Name: Optimisé fibrine billes de gel danalyse pour létude de langiogenèse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Apprenez l'essai des billes de fibrine pour étudier l'angiogenèse in vitro. Cette méthode permet de visualiser la formation de vaisseaux sanguins par imagerie en time-lapse.

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CELLULES PRÉPARATION <ol><li> Amener HUVEC et des fibroblastes en M199/10% de FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 jours avant perles. </li><li> Interrupteur à moyen et à EGM-2 (Clonetics) la veille pour le perlage HUVEC et le jour avant l&#39;intégration des fibroblastes. </li><li> Une concentration de ~ 400 billes par HUVEC est nécessaire. </li><li> 20000 fibroblastes par puits est nécessaire. </li></ol> REVÊTEMENT les billes avec HUVEC - Jour -1 <ol><li> Trypsiniser HUVEC. </li><li> Autoriser perles de régler (Ne pas centrifuger!). Aspirer le surnageant et laver les perles brièvement dans 1 ml d&#39;eau tiède EGM-2 moyennes. </li><li> Mix 2500 perles w / 1X10 6 HUVEC dans 1,5 ml d&#39;eau tiède EGM-2 moyennes dans un tube FACS. Placez-le verticalement dans l&#39;incubateur. (Ce sera suffisant pour ~ 10 puits. Intensifier si nécessaire) </li><li> Incuber pendant 4 heures à 37 ° C, en agitant le tube toutes les 20 min. (Bon revêtement est cruciale pour la germination.) </li><li> Après 4 heures, transférer l&#39;billes revêtues d&#39;un flacon de 5 ml de T25 dans EGM-2 et laissez O / N. </li></ol> INCORPORER billes revêtues en fibrine GEL - JOUR 0 <ol><li> Préparer la solution de fibrinogène 2,0 mg / ml (voir la section recette). </li><li> Ajouter 0,15 unités / ml d&#39;aprotinine pour la solution de fibrinogène. </li><li> Transfert des billes revêtues d&#39;un tube conique de 15 ml et laisser s&#39;installer des perles. Remettre en suspension dans 1ml perles d&#39;EGM-2 et le transfert d&#39;un tube à centrifuger de 1,5 ml. </li><li> Laver les billes 3X avec 1mL d&#39;EGM-2 par pipetage et lentement. </li><li> Nombre des perles sur une lamelle et remettre en suspension dans une solution de fibrinogène à une concentration de ~ 500 billes / mL. </li><li> Ajouter 0.625 unités / ml de thrombine à chaque puits. </li><li> Ajouter 0,5 mL de la suspension du fibrinogène / bille dans chaque puits d&#39;une plaque de 24 puits. Changer l&#39;embout de pipette pour chaque puits! </li><li> Mélanger la thrombine et le fibrinogène en allant de haut en bas doucement avec la pipette ~ 4 à 5 fois. Soyez prudent de ne pas faire de grosses bulles. </li><li> Laisser la plaque pendant 5 min dans la hotte, puis le placer dans le 37 ° C-incubateur pendant 10-15 min pour générer un caillot. </li><li> En attendant que le caillot, trypsiniser fibroblastes. </li><li> Ajouter 1 mL d&#39;EGM-2 par puits goutte à goutte. </li><li> Fibroblastes semences sur le dessus du gel de fibrine à une concentration de 20 000 cellules par puits. </li></ol> NOTES: Habituellement, lorsque le gel de fibrine est formé, vous pourrez voir de minuscules bulles dans le gel. Ne vous inquiétez pas, ils vont disparaître en 3-4 jours. Changer les médias tous les autres jours, c&#39;est à dire, Jour 2, 4, 6, etc .. En 3 ou 4 jours, vous devriez commencer à voir germer.

<ol><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcarrier-based+cocultivation+system+for+the+investigation+of+factors+and+cells+involved+in+angiogenesis+in+three-dimensional+fibrin+matrices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro.</a> Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).</li>
</ol>

Il ya un consensus croissant selon lequel trois dimensions (3D) dans les essais angiogenèse in vitro offrent un modèle qui est beaucoup plus proche de l&#39;environnement réel in vivo que peut être réalisé en utilisant des cultures 2D. Il est évident que la supériorité des systèmes 3D doit être reproductible et être capable d&#39;imiter plusieurs des grandes étapes de l&#39;angiogenèse. Bien que plusieurs dosages précédents 3D ont été développés, beaucoup de ces soit utiliser difficiles à obtenir des cellules microvasculaires, ou seulement ...

