires épinière axones commissuraux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Découvrez comment évaluer la capacité de la BMP7 à réorienter les axones commissuraux de la moelle épinière dorsale chez l'embryon de rat. Cette méthode utilise l'immunohistochimie pour visualiser la croissance axonale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce protocole a été développé dans les laboratoires de Jane Dodd, Thomas et Andrew Lumsden Jessell. Beaucoup de gens, y compris Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba et Toshiya Yamada déterminé comment la culture des explants de moelle épinière dans le collagène. Marysia Placzek et Marc Tessier-Lavigne pionnier de la technique d&#39;utilisation de la croissance axonale à partir dans des explants in vitro comme un moyen d&#39;identifier les molécules de guidage axonal. Le travail dans le laboratoire de Butler est soutenu par des subventions de la Mars of Dimes et R01 NS063999 du NIH / NINDS.

Partie 1: Préparation des agrégats de cellules COS transfectées avec gouttes suspendues <ol><li> COS-7 de semences (COS) des cellules dans des boîtes de culture de 35 mm. Quand ils atteignent 80% de confluence, 1 pg transfecter du plasmide d&#39;expression dans les cellules en utilisant Lipofectamine2000 selon le protocole du fabricant. </li><li> Pour préparer des gouttes pendantes, aspirer le milieu de transfection et rincer les cellules transfectées COS avec 1ml de solution tamponnée de phosphate 1x (PBS). Traiter les cellules avec 0,5 ml d&#39;enzyme sans dissociation cellulaire moyen pendant 15 minutes. Ajouter 1 ml d&#39;une solution d&#39;Opti-MEM + 1x pénicilline / streptomycine / glutamine (P / S / G) + sérum fœtal bovin 10% (FBS) pour arrêter la réaction. </li><li> Triturer les cellules pour les enlever de la surface de la boîte de culture et de transférer dans un tube 15ml conique. Spin 2 minutes à 2000K pour culotter les cellules. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 100 ul d&#39;Opti-MEM + 1x P / S / G de FBS + 10%. </li><li> Spot de plusieurs gouttes de 20 pi à l&#39;intérieur d&#39;un couvercle de boîte de culture 35mm, inverser le couvercle et placez-le sur le fond du plat et laisser dans un incubateur à 37 ° C pendant plusieurs heures jusqu&#39;à ce que les cellules agrégées. </li></ol> Partie 2: Préparation des explants dorsaux de la moelle épinière <ol><li> Disséquer embryons de rat E11 de l&#39;utérus de la mère et de garder sur la glace dans du milieu L15 jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Avec une aiguille de tungstène aiguisé, enlever un segment de l&#39;article 4-6 du tronc de chaque embryon, à partir de la région immédiatement en dessous de patte avant bourgeon. Avec une pipette en plastique, de recueillir les morceaux de tissus dans un puits d&#39;une antenne 4-même et de garder Nunc sur la glace. </li><li> Lorsque tous les segments d&#39;embryons ont été disséqués, utilisez la pipette en plastique pour transférer les morceaux dans une solution de 1ml L15 + 1mg dispase dans un deuxième puits de la vaisselle Nunc. Incuber à température ambiante pendant plus de 5 minutes. Ne pas trop incuber les morceaux de tissu avec de la dispase. </li><li> Durant l&#39;incubation, ajouter 0,5 ml de la chaleur du sérum de chèvre inactivé normal (HIGS) à environ 10ml de L15 dans une boîte de Pétri et agiter pour mélanger. Transfert 1ml de cette solution dans un troisième puits du plat Nunc et de transférer les morceaux de tissu dans cette solution lorsque l&#39;incubation est terminée. Restez sur