Identification des phénotypes inhibition de la croissance induite par l'expression de bactéries de type III Effectors dans la levure

Pour commencer ce protocole, sélectionnez un vecteur pour l'expression de votre effecteur bactérien préféré. Chez la levure et la souche de levure, le vecteur est ensuite transformé dans des cellules de levure. Ensuite, l'expression de l'effecteur est induite.

Les cellules induites sont lysées afin d'effectuer une analyse par immunotransfert (western blot) ultérieure permettant de vérifier l'expression de l'effecteur. Après confirmation de l'expression de l'effecteur, les cellules sont cultivées et diluées sériées d'un facteur dix, puis déposées sur des milieux répresseurs et inducteurs. Enfin, après deux à trois jours, la croissance des levures est analysée.

Bonjour, je suis Do Solomon du laboratoire du Dr Guido Cesa, du Département des sciences végétales de l'Université de Tel Aviv. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'identifier les phénotypes d'inhibition de croissance induits par l'expression d'effecteurs de type trois bactériens chez la levure. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la fonction d'effecteurs de type trois provenant de bactéries pathogènes à Gram négatif, et elle constitue un outil qui nous aide à identifier les cibles TIC de ces effecteurs.

Commençons donc. Plusieurs facteurs importants doivent être pris en compte et optimisés lors de la conception d'un système de levure approprié pour l'expression des effecteurs de type trois d'intérêt. Le premier est le promoteur qui contrôle l'expression des effecteurs.

Étant donné que les effecteurs bactériens de type trois peuvent être toxiques pour les cellules de levure, un promoteur inductible doit être utilisé pour contrôler leur expression. Nous utiliserons le promoteur GAL1 dans cette expérience. Le deuxième facteur est le nombre de copies du gène de l'effecteur.

De forts niveaux d'expression sont obtenus lorsque le gène effecteur est porté par un plasmide de deux microns. Une expression intermédiaire est obtenue en utilisant un plasmide contenant un centromère, et une faible expression est obtenue lorsque le gène effecteur est intégré dans le génome de la levure par recombinaison homologue. Un troisième facteur à prendre en compte est la balise épitope utilisée pour vérifier l'expression protéique dans les cas où des anticorps dirigés contre l'effecteur d'intérêt ne sont pas disponibles.

Les marqueurs couramment utilisés sont l'hémagglutinine M (HA) ou le marqueur « flag », pour lesquels des anticorps commerciaux fiables sont disponibles. Nous recommandons d'utiliser une seule copie du marqueur afin de minimiser les effets indésirables sur la structure et l'activité de la protéine effectrice. Enfin, la souche de levure à utiliser pour l'expression doit être compatible avec le marqueur de sélection du vecteur d'expression.

Pour cultiver des cellules de levure destinées à une transformation, prélevez une colonie de levure à partir d'une boîte fraîche et inoculez trois millilitres de YPD dans un tube polypropylène de 15 millilitres. Vortexez brièvement le tube de culture, puis placez-le dans un rouleau rotatif et incubez toute la nuit à 30 degrés Celsius avec une rotation constante. Le lendemain matin, retirez la culture du rouleau et centrifugez-la à 800 Gs pendant cinq minutes à température ambiante.

Après la centrifugation, éliminer complètement le surnageant et resuspendre les cellules dans un millilitre de tampon de resuspension Resus en vortexant à vitesse maximale pendant environ 10 secondes. Pour chaque plasmide à transformer ainsi que pour une transformation témoin supplémentaire, transférer 100 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube microfuge. Ajouter cinq microlitres d'ADN de sperme de saumon monocaténaire et de 250 à 500 nanogrammes d'ADN plasmidique à chaque tube, sauf au tube témoin.

Ensuite, ajoutez soigneusement 650 microlitres de solution de transformation dans chaque tube et vortexez. Incubez les tubes à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes sur un rouleau. Une fois l'incubation terminée, ajoutez 70 microlitres de DMSO dans chaque tube et mélangez en retournant les tubes 10 à 15 fois afin d'éviter de rompre les cellules.

Ne pas vortexer les tubes. Placer les tubes dans un bain d'eau préchauffé à 42 degrés Celsius et incuber pendant 15 minutes. Après 15 minutes, retirer les tubes du bain d'eau et les placer immédiatement sur de la glace pendant deux minutes.

Une fois que les tubes ont refroidi, récoltez les cellules par centrifugation, puis utilisez une pipette pour éliminer soigneusement le surnageant visqueux. Resuspendez chaque culot dans 150 microlitres d'eau stérile doublement distillée et étalez la suspension cellulaire sur une boîte de Petri contenant le milieu sélectif approprié. Laissez les boîtes ouvertes pendant deux minutes et laissez-les sécher dans une hotte à flux laminaire.

Ensuite, placer les boîtes dans un incubateur à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours pour faire croître les cellules de levure. Pour préparer un extrait protéique, inoculer trois millilitres du milieu répresseur approprié avec une colonie de levure provenant d'une boîte fraîche et vortexer. Le jour suivant, placer brièvement le tube de culture sur un rouleau à 30 degrés Celsius.

