Name: Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-06T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Découvrez l'imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA dans des cellules de mammifères vivantes. Cette méthode permet de quantifier la dynamique des chromosomes et la progression mitotique en temps réel.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;American Cancer Society (PF-07-103-01-CSM), le National Institutes of Health (R01 et P30 CA042014 GM61275), la Leukemia and Lymphoma Society et le Huntsman Cancer Foundation.

transfection de siRNA et de préparation de cellules <ol><li> Préparer un 4-II ainsi LabTek chambrée lamelle en ajoutant 0,5 mL de la fibronectine (10μg/mL) dans chaque puits qui seront utilisées. Incuber pendant 10-15 minutes à température ambiante. </li><li> Préparer siARN / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) pour la transfection des complexes inverse selon les instructions du fabricant. Utiliser les quantités recommandées pour l&#39;un et d&#39;un plat de 24 puits par chambre pour être utilisés (100 ul au total). Un produit analogue / protocole pour la transfection de siRNA peuvent être substitués. </li><li> Retirez la fibronectine à partir des puits de la lamelle chambrée. Ajouter 100 pi de siRNA / Lipofectamine complexes RNAiMAX dans chaque puits qui seront utilisées. </li><li> Aliquoter 20000 histone H2B-mCherry cellules exprimant (en 500μL) par puits contenant le mélange de transfection. </li><li> Laisser les cellules à incuber pendant environ 24 heures avant de replacer le mélange de transfection avec 1 ml de milieu de culture cellulaire régulier. </li><li> Incuber les cellules 24 heures supplémentaires avant d&#39;acquisition d&#39;image (48 heures post-transfection). </li></ol> Configuration de microscope et d&#39;acquisition d&#39;image <ol start="7"><li> Il ya trois parties principales de la configuration d&#39;acquisition d&#39;image: 1) une cellule d&#39;incubation qui s&#39;adapte sur la platine du microscope et maintient un milieu humide, constante de 37 ° C et 5% de CO 2, 2) d&#39;un microscope inversé équipé d&#39;une étape automatisée, automatisé volets fluorescence et clair, et les roues à filtres automatiques et 3) un logiciel qui intègre et contrôle la scène, des volets, et roues à filtres. Dans notre configuration d&#39;imagerie, nous utilisons une cellule personnalisée incubateur d&#39;OKO Lab qui peut être utilisé avec la lamelle LabTek II chambrée. La scène, volets, et roues à filtres sont contrôlés par le logiciel Metamorph Astuce:. Le Laboratoire OKO scène dessus du système incubateur comprend des adaptateurs pour une variété de différentes plaques, vaisselle, ou des tailles lamelle. </li><li> Placez le LabTek II chambrée lamelle dans l&#39;incubateur en ouvrant le couvercle de la pré-chauffé et équilibrée incubateur, plaçant le lamelle chambrée dans l&#39;adaptateur, et la tenue en place avec la pâte à modeler. Laissez le couvercle sur la lamelle chambré pour que le milieu de culture cellulaire ne se dessèche pas. Fermer le couvercle et la position de l&#39;ensemble incubateur sur la platine du microscope, veillant à ce que la couveuse est maintenu fermement en place. </li><li> Utiliser Metamorph, configurer votre expérience en sélectionnant &quot;Apps / Acquisition multidimensionnelle» dans la barre de menu du logiciel. Cela fera apparaître une fenêtre dans laquelle vous pouvez sélectionner la fréquence et la longueur de la timelapse, le temps d&#39;exposition pour chaque couleur (si vous faites les réglages multiples), le nombre et l&#39;emplacement des postes de scène, et le nombre de Z-sections (si ) désiré. . Sélectionnez l&#39;emplacement où enregistrer les fichiers de données Astuce: Si vous utilisez un logiciel autre que