la glace. Remarque: la dissection subséquente sera plus facile si les morceaux de tissu sont autorisés à «reposer» sur la glace pendant une heure. </li></ol> Partie 3: Collagène Amorçage <ol><li> Ajouter 40μl 10x milieu minimal essentiel au collagène 360μl, mélanger rapidement et complètement par agitation ou brièvement le tube de vortex. Isoler rapidement dans un picofuge. La solution sera jaune. Gardez sur la glace autant que possible. </li><li> Ajouter suffisamment bicarbonate de sodium 0,8 M (NaHCO 3) pour mettre la solution de collagène légèrement orangé (voir note ci-dessous). Encore une fois, mélanger rapidement et complètement en feuilletant, et centrifuger brièvement dans un picofuge. Si la solution reste rose après mélange, vous avez ajouté trop de NaHCO 3 et devrez recommencer avec un nouveau tube de collagène. </li><li> A ce point la solution de collagène est amorcée. Il restera liquide sur la glace, mais va se solidifier dans les 5 minutes (en tournant rose) lorsqu&#39;elle est amenée à température ambiante. </li><li> 20 pi spot de collagène dans chaque puits d&#39;un plat 4-même Nunc. En utilisant la pointe de votre pipette, étalé le collagène pour former un petit &quot;pavé&quot;. Laissez le collagène mis à température ambiante. </li></ol> Remarque: Le montant exact de NaHCO 3 devront être titré pour chaque lot de collagène. Démarrer faible (11μl), puis ajouter 0,5 1 microlitre par étapes jusqu&#39;à ce que la solution est une légère teinte d&#39;orange. La &quot;bonne&quot; quantité est généralement inférieure à la 1UL plus petite quantité de NaHCO 3, que ferait le rose de collagène. Le montant de NaHCO 3 n&#39;a pas d&#39;échelle linéaire vers le haut ou vers le bas. Partie 4: Dissection d&#39;explants dorsaux de la moelle épinière et le positionnement d&#39;entre eux avec des agrégats de cellules COS matrice collagène <ol><li> En utilisant une aiguille de tungstène fraîchement aiguisée et une paire de pinces fines (# 5 ou # 55), retirez le mésoderme qui entoure la moelle épinière. </li><li> Coupe parallèle à la plaque au sol avec l&#39;aiguille de tungstène, retirez soigneusement le cinquième ventrale de la moelle épinière. </li><li> Couper en deux l&#39;explant épinière dorsale, en s&#39;assurant que les bords sont aussi proprement que possible coupées. Re-découpez les bords, si nécessaire. Transfert chaque explant épinière dorsale sur coussinets collagène séparées utilisant une pipette bouche équipé d&#39;un tube capillaire en verre tiré à env. 0,5 mm de diamètre. </li><li> Couper l&#39;agrégat de cellules COS transfectées en carrés d&#39;environ la même largeur que le bord latéral de l&#39;explant épinière dorsale. </li><li> Transfert un de ces carrés sur le tampon de collagène avec l&#39;explant épinière dorsale, à l&#39;aide d&#39;une pipette bouche. </li><li> Avec la pipette la bouche, aspirer hors tout excès de liquide à l&#39;aide de la pipette bouche. Ne pas trop aspirer. </li><li> Appliquer 4μl de collagène amorcée sur le pavé,et, en utilisant l&#39;aiguille de tungstène, déplacez le collagène au cours de la explants, sans toucher directement les tissus. En déplaçant l&#39;aiguille de tungstène dans le collagène entourant les explants, orienter les explants de sorte que l&#39;ensemble des cellules COS est adjacent au bord latéral de l&#39;explant épinière dorsale. </li><li> Après le collagène a mis, répéter l&#39;application de 4μl de collagène afin de s&#39;assurer que les explants sont entièrement revêtus de collagène. </li><li> Dans une hotte de culture de