Name: Marquage fluorescent du COS-7 exprimant des protéines de fusion SNAP-tag pour imagerie de cellules vivantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Apprenez le marquage fluorescent de protéines SNAP-tag dans des cellules COS-7 vivantes pour l'imagerie en temps réel. Cette méthode permet de visualiser la localisation protéique sans clonage répété.

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<ul><li> Kai Johnsson </li><li> Ivan Correa </li><li> Andreas Brecht </li><li> Katrin Müentener </li><li> Chris Noren </li><li> Luo dim. </li><li> Xu Ming </li><li> Theodore Davis </li><li> Salvatore Russello </li><li> Aihua Zhang </li><li> Inca Ghosh </li><li> Elissa Maunus </li><li> Nicolas Labarthe </li><li> James MacFarland </li><li> John Buswell </li><li> Brenda Desmond </li><li> James Ellard </li><li> Peigne Don </li></ul>

Placage cellules CHO-K1: <ol><li> Ajouter 50 100 pi de cellules CHO-K1 qui ont été traitées à la trypsine selon des protocoles standard pour 6ml de complet F-12K. </li><li> Mélanger la suspension cellulaire par aspiration et refoulement plusieurs fois, puis aliquote de 300 ul de suspension cellulaire trypsinisées à chaque puits d'une chambre de stériles 8-Lab-Tek II lamelle couvre-objet Chambré avec # 1.5 borosilicate lamelle chambres (Nalgene Nunc Int;. Produit # 155409; Lot: 100808-8-0). </li><li> Incuber les échantillons à 37 ° C, 5% CO 2 pendant la nuit. </li></ol> Transfection transitoire de cellules CHO-K1 avec pSNAP-ADRB2 et pSNAP-H2B: <ol><li> Vérifiez les chambres de culture de cellules ensemencées sur les jours précédents à chercher densité cellulaire et la santé. </li><li> Étiquetez le nombre approprié de tubes de microcentrifugeuse. </li><li> Dans une hotte à flux laminaire, mis en place des mélanges complexes de transfection selon le tableau de l'échantillon suivant, en utilisant soit 0,3 ug pSNAP-ADBR2 l'ADN plasmidique de contrôle ou 0,3 pg d'ADN de contrôle pSNAP-H2B plasmidique, 1 pl de D2 Transpass et 1 ul de Transpass V par réaction. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> plasmide </td><td> nombre de réactions </td><td> pl d'un milieu sans sérum </td><td> ul de D2 Transpass </td><td> pl d'Transpass V </td><td> ul d'ADN plasmidique </td><td> pl d'D2/reaction Transpass </td><td> pl d'Transpass V / réaction </td><td> ng d'ADN / réaction </td><td> L'ADN conc. (Ng / l) </td><td> ul d'ADN plasmidique / réaction </td></tr><tr><td> SNAP-ADRB2 </td><td> 5 </td><td> 236,5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472,34 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td> H2B-SNAP </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515,89 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Moquer </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Non transfectées </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li> Tout d'abord, mélanger les sans sérum F-12K avec l'ADN plasmidique appropriée, puis ajouter le réactif de transfection Transpass D2, puis ajouter le Réactif de transfection Transpass V. Mélanger les composants bien par aspiration et refoulement en douceur à plusieurs reprises après l'addition de chaque réactif. </li><li> Incuber la réaction à température ambiante pendant 30 minutes. </li><li> Durant l'incubation, laver les cellules une fois avec 600 pi de DMEM complet et ajouter 450 ul de DMEM complet à chaque échantillon. </li><li> Ajouter 50 ul du mélange de transfection complexe pour chaque échantillon, lentement et de manière goutte à goutte. </li><li> Incuber les échantillons nuit à 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> SNAP-Cell Étiquetage Étoile TMR des cellules CHO-K1 transfectées