Metamorph, les fonctions peuvent être légèrement différentes, mais le concept général est le même. Microgestionnaire, les logiciels open source d&#39;acquisition basée sur ImageJ qui est compatible avec la plupart des configurations matérielles, est une excellente alternative. </li><li> . Pour les fins du présent protocole, nous allons acquérir des images à deux longueurs d&#39;onde (clair et mCherry) toutes les 15 minutes pendant 8 heures à 15 postes étape Astuce: Si la résolution de meilleur moment est désirée, alors vous pouvez raccourcir l&#39;intervalle de temps entre les acquisitions, mais , les positions étape de moins peuvent être utilisés, et donc moins de cellules mitotiques sera disponible pour analyse. Il est important lorsque l&#39;on considère des intervalles de temps pour prendre en compte le temps nécessaire pour que la roue de filtres pour basculer entre les ensembles de filtres. </li><li> Déterminer le temps d&#39;exposition optimal pour chaque longueur d&#39;onde d&#39;abord se concentrer sur un champ de cellules en utilisant un éclairage fond clair. Dans le logiciel, réglez la fonction autofocus uniquement pour le canal clair (cela va permettre au logiciel de mise au point automatique à chaque position étape avant chaque acquisition). Conseil: Nous utilisons un sèche 40x à contraste de phase pour objectif de donner une excellente résolution sans la nécessité pour le pétrole . D&#39;autres objectifs peuvent être utilisés en fonction de la résolution optique désirée. </li><li> Passez à l&#39;onde mCherry et enclenchez une image en utilisant une exposition de 50 ms. Réglez le temps d&#39;exposition au minimum requis pour voir une bonne image. Il est essentiel de limiter la quantité d&#39;exposition à la lumière pour assurer la viabilité cellulaire soutenue. En règle générale, cela peut être mieux réalisé en utilisant un filtre de densité neutre (pour réduire le flux lumineux d&#39;excitation) et un temps plus long appareil d&#39;exposition, plutôt que par augmentation de la force d&#39;illumination. Répétez cette procédure pour tous les longueurs d&#39;onde supplémentaires à utiliser. Conseil: Pour déterminer la viabilité cellulaire à long terme à une exposition donnée pour votre expérience, vous pouvez prévisualiser le nombre total d&#39;images d&#39;une cellule peut survivre sur le timelapse désiré en ajustant temporairement l&#39;espacement timepoint de quelques minutes à quelques secondes (soit 10 min. devient 10 secondes). Si vos cellules survivent 100-200 expositions (ou lenombre approprié), puis votre exposition est très bien. Si non, à réduire votre lumière d&#39;excitation, le temps d&#39;exposition, ou le nombre total d&#39;images pour simuler votre expérience complète. </li><li> Ensuite, sélectionner et marquer un nombre approprié de postes stade de sorte que vous pouvez obtenir un échantillonnage suffisant de la population cellulaire. Metamorph va enregistrer les positions et y retournera pour chaque acquisition. Conseil: En général, je essayer de trouver des positions dans lesquelles il ya beaucoup de cellules à l&#39;image, mais pas si nombreux qu&#39;ils sont trop denses. Aussi, il est important de sélectionner suffisamment de postes de telle sorte que vous aurez une bonne chance d&#39;observer un grand nombre de cellules progressant à travers la mitose. </li><li> Après tout Timelapse, temps d&#39;exposition de longueur d&#39;onde, et les informations de position étape ont été enregistrés, sélectionnez le bouton &quot;Aperçu&quot; sur l&#39;écran pour déterminer si le logiciel est de contrôler l&#39;équipement de façon appropriée. </li><li> Lorsque vous êtes satisfait, sélectionnez le bouton &quot;Acquérir&quot; sur l&#39;écran pour commencer l&#39;acquisition. Alors asseyez vous et laissez