tissus, ajouter 0,5 ml d&#39;Opti-MEM 1xP/S/G + et la culture pour 30-40 heures. </li><li> Fix explants pendant 45 minutes avec du paraformaldéhyde 4% dans 0,5 ml 1xPBS, en gardant la plaque sur la glace. </li><li> Laver deux fois avec 0,5 ml d&#39;une solution de blocage des 1xPBS + 0,1% de Triton-X100 HIGS 1% (PBTN). Bloc à 4 ° C pendant au moins une couple d&#39;heures, une nuit d&#39;incubation est préférable et ensuite traiter par immunohistochimie. </li></ol> Partie 5: Visualisation des axones commissuraux par immunohistochimie <ol><li> Après le blocage de PBTN, couper les explants de la plaque 4 et avec une pince et le placer dans un plat de 48 puits. </li><li> Ajouter 200 ul d&#39;anticorps primaires dans chaque puits et laisser une nuit à 4 ° C. Pour visualiser les axones commissuraux, utiliser une solution 1:6 de souris anti-Tag1 anticorps. Pour déterminer si la transfection a été un succès, incluent également un anticorps primaire contre la molécule de signalisation soit mis à l&#39;essai ou l&#39;épitope pertinente si la molécule de signalisation a été épitope étiqueté. </li><li> Lavez chaque échantillon de 5 x 1 heure dans PBTN à 4 ° C. </li><li> Ajouter 200 ul d&#39;anticorps secondaire dans chaque puits et laisser une nuit à 4 ° C. Si l&#39;anti-Tag1 anticorps ont été utilisés comme anticorps primaire, utiliser un anticorps de chèvre anti IgM de souris secondaire couplé à la FITC ou soit Cy3. Si vous utilisez sensible à la lumière des anticorps secondaire couplé à la FITC ou Cy3, garder le plat de 48 puits couvert de feuilles à partir de ce point. </li><li> Laver chaque échantillon de 5 x 1 heure chacune dans PBTN à 4 ° C. </li><li> Transfert explant à une diapositive de dépression 3-même, enlever l&#39;excès de liquide, monter dans Vectashield moyen et lamelle. Conserver dans une boîte de lumière sécuritaire soit à 4 ° C ou -20 ° C. </li></ol> Partie 6: des images représentatives de explants Dans une expérience réussie, l&#39;explant et globale COS restera adjacents les uns aux autres et ne pas dériver à part comme le collagène ensembles. Il y aura une prolifération minimale des axones; significative la prolifération axonale indique que l&#39;explant épinière dorsale a été cultivé pendant trop longtemps. Il n&#39;y aura pas de croissance des bulles de l&#39;explant; blebbing se produit si le tissu est en contact direct avec le milieu de culture. La capacité de la molécule de signalisation de réorienter les axones est évaluée en utilisant la microscopie confocale. L&#39;étendue de la réorientation axonale peut être quantifiée en mesurant l&#39;angle moyen de réorientation des axones plus proche de l&#39;agrégat de cellules COS 3. Comme le montre la figure 1, les cellules COS exprimant myc-taggés BMP7 (bleu) + réorienter Tag1 axones commissuraux (vert) loin de la source de BMP7 (figure 1B), similaire à la manière dont un explant de la plaque de toit repousse des axones commissuraux (figure 1A). Des cellules COS exprimant un vecteur de contrôle n&#39;ont aucun effet sur ​​l&#39;orientation des axones commissuraux 3,4. Ces explants ont également été marquées avec des anticorps contre le facteur de transcription ISL1 / 2 (rouge), qui orne les motoneurones et les interneurones dorsale. Ce résultat a été la première indication que membre de la famille BMP médiateur de l&#39;activité des trois plaque de toit chemorepellent. Figure 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1853/1853fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1853/1853fig1tmb.jpg" border="0" /></a>