transitoirement avec pSNAP-ADRB2 et pSNAP-H2B: <ol><li> Retirer délicatement le support de transfection complexes à partir de chaque échantillon par aspiration sous vide. Laver les cellules deux fois avec 600 pi de terminer F-12K et de remplacer les médias dans chaque puits avec 600 pi de terminer F-12K. </li><li> Mix média étiquetage colorant en ajoutant 995 ul de complet F-12K et 51 ul 0,6 mM SNAP-Cell TMR-Star substrat. La concentration finale de SNAP-Cell TMR-Star doit être de 3mm. Pipette de haut en bas plusieurs fois pour mélanger après l'ajout de substrat. </li><li> Retirez délicatement les milieux de croissance à partir d'échantillons et ajouter 200 ul de médias étiquetage colorant pour chaque puits. Incuber les échantillons à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 30 minutes. </li><li> Alors que les échantillons sont en incubation, préparer Hoechst 33342 solution pour la coloration nucléaire d'échantillons en mélangeant 1 pl de Hoechst 33342, trichlorhydrate, trihydraté (10 mg / ml solution dans l'eau, 16,2 mM solution; sondes moléculaires Invitrogen) dans 10 ml d'achever F-12K . </li><li> Retirez le support de tous les échantillons et ajouter 600 ul de la solution diluée Hoechst pour chaque échantillon. Incuber les échantillons à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 5 minutes. </li><li> Lavez échantillons trois fois avec 600 pi de terminer F-12K. </li><li> Incuber les échantillons à 37 ° C, 5% de CO 2 pour 30 minutes supplémentaires pour permettre fluorophore non constituée en société à diffuser à l'extérieur des cellules. </li><li> Après 30 minutes, le changement des médias sur les échantillons SNAP-Cell une dernière fois et procéder à l'imagerie. </li><li> Image des cellules en utilisant un Zeiss Axiovert 200M Apotome microscope à fluorescence. </li></ol> Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Voiciquelques résultats représentatifs de l'imagerie de fluorescence en utilisant la norme de la microscopie à fluorescence direct cellules COS-7 qui sont l'expression SNAP-tag fusions. Cette première image montre direct cellules COS-7 exprimant pSNAP-H2B (nucléaire histones) marqué avec SNAP-Cell TMR-Star. La construction pSNAP-H2B a été généré en utilisant l'pSNAP-tag (m) du vecteur. Les cellules ont été marquées avec SNAP-Cell TMR-Star pour 30 minutes et de contraste avec Hoechst 33342 (bleu) pour les noyaux. La fluorescence rose montre la superposition de la fluorescence rouge où protéine histone est présent dans plus de la fluorescence bleue indiquant le noyau. L'expression de la protéine H2B est clairement et facilement identifiables. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Les figures 2 et 3. Ces deux images suivantes montrent direct cellules COS-7 transfectées transitoirement avec pSNAP-ADRβ2. Les cellules ont été marquées avec SNAP-Cell TMR-Star (rouge) et de contraste avec Hoechst 33342 (bleu). La construction pSNAP-ADRβ2 a été généré en utilisant l'pSNAP-tag (m) du vecteur. Les cellules ont été marquées avec SNAP-Cell TMR-Star pour 30 minutes et de contraste avec Hoechst 33342 (bleu) pour les noyaux. La fluorescence rouge indique la présence de protéines de surface cellulaire ADRB2 récepteurs tout en fluorescence bleue identifie le noyau.

<ol><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li>
<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-tag+Technologies%3A+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function%5BTitle%5D)+AND+%22NEB+Expressions%22%5BJournal%5D)">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs sont employés par New England Biolabs qui produit les réactifs et les instruments utilisés dans cet article.