l&#39;ordinateur et d&#39;un microscope pour faire le travail. Conseil: Respectez l&#39;automatisation à travers au moins une manche complète de l&#39;acquisition pour s&#39;assurer que tout fonctionne correctement. </li></ol> De traitement et analyse d&#39;images <ol start="16"><li> Après l&#39;acquisition est terminée, la prochaine étape est de transférer les données d&#39;image dans une forme qui est facile à manipuler. Pour les fins du présent protocole, je vais d&#39;abord démontrer la façon de générer des films en utilisant Metamorph, puis la façon de générer des montages d&#39;images en utilisant le programme ImageJ. Soit le format sera utile à des fins de quantification. </li><li> La première étape consiste à examiner les données. Pour ce faire, sélectionnez &quot;Apps / Revue données multidimensionnelles&quot; dans la barre de menu. Sélectionnez l&#39;emplacement de vos fichiers, puis sélectionnez «Affichage». Cela vous permettra d&#39;examiner la pile d&#39;images de chaque position étape individuellement. Sélectionnez la position de l&#39;étape désirée, puis &quot;Charger les images&quot;. Vous serez en mesure d&#39;avancer à travers les données de trame par trame. </li><li> Pour ces postes étape dans laquelle les cellules passent par mitose (tel que déterminé par l&#39;ADN et la morphologie cellulaire), vous pouvez faire des films et montages utilisant Metamorph, ou avec d&#39;autres programmes tels que ImageJ (disponible gratuitement grâce NIH). </li><li> Pour faire un film dans Metamorph, sélectionnez «Processus / Save film&quot; dans la barre de menu. Vous serez en mesure de sélectionner les cadres à utiliser, la vitesse et le type de fichier du film. Ensuite, sélectionnez &quot;Enregistrer le film&quot;. </li><li> Pour faire un montage, je sauve la pile d&#39;image comme un fichier. Stk, qui peut être utilisé dans d&#39;autres programmes tels que ImageJ. </li><li> Ouvrez le fichier dans ImageJ et de faire progresser les cadres jusqu&#39;à trouver une cellule en passant par la mitose. . Cultures de la zone autour de la cellule et sélectionnez &quot;Image / Dupliquer&quot; Astuce: Assurez-vous de dupliquer tous les cadres. </li><li> Pour faire un montage, sélectionner &quot;Image / Piles / Faire Montage&quot; dans la barre de menu. Ici vous pouvez spécifier les images que vous souhaitez inclure, la taille et la forme du montage, et si vous voulez les frontières entre les cadres. Sélectionnez celles-ci et cliquez sur &quot;Ok&quot;. .. Enregistrer le montage dans un fichier TIF et tout autre traitement ne soit dans ImageJ ou Adobe Photoshop Astuce: Changer le montage des fichiers du format 16-bit utilisé par Metamorph au format 8 bits pour le traitement de l&#39;image plus facile. </li><li> Pour calculer le temps à différentes étapes de la mitose, déterminer t = 0 (premier signe de condensation ADN ou l&#39;arrondissement des cellules), compter le nombre d&#39;images jusqu&#39;au chromosomes sont alignés à l&#39;équateur (heure en prophase / prométaphase), les cadres jusqu&#39;au chromosomes commencent à séparer les (temps en métaphase), et les cadres jusqu&#39;à ce que les cellules commencent à s&#39;aplatir (anaphase / télophase / cytokinèse). Le temps calculé à chaque étape mitotique dépend de l&#39;intervalle de temps entre chaque image. </li></ol> Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /> La figure 1 illustre les résultats d&#39;une expérience de transfection de siRNA contrôle typique utilisant une lignée cellulaire HeLa exprimant histone H2B-mCherry. Cette méthode a été utilisée de manière efficace afin de quantifier le calendrier mitotique, révélant un rôle inattendu pour le Nup153 nucléoporine dans le calendrier de la fin de la mitose 1. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1.