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22The+development+of+the+rat+spinal+cord%22">The development of the rat spinal cord</a>. , (1984).</li>
<li>Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPlaczek%2C+M+%22Methods+in+molecular+biology%22">Methods in molecular biology</a>. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).</li>
<li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li>
<li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li>
<li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li>
<li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li>
<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li>
<li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li>
<li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li>
</ol>

Les facteurs critiques qui déterminent le succès dans l&#39;accomplissement de ce test sont tout d&#39;abord, le tissu ne doit pas être traitée avec dispase trop prolongée d&#39;une période, un tel traitement se traduira dans le tissu devient très collant et ayant diminué la viabilité. Deux, le collagène doit être parfaitement apprêté et conservés sur la glace autant que possible. Il deviendra plus difficile à gérer si elle commence à mettre, c&#39;est à dire virer au rose. Trois, l&#39;aiguille de tungstène doivent tou...

dosage de la capacité des molécules de signalisation diffusibles à réorienter embryonnaires épinière axones commissuraux

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Dorsale axones commissuraux de la moelle épinière des vertébrés 1 ont été une précieuse système modèle dans lequel d&#39;identifier des signaux de guidage axonal. Ici, nous décrivons un test in vitro, «le test de réorientation», qui a été largement utilisée pour étudier l&#39;effet des signaux extrinsèques et intrinsèques de l&#39;orientation des axones commissuraux 2. Ce test a été développé par de nombreuses personnes dans les laboratoires de Jane Dodd, Thomas et Andrew Lumsden Jessell (voir les remerciements pour plus de détails) et les versions de cet essai ont été utilisés pour démontrer les activités réorientation des principales molécules de guidage axonal, y compris le chemorepellent dans le BMP 3,4 toit en tôle et les activités des chimioattractives Netrin1 5 et Sonic Hedgehog (Shh) 6 dans la plaque de sol dans la moelle épinière. Explants comprenant 2-3 segments de la dorsale des deux tiers de la moelle épinière sont disséqués par jour embryonnaire (E) 11 rats et de culture en trois dimensions des gels de collagène 7. E11 dorsale explants épinière contiennent les neurones nouvellement né commissurale, qui peuvent être identifiés par leur expression axonale de la glycoprotéine, Tag1 8. Au cours de 30-40 heures de culture, de la trajectoire des axones commissuraux est résumée dans ces explants dorsal avec un cours à temps similaire à celle observée in vivo. Cette trajectoire axonale peut être contestée en plaçant les tissus essai ou un agrégat de cellules COS exprimant une molécule candidate de signalisation en contact avec l&#39;un des bords latéraux de l&#39;explant dorsale. Axones commissuraux s&#39;étendant au voisinage du tissu annexé feront croître sous l&#39;influence de l&#39;ensemble de la plaque de toit endogènes et les signaux provenant du tissu ectopique latéral. Le degré auquel les axones commissuraux sont réorientés dans ces circonstances peuvent être quantifiés. L&#39;utilisation de ce test, il est possible à la fois d&#39;examiner la suffisance d&#39;un signal particulier de réorienter les axones commissuraux 3,4 ainsi la nécessité pour ce signal pour diriger la trajectoire commissurale 9.

Ce test évalue la capacité d&#39;une molécule de signalisation, voici protéine morphogénétique osseuse 7 (BMP-7), à réorienter les axones commissuraux. Un explant de la moelle épinière embryonnaire dorsal est cultivée adjacente à un agrégat de cellules COS sécrétant des facteurs de croissance candidat. Réorienté axones commissuraux croissante au sein de l&#39;explant sont visualisées par immunohistochimie.

Dosage de la capacité des molécules de signalisation diffusibles à réorienter embryonnaires épinière axones commissuraux

Les axones commissuraux dorsaux de la moelle épinière des vertébrés ont constitué un système modèle précieux pour l'identification des signaux de guidage axonal. Ici, nous...

