Identification des phénotypes inhibition de la croissance induite par l'expression de bactéries de type III Effectors dans la levure

Pour commencer ce protocole, sélectionnez un vecteur d’expression de votre effecteur bactérien préféré. Dans la levure et la souche de levure, le vecteur est ensuite transformé en cellules de levure. L’expression suivante de l’effecteur est induite.

Les cellules induites sont lysées pour une analyse ultérieure par transfert Western afin de vérifier l’expression de l’effecteur. Après confirmation de l’expression de l’effecteur, les cellules sont cultivées et décuplées, des dilutions en série sont repérées sur des milieux répresseurs et inducteurs. Enfin, après deux à trois jours, la croissance des levures est analysée.

Bonjour, je suis Do Solomon du laboratoire du Dr Guido Cesa au Département des sciences végétales de l’Université de Tel Aviv. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’identification des phénotypes d’inhibition de la croissance induits par l’expression d’effecteurs bactériens de type trois chez la levure. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la fonction des effecteurs de type trois à partir de bactéries pathogènes à Gram négatif et constitue un outil qui nous aide à identifier les cibles TIC effectrices.

Alors commençons. Plusieurs facteurs importants doivent être pris en compte et optimisés lors de la conception d’un système de levure approprié pour l’expression des effecteurs de type trois d’intérêt. La première est le promoteur qui pilote l’expression des effecteurs.

Étant donné que les effecteurs bactériens de type trois peuvent être toxiques pour les cellules de levure, un promoteur inductible doit être utilisé pour contrôler leur expression. Nous utiliserons le promoteur GAL one dans cette expérience. Le deuxième facteur est le nombre de copies du gène effecteur.

Des niveaux d’expression élevés sont atteints lorsque le gène effecteur est porté par un plasmide de deux microns. L’expression intermédiaire est obtenue à l’aide d’un plasmide contenant un centromère, et une faible expression est obtenue lorsque le gène effecteur est intégré dans le génome de la levure par recombinaison homologue. Un troisième facteur à prendre en compte est l’étiquette d’épitope utilisée pour vérifier l’expression de la protéine dans les cas où les anticorps dirigés contre l’effecteur d’intérêt ne sont pas disponibles.

Les marqueurs couramment utilisés sont l’hémagglutinine M, l’HA ou le drapeau contre lequel des anticorps commerciaux fiables sont disponibles. Nous suggérons d’utiliser une seule copie de l’étiquette pour minimiser les effets délétères indésirables sur la structure et l’activité de la protéine effectrice. Enfin, la souche de levure à utiliser pour l’expression doit être tropique par rapport au marqueur sélectionnable du vecteur d’expression.

Pour cultiver des cellules de levure en vue de leur transformation, choisissez une colonie de levure dans une plaque fraîche et inocunez trois millilitres de YPD dans un vortex de tube en polypropylène de 15 millilitres. Placez brièvement le tube de culture dans un rouleau et incubez toute la nuit à 30 degrés Celsius avec une rotation constante. Le lendemain matin, retirez la culture du rouleau et centrifugez-la à 800 G pendant cinq minutes à température ambiante.

Après la centrifugation, retirez complètement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de tampon de suspension Resus mélangé par vortex à vitesse maximale pendant environ 10 secondes. Pour chaque plasmide à transformer et une transformation de contrôle supplémentaire, transférez 100 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de micro-fuge. Ajoutez cinq microlitres de spermatozoïdes de saumon simple brin, de l’ADN et 250 à 500 nanogrammes d’ADN plasma dans chaque tube, à l’exception du tube de contrôle.

Ensuite, avec précaution, ajoutez 650 microlitres de solution de transformation dans chaque tube et vortex. Incuber les tubes à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes sur un rouleau. Lorsque l’incubation est terminée, ajoutez 70 microlitres de DMSO dans chaque tube et mélangez en inversant les tubes 10 à 15 fois pour éviter de briser les cellules.

Ne faites pas vortex les tubes. Placez les tubes dans un bain d’eau préchaude à 42 degrés Celsius et incubez pendant 15 minutes. Après 15 minutes, retirez les tubes du bain-marie et placez-les immédiatement sur de la glace pendant deux minutes.

Une fois les tubes refroidis, récoltez les cellules par centrifugation, puis utilisez une pipette pour retirer soigneusement le surnageant visqueux. Remettre chaque pastille en suspension dans 150 microlitres d’eau stérile double distillée et étaler la suspension cellulaire sur une plaque avec le milieu sélectif approprié. Laissez les plaques ouvertes pendant deux minutes et laissez-les sécher dans une hotte à flux laminaire.

Après cela, placez les plaques dans un incubateur à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours pour faire pousser des cellules de levure. Pour préparer un extrait de protéines, inoculez trois millilitres du milieu de pression approprié avec une colonie de levure à partir d’une plaque fraîche et d’un vortex. Placez brièvement le tube de culture dans un rouleau à 30 degrés Celsius le lendemain.