Il ya plusieurs variables qui affectent les résultats observés tels que l&#39;intensité du laser se concentrer, capacités de l&#39;équipement, l&#39;objectif utilisé, etc photostabilité du fluorophore détermine la vitesse de la fluorescence doit être capturé avant de s&#39;estomper. Cette méthode de marquage des protéines est polyvalent et convient pour de nombreuses applications. Technologies de SNAP-tag et CLIP-tag pour le marquage spécifique de protéines de fusion avec des sondes synthétiques permettent divers aspects de la fonction des protéines, y compris une variété de processus dynamiques dans les cellules vivantes et dans les lysats cellulaires. SNAP-CLIP-MCP-et ACP-tag technologies offrent une polyvalence extraordinaire simplicité et à l&#39;imagerie de protéines dans les cellules vivantes et fixes, et à l&#39;étude des protéines in vitro. La création d&#39;un seul gène de construire donne une protéine de fusion taggés capable de former une liaison covalente à une variété de groupes fonctionnels, y compris les fluorophores, biotine, ou des perles. La protéine d&#39;intérêt doit être cloné et exprimé qu&#39;une seule fois et ensuite la fusion peut être utilisé avec une variété de substrats fluorescents pour de nombreuses applications en aval tels que l&#39;étiquetage de protéines simultanément à l&#39;intérieur des cellules vivantes, la localisation des protéines et translocation, pulse-chase expériences, des études de l&#39;internalisation du récepteur , sélectives étiquetage surface de la cellule, les protéines déroulant tests, la détection de protéines en SDS-PAGE, la cytométrie en flux à haut débit dans les dosages de liaison des plaques de microtitration, des expériences d&#39;interaction biocapteur, et FRET basé dosages de liaison.

<table><tbody><tr><td>Cellules CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>F-12K sans sérum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cultures Lab-Tek II avec chambres en verre borosilicaté #1.5</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td>Lot : 100808-8-0</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342, trihydrochlorure, trihydrate (solution à 10 mg/mL dans l’eau, solution à 16,2 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>470519</td></tr><tr><td>Microscope fluorescent Zeiss Apotome Axiovert 200M</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transpass V</td><td>New England Biolabs</td><td>M2561S</td><td>0030709</td></tr><tr><td>Transpass D2</td><td>New England Biolabs</td><td>M2554S</td><td>0060802</td></tr><tr><td>SNAP-Cell TMR Star</td><td>New England Biolabs</td><td>S9105S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>Plasmide témoin pSNAP-ADBR2</td><td>New England Biolabs</td><td>N9178S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>Plasmide témoin pSNAP-H2B</td><td>New England Biolabs</td><td>N9179S</td><td>0010811</td></tr></tbody></table>

marquage fluorescent du cos-7 exprimant des protéines de fusion snap-tag pour imagerie de cellules vivantes

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag et CLIP-tag systèmes d&#39;étiquetage de protéines permettre au particulier, la fixation covalente de molécules, y compris les colorants fluorescents, à une protéine d&#39;intérêt dans les cellules vivantes. Ces systèmes offrent une large sélection de substrats fluorescents optimisé pour une gamme d&#39;instruments d&#39;imagerie. Une fois cloné et exprimé, la protéine marquée peut être utilisé avec une variété de substrats pour de nombreuses applications en aval sans avoir à cloner à nouveau. Il ya deux étapes à l&#39;aide de ce système: le clonage et l&#39;expression de la protéine d&#39;intérêt comme une fusion SNAP-tag, et l&#39;étiquetage de la fusion avec le substrat de SNAP-tag de choix. Le SNAP-tag est une petite protéine humaine basée sur O<sup&gt; 6</sup&gt;-Alkylguanine-ADN-alkyltransférase (hAGT), une protéine de réparation d&#39;ADN. SNAP-tag étiquettes sont des colorants conjugués à la guanine ou chloropyrimidine groupes partants via un linker benzylique. Dans la réaction de l&#39;étiquetage, le groupe benzyle substitué du substrat est fixée de manière covalente à l&#39;SNAP-tag. CLIP-tag est une version modifiée du SNAP-tag, conçu pour réagir avec benzylcytosine plutôt que dérivés benzylguanine. Lorsqu&#39;il est utilisé en conjonction avec SNAP-tag, CLIP-tag permet l&#39;étiquetage orthogonaux et complémentaires de deux protéines simultanément dans les mêmes cellules.