<table><tbody><tr><td>Billes Cytodex-3</td><td>Réactif</td><td>Amersham</td><td>17-0485-01</td><td>10 g/flacon. Hydrater et gonfler 1,0 à 1,5 g de billes sèches dans 50 mL de PBS (pH = 7,4) pendant au moins 3 h à température ambiante. Utiliser un tube de 50 mL et le placer sur un agitateur rotatif. Laisser les billes se déposer (~ 15 min). Éliminer le surnageant et laver les billes quelques minutes dans du PBS frais (50 mL). Éliminer le PBS et remplacer par du PBS frais : 25 mL -&amp;gt; 20 mg/mL =&amp;gt; 60 000 billes/mL ou 50 mL -&amp;gt; 10 mg/mL =&amp;gt; 30 000 billes/mL. Placer la suspension de billes dans un flacon en verre silanisé (Windshield Wiper ou Sigmacote). Stériliser les billes par autoclavage pendant 15 min à 115&amp;#x00B0;C. Conserver à 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Aprotinine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1153</td><td>10 mg/flacon. Reconstituer l’aprotinine lyophilisée à 4 U/mL dans de l’eau DI. Filtrer stérilement. Préparer des aliquotes de 1 mL chacune. Conserver à -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fibrinogène de type I</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8630</td><td>1 g. Dissoudre le fibrinogène à 2 mg/mL dans du DPBS. Noter le pourcentage de protéine coagulable et ajuster en conséquence. Chauffer dans un bain-marie à 37 &amp;#x00B0;C pour dissoudre le fibrinogène. Mélanger en retournant le tube. Ne pas vortexer. Filtrer stérilement à travers un filtre de 0,22 µm.</td></tr><tr><td>Thrombine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3399</td><td>22 mg = 1 000 unités. Reconstituer dans de l’eau stérile à 50 U/mL. Préparer des aliquotes de 0,5 mL chacune. Conserver à -20 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

optimisé fibrine billes de gel d&#39;analyse pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

L&#39;angiogenèse est un complexe multi-étapes, où, en réponse aux stimuli angiogéniques, les nouveaux navires sont créés à partir de la vascularisation existante. Ces étapes comprennent: la dégradation de la membrane basale, la prolifération et la migration (germination) des cellules endothéliales (CE) dans la matrice extracellulaire, l&#39;alignement de la CE en cordons, de branchement, la formation de lumière, anastomose, et la formation d&#39;une nouvelle membrane basale. Beaucoup d&#39;essais in vitro ont été développées pour étudier ce processus, mais la plupart ne reproduisent certaines étapes de l&#39;angiogenèse, et morphologiquement les vaisseaux dans les dosages ne sont souvent pas ressembler à des navires in vivo. Basé sur des travaux antérieurs et Nehls Drenckhahn, nous avons optimisé un dosage de l&#39;angiogenèse in vitro qui utilise la veine ombilicale humaine CE et les fibroblastes. Ce modèle reprend toutes les étapes clés au début de l&#39;angiogenèse et, surtout, les vaisseaux d&#39;affichage des brevets lumens intercellulaire entouré par polarisée CE. CE sont enduites sur microporteurs Cytodex et intégrés dans un gel de fibrine. Les fibroblastes sont en couches sur le dessus du gel, où ils assurent nécessaires facteurs solubles qui favorisent la germination CE de la surface des billes. Après plusieurs jours, de nombreux navires sont actuellement qui peut facilement être observée sous contraste de phase et de la microscopie time-lapse. Cette vidéo montre les étapes clés à mettre en place ces cultures.

Cette vidéo montre le protocole d&#39;un essai angiogenèse in vitro que les stades récapitule plusieurs de l&#39;angiogenèse. Time-lapse images de la germination, la formation de lumière, la ramification et anastomose - caractéristiques essentielles de l&#39;angiogenèse - sont présentés.

Optimisé fibrine billes de gel d&#39;analyse pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse

L'angiogenèse est un processus complexe à étapes multiples, au cours duquel, en réponse à des stimuli angiogéniques, de nouveaux vaisseaux sont créés à partir du réseau vasculaire existant. Ces...

Bonjour, je m'appelle Mar Katsu. Je viens du laboratoire Hughes, du département de biologie moléculaire et biochimie de l'université de Californie à Irvine. Je vais réaliser le test des billes de fibrine.Le processus complet prend deux jours pour être réalisé. Le premier jour consiste à enrober des billes avec des cellules endothéliales provenant de veines ombilicales humaines ou de région pubienne. Le deuxième jour consiste à incorporer ces billes enrobées dans des gels de fibrine, puis à déposer une couche de fibroblastes au-dessus de ces gels.Nous utilisons ce test pour étudier les nombreuses étapes de l'angiogenèse dans un environnement in vitro. Le premier jour, lors de la première partie, nous utilisons des billes CY X three. Puis, le deuxième jour, nous utilisons ces trois réactifs : le fibrinogène, la thrombine et l'aprotinine cytx.Les billes trois proviennent d'Amazon Biosciences et sont spécialement codées en collagène afin que les cellules endothéliales adhèrent aux billes. Le réactif suivant est le fibrinogène, que nous obtenons de Sigma. Celui-ci forme le gel ou caillot réel dans le test sur les billes.La thrombine est un facteur de coagulation. Cette protéine converti

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La cascade adhésion des plaquettes a lieu en présence du cisaillement, un facteur non pris en compte dans conventionnelle (statique) du bien-plaque de tests. Cet article rend compte d'un test d'agrégation plaquettaire en utilisant une plaque de microfluidique bien le format d'émuler les conditions physiologiques de flux de cisaillement.