Retirer la culture du rouleau et centrifuger à 800 G pendant cinq minutes à température ambiante, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire. Dans trois millilitres de DDW stérile mélangés par une centrifugeuse vortex, encore une fois, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans trois millilitres de DDW stérile. Transférez maintenant 200 microlitres de la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 15 millilitres contenant trois millilitres du milieu inducteur approprié mélangé par vortex.

Placez le tube dans un rouleau et incubez toute la nuit à 30 degrés Celsius le lendemain matin. Transférez un millilitre de la culture ou plus pour les cultures à faible densité dans un microtube à centrifuger. Récoltez les cellules par centrifugation à 800 Gs pendant cinq minutes à température ambiante, puis passez un travail sous hotte pour éviter de respirer des vapeurs toxiques d’éthanol Beamer capto.

Retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette et remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de solution de lyse glacée. Mélanger vigoureusement par vortex et incuber sur glace pendant 30 minutes. Au cours de l’incubation de 30 minutes, déterminer le volume de six acides chlorhydriques normaux requis pour titrer 100 microlitres de tampon de lyse à un pH de neuf à 10.

Pour ce faire, ajoutez différents volumes d’acide chlorhydrique à 100 microlitres de tampon de lyse dans 10 tubes différents, et vérifiez le pH de la solution à l’aide d’une bandelette indicatrice de pH à la fin de l’incubation au volume approprié d’acide chlorhydrique par rapport au lysat et mélangez par vortex. Ajoutez ensuite 50 microlitres de tampon de trois x échantillon au lysat et mélangez par vortex, percez un trou dans le couvercle du tube de micro-fuge avec une aiguille et faites bouillir la solution de lysat sur un bloc chauffant pendant cinq minutes. Après ébullition, laissez la solution refroidir pendant deux minutes à température ambiante.

Ensuite, faites tourbillonner la solution de lysat et faites-la tourner pendant 10 secondes. Le lysat est maintenant prêt pour l’analyse immuno-sanguine afin de préparer les cellules pour le test de repérage. Cultivez trois cultures d’un millilitre de chaque souche comme indiqué précédemment le lendemain.

Préparez deux assiettes contenant un milieu synthétique complet sans leucine. Le milieu d’une boîte doit être complété par 2 % de glucose et celui de l’autre plaque par 2 % d’actose et 1 % de raffinose. Faites sécher les plaques dans une hotte à flux laminaire stérile à température ambiante pendant 20 minutes.

Récoltez les cellules et remettez en suspension chaque pastille cellulaire dans trois millilitres de DDW stérile. Répétez l’étape de centrifugation et remettez les cellules en suspension dans trois millilitres de DDW stérile. Déterminez la densité optique ou DO de chaque culture, puis préparez des suspensions cellulaires d’un millilitre avec une DO de 600 dans des tubes stériles sur microfiches.

Ensuite, préparez trois dilutions en série dix fois plus importantes à partir de chacune des suspensions cellulaires à l’aide de trois microtubes stériles remplis de 900 microlitres de DDW stérile. Placez les plaques sèches sur une grille et pour chaque point de culture, 10 microlitres des quatre dilutions d’affilée. Après le repérage, laissez les plaques ouvertes dans le capot pendant plusieurs minutes.

Lorsque les taches sont sèches, couvrez les assiettes et placez-les dans un incubateur à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours. Nous allons maintenant montrer les résultats d’un test de repérage de levure pour la détection de l’inhibition de la croissance. Phénotypes induits par l’expression d’effecteurs de type trois ici, les effecteurs de type trois, A-V-R-P-T-O hop, AA un et AAV RE un de la bactérie.

Pseudomona Riner path de notre tomate a été exprimé à partir d’un centromère contenant un plasmide dans une souche de levure sur un milieu de répression, des souches de levure portant le plasmide pour l’expression de A-V-R-P-T-O et HOP AA, l’une d’entre elles a présenté une croissance similaire à celle de la souche témoin contenant un vecteur vide. Alors que les levures porteuses d’AAV RE one présentaient une croissance légèrement réduite, probablement en raison de la fuite du promoteur GAL one et de la cytotoxicité élevée de AV RE one, dans des conditions induisantes, l’expression de AV E one ou de HOP AA one provoquait un phénotype d’inhibition de croissance drastique reflété par l’absence de colonies dans toute dilution. En revanche, l’expression de A-V-R-P-T-O n’a exercé aucun effet inhibiteur de croissance.

Nous venons de vous montrer comment identifier les phénotypes d’inhibition de la croissance causés par l’expression d’effecteurs bactériens de type trois chez la levure. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de choisir soigneusement le vecteur d’expression ainsi que cette souche, car les deux peuvent affecter considérablement les résultats. De plus, n’oubliez pas d’utiliser ces colonies fraîchement transformées dans toutes les étapes de la procédure.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.