<ol><li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li>
<li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li>
<li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li>
<li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC%2FC%28Cdc20%29+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li>
<li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li>
<li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li>
<li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li>
<li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li>
<li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li>
<li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li>
<li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li>
</ol>

Avec les progrès récents de l&#39;imagerie et la technologie des protéines fluorescentes, imagerie en temps réel est devenue un aspect de routine de l&#39;analyse cellulaire 2. Une variété de la GFP (et des variantes de couleur autre 3)-protéines étiquetées sont largement disponibles ou relativement faciles à construire et peuvent être utilisés pour suivre un certain nombre de caractéristiques, y compris la division cellulaire ADN / chromosomes dynamiques 4, 5, 6 duplication du centrosome, la cycline B dynamiques 7, la répartition de l&#39;enveloppe nucléaire et le remontage 8, 9, la formation du fuseau mitotique 10, et les différentes étapes de la cytokinèse 11. Tagged protéines peuvent être utilisées seules ou en combinaison lorsque les spectres d&#39;excitation / émission de marqueurs fluorescents sont compatibles, permettant la coordination entre les événements spécifiques à évaluer. Si une plus grande résolution spatiale et / ou temporelle est / sont souhaités, la microscopie confocale à balayage laser à balayage si, le disque tourne, ou la résonance peut être utilisé, et la liste des options de microscopie sophistiquées avec de plus en plus la résolution continue de croître. Imagerie en direct de la mitose des cellules de mammifères a également été adapté pour une utilisation à haut débit ARNi et des écrans de petites molécules 12-14. Ainsi, alors que les premières expériences un s en utilisant cette technique peut être relativement simple, les possibilités de renforcer cette stratégie sont nombreuses.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Lab Tek II Chambered Coverglass (4-puits)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>12-565-337</td><td>Des tailles de chambre supplémentaires sont disponibles</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur cellulaire à plateau</td><td>OKO Lab</td><td></td><td>Peut utiliser toute chambre appropriée</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversé automatisé</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Peut utiliser tout microscope approprié</td></tr><tr><td>Logiciel</td><td>Metamorph</td><td></td><td>Peut utiliser tout logiciel approprié</td></tr></tbody></table>

imagerie time-lapse de la mitose après transfection de sirna

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Les changements dans l&#39;organisation cellulaire et de la dynamique des chromosomes qui se produisent pendant la mitose sont étroitement coordonnés afin d&#39;assurer l&#39;héritage précise du contenu génomique et cellulaire. Hallmark évènements de la mitose, comme le mouvement des chromosomes, peuvent être facilement suivis sur une base en utilisant des cellules individuelles time-lapse de microscopie par fluorescence des lignées cellulaires de mammifères exprimant des protéines GFP-marqués. En combinaison avec l&#39;ARNi basée sur l&#39;épuisement, cela peut être une méthode puissante pour repérer le stade (s) de la mitose où les défauts se produisent après les niveaux d&#39;une protéine particulière ont été abaissés. Dans ce protocole, nous présentons une méthode de base pour évaluer l&#39;effet d&#39;appauvrir une protéine mitotique réglementaires potentielles sur le moment de la mitose. Les cellules sont transfectées avec le siRNA, placé dans une chambre d&#39;incubation étape-top, et imagée en utilisant un microscope à fluorescence automatisées. Nous décrivons comment utiliser le logiciel pour mettre en place une expérimentation time-lapse, la façon de traiter les séquences d&#39;images à faire ou bien encore l&#39;image des montages ou des films, et la façon de quantifier et d&#39;analyser le calendrier des étapes de la mitose en utilisant une lignée cellulaire exprimant mCherry- taggés histone H2B. Enfin, nous discuterons des considérations importantes pour la conception d&#39;une expérience de time-lapse. Cette stratégie est complémentaire à d&#39;autres approches et offre les avantages de 1) la sensibilité aux variations de la cinétique qui pourraient ne pas être observé quand on regarde les cellules en tant que population et 2) l&#39;analyse de la mitose, sans la nécessité de synchroniser le cycle cellulaire en utilisant des traitements médicamenteux. L&#39;information visuelle à partir des expériences d&#39;imagerie telles permet non seulement les étapes de la mitose sous-être évalué, mais il peut également donner un aperçu inattendu qui ne serait pas apparente de l&#39;analyse du cycle cellulaire par FACS.

Nous décrivons ici un protocole de base pour l&#39;image et de quantifier le timing mitotique des mammifères vivent cellules de culture tissulaire après transfection de siRNA.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Les modifications de l'organisation cellulaire et de la dynamique chromosomique qui surviennent pendant la mitose sont étroitement coordonnées afin de garantir l'héritage précis du génome et...