Retirer la culture du rouleau et centrifuger à 800 g pendant cinq minutes à température ambiante, éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire. Dans trois millilitres d'eau distillée stérile (DDW), homogénéiser par vortexage, centrifuger à nouveau, éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans trois millilitres d'eau distillée stérile (DDW). Transférer maintenant 200 microlitres de la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 15 millilitres contenant trois millilitres du milieu inducteur approprié, homogénéisé par vortexage.

Placer le tube dans un rouleau et incuber toute la nuit à 30 degrés Celsius. Le lendemain matin, transférer un millilitre de la culture, ou plus pour les cultures de faible densité, dans un tube de microcentrifugeuse. Récolter les cellules par centrifugation à 800 G pendant cinq minutes à température ambiante. À partir de ce moment, travailler sous une hotte afin d'éviter d'inhaler les vapeurs toxiques d'éthanol Beamer capto.

Retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette et resuspendez le culot cellulaire dans 100 microlitres de solution de lyse glacée. Mélangez vigoureusement par vortexage et incubez sur glace pendant 30 minutes. Pendant l'incubation de 30 minutes, déterminez le volume d'acide chlorhydrique normal six nécessaire pour titrer 100 microlitres de tampon de lyse jusqu'à un pH de neuf à dix.

Pour ce faire, ajoutez différents volumes d'acide chlorhydrique à 100 microlitres de tampon de lyse dans 10 tubes différents, puis vérifiez le pH de la solution à l’aide d’un papier indicateur de pH à la fin de l’incubation, en ajoutant le volume approprié d’acide chlorhydrique au lysat et en mélangeant par vortex. Ajoutez ensuite 50 microlitres de tampon d’échantillonnage 3 x au lysat et mélangez par vortex. Percez un trou dans le couvercle du tube microfuge à l’aide d’une aiguille et faites bouillir la solution de lysat sur un bloc chauffant pendant cinq minutes. Après ébullition, laissez refroidir la solution deux minutes à température ambiante.

Ensuite, vortexer la solution de lysat et centrifuger pendant 10 secondes. Le lysat est désormais prêt pour l'analyse sanguine immuno pour préparer les cellules en vue du test de dépôt. Faire croître des cultures de trois millilitres de chaque souche comme indiqué précédemment le jour suivant.

Préparez deux plaques contenant un milieu synthétique complet sans leucine. Le milieu d'une plaque doit être supplémenté avec 2 % de glucose et celui de l'autre plaque avec 2 % de galactose et 1 % de raffinose. Sèchez les plaques dans une hotte à flux laminaire stérile à température ambiante pendant 20 minutes.

Récupérez les cellules et resuspendez chaque culot cellulaire dans trois millilitres d'eau distillée stérile (DDW). Répétez l'étape de centrifugation et resuspendez à nouveau les cellules dans trois millilitres d'eau distillée stérile (DDW). Déterminez la densité optique ou DO de chaque culture, puis préparez des suspensions cellulaires d'un millilitre ayant une DO 600 de un dans des tubes stériles microfiches.

Ensuite, préparez trois dilutions sérielles dix fois à partir de chacune des suspensions cellulaires en utilisant trois microtubes stériles contenant 900 microlitres d'eau distillée stérile (DDW). Placez les plaques sèches sur une grille et, pour chaque point de culture, déposez 10 microlitres des quatre dilutions en ligne. Après le dépôt, laissez les plaques ouvertes dans la hotte pendant plusieurs minutes.

Lorsque les taches sont sèches, couvrez les boîtes et placez-les dans un incubateur à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours. Nous allons maintenant présenter les résultats d'un test de dépôt sur levure permettant de détecter l'inhibition de la croissance. Les phénotypes induits par l'expression d'effecteurs de type trois ici, les effecteurs de type trois, A-V-R-P-T-O hop, AA un un et AAV RE un de la bactérie.

Le chemin de signalisation Pseudomona Riner de notre tomate a été exprimé à partir d’un plasmide contenant un centromère dans une souche de levure cultivée sur un milieu répresseur. Les souches de levure portant un plasmide pour l’expression de A-V-R-P-T-O et de HOP AA un un présentaient une croissance similaire à celle de la souche témoin contenant un vecteur vide. Alors que la levure portant AAV RE un affichait une croissance légèrement réduite, probablement en raison d’un faible niveau d’expression du promoteur GAL un et de la forte cytotoxicité de AV RE un, dans des conditions inductrices, l’expression de AV E un ou de HOP AA un un entraînait un phénotype d’inhibition drastique de la croissance, reflété par l’absence de colonies à n’importe quelle dilution. En revanche, l’expression de A-V-R-P-T-O n’exerçait aucun effet inhibiteur sur la croissance.

Nous venons de vous montrer comment identifier les phénotypes d'inhibition de la croissance provoqués par l'expression d'effecteurs bactériens de type trois chez la levure. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien choisir le vecteur d'expression ainsi que cette souche, car les deux peuvent fortement influencer les résultats. De plus, pensez à utiliser des colonies fraîchement transformées à toutes les étapes de la procédure.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.