SNAP-tag et CLIP-tag systèmes d&#39;étiquetage de protéines permettre au particulier, la fixation covalente de molécules, y compris les colorants fluorescents, à une protéine d&#39;intérêt dans les cellules vivantes. Une fois cloné et exprimé, la protéine marquée peut être utilisé avec une variété de substrats pour de nombreuses applications en aval sans avoir à cloner à nouveau.

Marquage fluorescent du COS-7 exprimant des protéines de fusion SNAP-tag pour imagerie de cellules vivantes

Les systèmes de marquage protéique SNAP-tag et CLIP-tag permettent la fixation covalente et spécifique de molécules, notamment de colorants fluorescents, à une protéine d'intérêt...

Étiquette SNAP et étiquette clip. Les systèmes de marquage des protéines permettent l'attachement covalent spécifique de pratiquement n'importe quelle molécule à une protéine d'intérêt. Le gène d'intérêt peut être cloné dans le vecteur de part ou d'autre de l'étiquette ; l'expression du gène cloné donne lieu à une protéine de fusion portant une étiquette SNAP.Le substrat de la balise SNAP se compose de deux parties : la benzoguérine, qui est reconnue par la balise SNAP, et le groupe fonctionnel. Ce groupe fonctionnel peut être la biotine, une microbille ou un groupe fluorochrome, disponibles dans une variété de couleurs. Lors de la réaction de marquage, le groupe benzo substitué s'attache de manière covalente à la balise SNAP en libérant de la guanine. Si un fluorochrome quatre est couplé à la protéine souhaitée, le marqueur émet une fluorescence permettant la visualisation de la protéine dans des cellules vivantes ou fixées.Bonjour, je suis Chris Provost du laboratoire New England Bile Labs. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'imagerie fluorescente de cellules COS sept vivantes exprimant des protéines de fusion marquées Snap. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la localisation des protéines dans les cellules.Commençons. Pour préparer les cellules COS-7 en vue d'une transfection, détachez-les à l'aide de trypsine et placez-les sur de la glace selon les protocoles standard, puis ajoutez 50 à 100 microlitres de cellules à six millilitres de milieu DMEM complet. Mélangez la suspension cellulaire en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Ensuite, répartissez 300 microlitres de la suspension cellulaire trypsinisée dans chaque puits d'une lamelle stérile à huit chambres (Lab-Tek à deux chambres). Incubez les échantillons à 37 degrés Celsius, sous 5 % de dioxyde de carbone, pendant la nuit. Le jour suivant,Vérifiez la densité cellulaire et l'état des cellules dans les chambres de culture. Étiquetez le nombre approprié de tubes microfuge pour les mélanges de complexes d'ADN. Dans une hotte à flux laminaire.Préparez les mélanges de complexes de transfection pour chaque réaction. Utilisez 0,3 microgramme d'ADN plasmidique de fusion snap dilué dans un milieu sans sérum et un microlitre. Chacun des réactifs de transfection TPAs D deux et TPAs v ainsi que les plasmides témoins sont disponibles pour évaluer l'efficacité des réactifs de transfection.Nous recommandons également d'inclure un échantillon transfecté à blanc et/ou un échantillon non résecté comme témoins négatifs pour chaque mélange complexe. Tout d'abord, mélangez le DMEM sans sérum avec l'ADN plasmatique approprié. Ajoutez ensuite le réactif de transfection TPAs D deux, suivi du réactif de transfection TPAs v.Mélangez soigneusement les composants en pipetant doucement plusieurs fois de haut en bas après l'ajout de chaque réactif, puis incubez les réactions à température ambiante pendant 30 minutes. Pendant l'incubation, lavez les cellules une fois avec 600 microlitres de DMEM complet et ajoutez 450 microlitres de DMEM complet à chaque échantillon. Une fois l'incubation terminée, ajoutez lentement, goutte à goutte, 50 microlitres du mélange complexe de transfection à chaque échantillon. Incubez les échantillons toute la nuit à 37 degrés Celsius, sous 5 % de dioxyde de carbone.Le lendemain. Les cellules cost sept transfectées peuvent être marquées avec le substrat Snap Cell TMR Star pour commencer cette