Les changements d'organisation cellulaire et de dynamique des chromosomes qui se produisent pendant la mitose sont étroitement coordonnés afin d'assurer une transmission fidèle du contenu génomique et cellulaire. Dans cet article vidéo, une méthode permettant de suivre les événements marquants de la mitose est présentée. Le déplacement des chromosomes est surveillé au niveau de chaque cellule individuelle à l'aide de lignées cellulaires exprimant des protéines marquées par un fluorochrome.La transfection avec de l'ARNi dirigé contre des protéines mitotiques entraîne des modifications du cycle cellulaire qui peuvent être visualisées par imagerie en temps réel et quantifiées par analyse d'image. Bonjour, je suis Douglas Mackey du laboratoire de Katie Oman à l'Institut du cancer Huntsman de l'Université de l'Utah. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'imagerie de cellules vivantes au fur et à mesure qu'elles progressent en mitose après une transfection SIA.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les effets éventuels de l'altération de protéines d'intérêt sur la chronologie de la progression mitotique. Commençons donc. Préparez une lame de verre à couverture à deux chambres et quatre parois en ajoutant 0,5 millilitre de fibronectine à chacune.Incuber correctement 10 à 15 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, préparer les complexes irna et lip RNAI max pour la transfection inverse. Selon les instructions du fabricant pour chaque chambre, utiliser la quantité recommandée pour un puits d'une plaque de 24 puits.Après 15 minutes, retirez la fibronectine des puits de la lamelle à chambre. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de complexes d'irna dans chaque puit, puis ajoutez 20 000 cellules en 500 microlitres dans chaque puit. Placez les cellules dans l'incubateur pendant 24 heures.Le lendemain, remplacez le mélange de transfection par un millilitre de milieu de culture cellulaire ordinaire, puis incubez les cellules pendant 24 heures supplémentaires avant l'acquisition d'images. Le dispositif d'acquisition d'images comprend un incubateur cellulaire personnalisé qui s'adapte sur la platine d'un microscope inversé, contrôlé par un logiciel d'acquisition d'images. Pour vous préparer à l'acquisition d'images, assurez-vous que l'incubateur est préchauffé et équilibré.Ensuite, ouvrez le couvercle de l'incubateur et placez les cellules avec le couvercle de la chambre dans l'adaptateur. Utilisez une petite quantité d'argile à modeler pour maintenir l'ensemble en place. Fermez le couvercle et positionnez l'incubateur entier sur la platine du microscope en veillant à ce qu'il soit bien fixé.Ensuite, à l'aide de MetaMorph, configurez l'expérience en sélectionnant l'acquisition multidimensionnelle dans la barre de menus du logiciel. Une fenêtre s'affichera, dans laquelle les paramètres d'acquisition d'images peuvent être choisis. Spécifiez l'emplacement où enregistrer les fichiers de données.Ensuite, sélectionnez les longueurs d'onde en champ clair et en mCherry à l'aide de l'objectif à contraste de phase sec à quatre positions TX, focalisez sur un champ de cellules à l'aide du logiciel, puis ajustez la fonction de mise au point automatique uniquement pour le canal en champ clair. Cela permettra au logiciel de faire automatiquement la mise au point à chaque position de la platine avant chaque acquisition. Pour la première longueur d'onde, capturez une image avec un temps d'exposition de 50 millisecondes, puis ajustez le temps d'exposition au minimum nécessaire pour obtenir une bonne image.Il est essentiel de limiter la quantité de lumière reçue afin d'assurer une viabilité cellulaire durable. En règle générale, cela peut être optimisé en utilisant un filtre de densité neutre et un temps de pose plus long pour la caméra, plutôt qu'en augmentant l'intensité de l'illumination.Répétez cette procédure pour toutes les longueurs d'onde supplémentaires. Ensuite, réglez le temps d'exposition pour chaque canal. Puis, définissez un intervalle de prise de vue temporelle de 15 minutes pendant huit heures à 15 positions de la platine.Si une