Des explants de la moelle épinière dorsale sont disséqués à partir d'embryons de rat et cultivés dans un collagène tridimensionnel. Le gel est placé en opposition avec des cellules exprimant une molécule de signalisation candidate. La capacité de la molécule de signalisation à réorienter les axones en croissance au sein de l'explant spinal dorsal est évaluée par immunohistochimie.Bonjour, je suis Virginia Hazen du laboratoire de Samantha Butler du département des sciences biologiques de l'Université de Californie du Sud. Je suis Keith Fun, également du laboratoire Butler. Et je suis Ken Ya Mai du laboratoire Butler.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de culture d'implants spinaux dorsaux et d'agrégats de cellules cost transfectées dans une matrice de collagène. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour évaluer la capacité de molécules candidates, appelées molécules de guidage, à orienter les neurones spinaux commissuraux. Dans cette expérience, nous examinerons la capacité de la protéine morphogénétique osseuse, ou BMP-7, à agir comme un chimiorépulsif.Commençons. Préparez des agrégats de cellules co utilisés pour tester la trajectoire des axones commissuraux choraux provenant des cellules co. Transfectés avec le plasmide d'expression pour la molécule d'intérêt ici, la protéine morphogénétique osseuse ou BMP7.Aspirez le milieu de la boîte et rincez les cellules avec un millilitre de PBS 1×. Éliminez le PBS et traitez les cellules avec un demi-millilitre de milieu de dissociation cellulaire sans enzyme pendant 15 minutes. Arrêtez la réaction en ajoutant un millilitre de milieu contenant du sérum de veau fœtal.À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, passer les cellules en itérant jusqu’à ce qu’il n’en reste aucune sur la surface de la boîte de culture. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger pendant deux minutes. À 2000 tr/min, éliminer le surnageant et pipeter plusieurs fois de haut en bas pour resuspendre les cellules.Dans 100 microlitres de milieu, déposez plusieurs gouttes de 20 microlitres de la solution cellulaire sur la face interne du couvercle d'une boîte de culture de 35 millimètres. Fermez le couvercle sur la boîte et placez-le dans l'incubateur pendant plusieurs heures afin de permettre l'agrégation des cellules. Pour préparer les implants de la moelle épinière dorsale, conservez-les frais après prélèvement.Des embryons de rat E11 sur de la glace. Dans du milieu L15, à l’aide d’une aiguille en tungstène aiguisée, prélever une section de quatre à six somites à partir de la région tronculaire située juste en dessous du bourgeon du membre antérieur de chaque embryon. À l’aide d’une pipette en plastique, recueillir le tissu dans un puits d’une plaque de quatre puits.Bien sûr, aucune boîte de Pétri sur glace. Lorsque tous les segments ont été disséqués, utilisez la pipette pour transférer les morceaux dans un deuxième puits de la boîte de Pétri contenant du milieu L 15 additionné de pâte à disque. Incubez le tissu à température ambiante pendant pas plus de cinq minutes.Pour éviter la mort cellulaire, ne pas trop digérer le tissu. Ajouter un millilitre de milieu L 15 frais avec 5 % de sérum de chèvre inactivé par la chaleur dans le troisième puits de la plaque. Puis transférer les fragments de tissu dans ce puits.À la fin de l'incubation dans l'espace de dissociation, laissez le tissu reposer sur de la glace pendant une heure. Pour faciliter la dissection ultérieure dans un tube de microcentrifugeuse, ajoutez 40 microlitres de milieu minimum essentiel 10 x à 360 microlitres de collagène. Et vortexez brièvement pour mélanger, puis centrifugez dans une microcentrifugeuse.La solution sera jaune et doit être conservée sur de la glace autant que possible afin d'empêcher la prise du collagène. Pour chaque lot de collagène, ajouter une quantité de bicarbonate de sodium 0,8 molaire permettant de rendre la solution de collagène légèrement orangée. Mélanger la solution après chaque ajout. Lorsque la solution de collagène atteint cette couleur, elle restera liquide si elle est maintenue sur glace, mais sera prête à gélifier lorsqu'elle sera portée à température ambiante. Si la solution devient rose après mélange, recommencer avec un nouveau tube de collagène. Déposer 20 microlitres de collagène dans chaque puits d'une plaque propre à quatre puits sans milieu.À l’aide de l’extrémité de la pipette, étaler le collagène pour former un petit tampon. Laisser le collagène prendre à température ambiante pendant environ 10 minutes. Sous le microscope stéréo, utiliser une aiguille au tungstène fraîchement aiguisée et une pince fine pour retirer à l’aide de l’aiguille au tungstène le mésoderme entourant la moelle épinière d’un embryon, puis enlever la partie ventrale de la moelle épinière, identifiable par la présence de la plaque du plancher.