procédure : ajouter 50 microlitres de DMSO au substrat Snap Cell TMR Star et mélanger en pipetant de haut en bas ou au vortex pendant une minute. Ensuite, retirer soigneusement par aspiration sous vide le milieu contenant les complexes de transfection de chaque échantillon, puis laver les cellules deux fois avec 600 microlitres de DMEM complet.Ensuite, remplacez le milieu dans chaque puits par 600 microlitres de DMEM complet. Replaquez les échantillons dans l'incubateur. Préparez le milieu de marquage D en ajoutant 995 microlitres de DMEM complet et cinq microlitres de 0,6 millimolaire.Pipeter la solution substrat Snap Cell TMR STAR vers le haut et vers le bas plusieurs fois pour bien mélanger après l'ajout du substrat. La concentration finale de Snap Cell TMR STAR doit être de trois micromoles. Retirer soigneusement le milieu de croissance des échantillons et ajouter 200 microlitres de milieu de marquage DIA dans chaque puits. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. C'est à cette étape que le groupe benzyle du substrat TMR se lie de manière covalente à l'étiquette Snap et libère la quenche tandis que les échantillons sont en incubation.Préparer la solution d'HX pour la coloration nucléaire des échantillons. Mélanger un microlitre de TRI chlorure trihydrochlorure HSED 3 33 42 dans 10 millilitres de DMEM complet. Une fois l'incubation terminée, retirer le milieu de marquage de tous les échantillons et ajouter 600 microlitres de la solution d'HX diluée à chaque échantillon.Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes. Après cinq minutes, retirer la solution diluée contenant le composé greffé de chaque échantillon et laver les échantillons trois fois avec 600 microlitres de DMEM complet. Après le dernier lavage, ajouter 600 microlitres de DMEM complet à chaque échantillon.Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes supplémentaires afin de permettre au fluorure non incorporé de diffuser hors des cellules, ce qui est nécessaire pour le marquage intracellulaire. Après 30 minutes, remplacer le milieu des échantillons de cellules à fixation rapide une dernière fois par 600 microlitres de DMEM complet. Les cellules sont désormais prêtes à être observées au microscope fluorescent Zeis AOME vert 200 M.Voici quelques résultats représentatifs d'imagerie fluorescente obtenus par microscopie fluorescente standard de cellules CO sept vivantes exprimant des fusions avec une étiquette. Cette première image montre des cellules COS sept vivantes exprimant PNAP H deux B marquées avec le réactif SNAP-Cell TMR Star. La construction PNAP H deux B a été générée à l'aide du vecteur PNAP TAG M.Les cellules ont été marquées avec le colorant Snap Cell TMR Star pendant 30 minutes et contre-colorées avec l'Hoechst 33342 pour les noyaux. La fluorescence rose montre la superposition de la fluorescence rouge là où la protéine histone est présente. En complément de la fluorescence bleue indiquant le noyau, l'expression de la protéine H2B est clairement et facilement identifiable.Ces deux images suivantes montrent des cellules Cost7 vivantes transfectées de manière transitoire avec pnap. Des cellules ADR bêta 2 ont été marquées avec Snap Cell, TMR Star, et contre-colorées avec Hux 3 33 42. Le construit pnap ADR bêta 2 a été généré à l'aide du vecteur PNAP TAG M.Les cellules ont été marquées avec le Snap-Cell TMR Star pendant 30 minutes et contre-colorées avec Hoechst 33342 pour les noyaux. La fluorescence rouge indique la présence de la protéine du récepteur de surface membranaire A DR bêta deux, tandis que la fluorescence bleue identifie le noyau. Nous venons de vous montrer comment réaliser une imagerie fluorescente de cellules vivantes de type cough seven exprimant des protéines de fusion avec l'étiquette Snap.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d'ajouter le complexe de transfection lentement et goutte à goutte, et de conserver le substrat de la balise « snap » à moins 20 degrés Celsius à l'abri de la lumière lorsqu'il n'est pas utilisé. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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