L&#39;adhésion des plaquettes et l&#39;agrégation sous flux en utilisant des cellules de débit microfluidique

Cette vidéo fait la démonstration d’un test modifié basé sur des billes de microsupport incorporant des péricytes pour étudier la germination endothéliale au cours des premiers stades de l’angiogenèse. Le test fournit un modèle expérimental in vitro pour comprendre les mécanismes moléculaires de l’angiogenèse et l’effet des thérapies anti-angiogénétiques.

Dosage de la germination des billes pour l’évaluation de l’angiogenèse à un stade précoce : un modèle in vitro basé sur des billes pour étudier la germination endothéliale en présence de péricytes

Des techniques de microscopie et de traitement d’image de time-lapse ont été employées pour observer et analyser le compactage fibroblaste-négocié de gel et le réalignement de fibre de fibrine dans un bioréacteur commandé par l’environnement sur une période de 48 heures.

Observation et quantification du compactage du gel de fibrine médié par les fibroblastes

La récapitulation du microenvironnement spécifique à l’organe, qui stimule l’angiogenèse locale, est indispensable pour une régénération réussie des tissus endommagés. Ce rapport fait la démonstration d’une nouvelle méthode pour implanter des gels de fibrine à la surface pulmonaire d’une souris vivante afin d’explorer comment le microenvironnement spécifique aux poumons module l’angiogenèse et la régénération alvéolaire chez la souris adulte.

Implantation de fibrine Gel sur la souris Lung pour étudier l&#39;angiogenèse pulmonaire spécifique

Les cellules cancéreuses sont intégrées dans un gel de collagène, puis prises en sandwich dans un gel de fibrine acellulaire pour générer un système de culture 3D dans lequel le caractère invasif et la formation de tumeurs satellites peuvent être surveillés.

Three-Dimensional Culture Assay pour explorer des cellules cancéreuses invasives et Tumor Satellite Formation

Cette présente protocole une perle roman in vitro d’analyse que plus modèles convenablement le processus d' in vivo la germination de l’angiogenèse en incorporant des péricytes. Cette modification permet le dosage de la perle à récapituler plus fidèlement les interactions cellulaires hétérotypiques entre cellules endothéliales et murales qui sont essentiels pour l’angiogenèse.

Incorporer les péricytes dans une perle de cellules endothéliales test de germination

Nous présentons ici un protocole afin d’étudier la physiopathologie de la rétinopathie diabétique proliférante en utilisant les tissus dérivés de patient, excisées chirurgicalement, fibrovasculaire pour tridimensionnelle native caractérisation et ex vivo vitroplants. Cela ex vivo modèle de culture est également prête pour tester ou développer de nouveaux traitements.

Un modèle de Culture tissulaire Ex Vivo pour fibrovasculaire Complications dans la rétinopathie diabétique proliférante

Cette méthode décrit la culture des cellules endothéliales dérivées de l'iPSC comme 40 microvaisseaux 3D perfusés dans une plate-forme microfluidique normalisée. Cette plate-forme permet l'étude de la germination angiogénique à gradient en 3D, y compris l'anastomose et la stabilisation des germes angiogéniques d'une manière évolutive et à haut débit.

Test standardisé et évolutif pour étudier perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

La méthode présentée ici permet d’évaluer l’effet des réactifs sur l’angiogenèse ou la perméabilité vasculaire in vivo sans coloration. La méthode utilise l’injection de dextran-FITC via la veine de la queue pour visualiser les néo-vaisseaux ou les fuites vasculaires.

Essai de bouchon de gel matriciel in vivo modifié pour les études d’angiogenèse

La fraction vasculaire stromale (SVF) isolée mécaniquement associée à un hydrogel de fibrine offre un support facile et efficace pour des cellules stromales viables dérivées du tissu adipeux pour diverses indications, y compris l’ingénierie tissulaire et/ou la cicatrisation des plaies. Ici, nous présentons la préparation d’une construction mécanique d’hydrogel SVF (mSVF)-fibrine pour la recherche translationnelle et l’application clinique.

La combinaison d’une fraction vasculaire stromale isolée mécaniquement et d’un hydrogel de fibrine : un protocole de traitement

Ici, nous présentons un protocole d’électrophorèse sur gel fibrinogène-polyacrylamide (PAGE) pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques de Sipunculus nudus.

Séparation et affichage rapides d’agents fibrinogénolytiques actifs chez Sipunculus nudus par électrophorèse sur gel fibrinogène-polyacrylamide

Apprenez l'essai des billes de fibrine pour étudier l'angiogenèse in vitro. Cette méthode permet de visualiser la formation de vaisseaux sanguins par imagerie en time-lapse.

Optimisé fibrine billes de gel d'analyse pour l'étude de l'angiogenèse

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