À l'extrémité ventrale, la lame basilaire est légèrement plus épaisse que la lame dorsale située au bord dorsal. Dans cet exemple, la moelle épinière est orientée avec le côté ventral vers le bas. Coupez soigneusement le tissu en travaillant parallèlement à la lame basilaire et éliminez le cinquième ventral de la moelle épinière.Utilisez l'aiguille pour diviser verticalement en deux le lambeau de moelle épinière dorsale. Veillez à ce que les bords soient coupés le plus proprement possible et recoupez-les au besoin. Utilisez une pipette buccale équipée d'un tube capillaire en verre de 0,5 millimètre de diamètre pour transférer chaque lambeau x sur un coussinet de collagène séparé.Avec l'aiguille en tungstène, découper l'agrégat de cellules co-transfectées en carrés d'une largeur approximativement équivalente à celle du bord latéral de la moelle épinière dorsale. Explication. Utiliser une pipette à bouche pour transférer l'un des carrés sur le tampon de collagène avec l'x explication. Utiliser la pipette à bouche pour aspirer tout liquide excédentaire.Ne pas trop aspirer, car une petite quantité de liquide facilitera l'application ultérieure de collagène ; appliquer quatre microlitres de collagène activé sur le tampon. Utiliser l'aiguille en tungstène pour déplacer le collagène au-dessus des implants sans toucher directement le tissu. En déplaçant l'aiguille dans le collagène, orienter chaque x explan de manière à ce que l'agrégat de cellules co soit adjacent à sa bordure latérale.Laisser la collagène prendre pendant 15 à 20 minutes. Répéter le processus d'application avec quatre microlitres supplémentaires de collagène afin de s'assurer que l'explant x est complètement entouré de collagène avant de passer à l'embryon suivant dans une hotte de culture tissulaire avec 0,5 millilitre de milieu, puis cultiver pendant 30 à 40 heures. Dans une étuve placée dans une hotte aspirante, fixer les explants avec 0,5 millilitre de solution de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 45 minutes. Garder le tissu sur de la glace, puis rincer deux fois avec 0,5 millilitre de la solution de blocage et de perméabilisation.PBTN.Incuber les explants x dans la solution de blocage à quatre degrés Celsius, de préférence toute la nuit. Utiliser des pinces pour retirer l'explant X du puits et placer chacun dans un puits d'une plaque de 48 puits.Ajoutez 200 microlitres d'anticorps primaire dans chaque puits. Pour visualiser les axones commissuraux, utilisez l'anticorps anti-ttag de souris et, afin de déterminer si la transfection croisée entre cellules a réussi, incluez un anticorps dirigé contre la molécule testée. Incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius.Lavez chaque échantillon cinq fois dans la solution de blocage PBTN, chaque lavage durant une heure, à quatre degrés Celsius. Éliminez le PBTN et ajoutez 200 microlitres d'anticorps secondaire à chacun. Recouvrez la plaque de papier d'aluminium pour éviter la décoloration et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius.Lavez les échantillons cinq fois dans du PBTN comme précédemment. Transférez chaque explant sur une lame porteuse à trois cupules. Éliminez le milieu de montage excédentaire Invecta Shield et couvrez avec une lamelle.Conserver les lames dans un dossier ou une boîte protégé de la lumière, à quatre ou à moins 20 degrés Celsius, jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être visualisées au microscope. Nous allons maintenant présenter quelques images représentatives d'explants X après leur culture, fixation, coloration et acquisition par microscopie confocale. Le panneau A montre qu'un explant X de la plaque du toit, délimité en blanc, peut réorienter les axones choraux positifs pour la marque tag un à l'écart de celle-ci, démontrant ainsi que la plaque du toit est la source d'un chimiorépulsif axonal. Le panneau B montre que les cellules CO sécrétant la molécule de signalisation M tact, la protéine morphogénétique osseuse ou BMP7, peuvent repousser les axones carcéraux de manière similaire à la plaque du toit.Les axones des cellules ne sécrétant que le plasmide d'expression n'ont aucun effet sur l'orientation des axones. Nous venons de vous montrer comment disséquer, orienter et cultiver un explant de moelle épinière et provoquer l'agrégation de cellules afin de déterminer si une molécule de signalisation candidate possède une activité de réorientation des axones. Lors de cette procédure, il est important de garder le collagène sur glace le plus longtemps possible et d'entourer complètement l'explant de collagène afin qu'il n'entre pas en contact direct avec le milieu de culture.Et enfin, cultiver uniquement pendant le temps nécessaire à l’allongement des axones jusqu’au bord ventral de l’exp. x. Voilà, c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.I.

assaying-ability-diffusible-signaling-molecules-to-reorient-embryonic

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cette vidéo montre une méthode de disséquer et de la culture des neurones commissuraux de la moelle épinière de rats E13 dorsale. Dissocié neurones commissuraux sont utiles pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance de l'axone et d'orientation.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Cette vidéo montre comment visualiser les voies axonales des groupes génétiquement définis des neurones de la moelle épinière embryonnaire de poulet en...

Décrypter Pathways axonale des groupes génétiquement définis de neurones dans le tube neural Chick Utilisant In ovo L&#39;électroporation

Nous démontrons comment disséquer et à la culture chiches E4 et E6 ganglionnaires statoacoustic explants de la moelle épinière. Les explants sont cultivés dans un milieu sans sérum dans des gels de collagène 3D pour 24 heures. Réactivité neurites est testé avec support du facteur de croissance complété et revêtu de protéine avec des perles.

Dissection et la culture de cellules de ganglions et de Chick Statoacoustic explants moelle épinière dans des gels de collagène pour des essais de neurites

Les projections stéréotypée des afférences sensorielles dans la moelle épinière des rongeurs offrent un système facilement accessible à l'étude expérimentale de branchement axonal par le traçage d'axones unique.

DII-étiquetage des neurones DRG pour l&#39;étude de branchement axonal dans une préparation Mont entiers de souris embryonnaires de la moelle épinière

Procédé par lequel l'expression du gène dans le tube neural peut être régulée à la baisse dans une cellule spécifique d'un type, est décrit de façon traçable. Nous montrons...

En électroporation in ovo de miARN à base de plasmides dans le tube neural développement et l&#39;évaluation des phénotypes par injection dans Dil livre ouvert préparatifs

Nous décrivons ici une cellule de Schwann (SC) essai de migration dans lequel SC sont en mesure de développer le long des axones s'étendent.

Analyser murin développement des cellules de Schwann le long des axones en croissance

Processus de développement tels que la prolifération, la structuration, la différenciation et le guidage axonal peuvent être facilement modélisés dans la moelle épinière du poisson zèbre. Dans cet article, nous décrivons une procédure de montage pour embryons de poisson zèbre, qui optimise la visualisation de ces événements.

Dissection et montage latéral embryons de poisson zèbre: Analyse de la moelle épinière développement

Nous décrivons ici l’utilisation d’une variante fluorescente verte pH-sensible de protéine, pHluorin, pour étudier la dynamique spatio-temporelle des récepteurs de guidage axon en trafic à la surface cellulaire. Le récepteur marqué par la pHluorine est exprimé à la fois en culture cellulaire et in vivo, enutilisant l’électroporation de l’embryon de poussin.

Utilisation de la pHluorine pour évaluer la dynamique des récepteurs de guidage axonaux dans la culture cellulaire et dans l’embryon de poussin

Le plancher est une structure essentielle des neurones de la moelle épinière en développement, fournissant des signaux diffusibles de progéniteurs et la différenciation. Nous décrivons une méthode pour produire des varangues milieu conditionné, à appliquer au tissu de la moelle épinière frais, et d'évaluer les conséquences sur les protéines d'intérêt par la biochimie.

Culture de tissus isolement de la plaque au sol et la production de milieu conditionné à évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux plancher Plate-publié

Ici, nous fournissons une méthode pour analyser le comportement des axones en croissance dans les matrices 3D, imitant leur développement naturel.

Génération d'hydrogels à base de collagène 3D pour analyser la croissance et le comportement axonal pendant le développement du système nerveux

Un présagéex-invivo permet d'imaginer l'excroissance du nerf oculomoteur en temps réel. Les tranches sont générées par l'intégration d'embryons E10.5 IslMN:GFP dans l'agarose, en coupant sur un vibratome et en grandissant dans un incubateur de toit de scène. Le rôle des voies de guidage d'axone est évalué en ajoutant des inhibiteurs aux médias de culture.

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo

Découvrez comment évaluer la capacité de la BMP7 à réorienter les axones commissuraux de la moelle épinière dorsale chez l'embryon de rat. Cette méthode utilise l'immunohistochimie pour visualiser la croissance axonale.

Dosage de la capacité des molécules de signalisation diffusibles à réorienter embryonnaires épinière axones commissuraux

Explorer plus de vidéos