meilleure résolution temporelle est souhaitée, raccourcissez l'intervalle de temps entre les acquisitions. N'oubliez pas que plus le nombre de positions de la platine utilisé est élevé, plus la durée d'acquisition sera longue. À chaque intervalle de temps, sélectionnez et marquez un nombre approprié de positions de la platine afin d'échantillonner adéquatement la population cellulaire.Metamor enregistrera les positions et reviendra à l'emplacement désigné pour chaque acquisition. Après l'exposition en fonction du temps et de la longueur d'onde, les informations relatives au temps et à la position de la platine ont été définies. Sélectionnez le bouton d'aperçu à l'écran pour confirmer que le logiciel contrôle correctement l'équipement.Après vous être assuré que le système fonctionne correctement, sélectionnez le bouton d'acquisition à l'écran pour commencer l'acquisition. Observez l'automatisation pendant au moins un cycle complet d'acquisition afin de vous assurer que tout fonctionne correctement. Ensuite, détendez-vous et laissez l'ordinateur et le microscope effectuer le travail.Pour examiner les données, sélectionnez applications, puis dans la barre de menu choisissez examiner les données multidimensionnelles, sélectionnez l'emplacement du fichier, puis choisissez une position d'étage. Cliquez sur charger les images pour consulter la pile d'images provenant de cette position. Une fois les images chargées, utilisez la souris pour avancer dans les données image par image.Ici, des films de cellules en mitose sont générés à l'aide de Metamorph. Pour créer un film dans Metamorph, sélectionnez « Stack » puis « Make Movie ». Dans la barre de menu, choisissez les images à utiliser, la vitesse et le type de fichier du film.Ensuite, sélectionnez «&nbsp;enregistrer&nbsp;» pour créer un montage. Commencez par enregistrer les données sous forme d'un fichier dot STK dans MetaMorph. Puis ouvrez ImageJ, ouvrez le fichier dot stk dans ImageJ et recadrez une région d'intérêt en délimitant la région et en sélectionnant «&nbsp;Image&nbsp;» puis «&nbsp;Recadrer&nbsp;» dans la barre de menu.Ensuite, sélectionnez les piles d'images. Créez un montage en précisant les images à inclure, la taille et la forme du montage, ainsi que si des bordures entre les images sont souhaitées.Ensuite, cliquez sur OK. Enregistrez le montage sous forme de fichier dot tiff. Enfin, calculez le temps passé dans chaque stade de la mitose en désignant l'image où apparaît le premier signe de condensation de l'ADN ou d'arrondissement cellulaire comme T égal à zéro en prophase.La prométaphase se termine lorsque les chromosomes s'alignent à l'équateur ; la métaphase suit alors jusqu'à ce que la ségrégation de l'ADN commence, puis l'anaphase et la télophase. Enfin, la cytocinèse intervient et les cellules commencent à s'aplatir. Imagerie en accéléré de cellules hilariales exprimant his stone.Des cellules H two BCFP sont présentées. Ces cellules ont été transfectées avec un ARNi témoin et progressent normalement au cours du cycle cellulaire. En comparaison, les cellules transfectées avec des ARNsi ciblant la nucléoporine NUP 153 présentent d'importantes altérations dans la progression de la phase MIT.Nous venons de vous montrer comment configurer, réaliser et analyser une expérience d'imagerie en time-lapse afin de déterminer le moment de la progression mitotique des cellules après une transfection par ARNi. Lors de cette procédure, il est important de manipuler les cellules le plus délicatement possible en maintenant la température appropriée et les concentrations de CO2, ainsi qu'en limitant la quantité de lumière à laquelle les cellules sont exposées. Voilà donc tout ce qu'il faut savoir.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Nous présentons ici la surveillance en temps réel de la migration cellulaire dans un essai de cicatrisation avec les cellules épithéliales mammaires appauvri TIP60 MCF10A. La mise en œuvre de techniques d’imagerie de cellules vivantes dans notre protocole nous permet d’analyser et de visualiser les unicellulaires mouvement en temps réel et au fil du temps.

Vivre-imagerie de la Migration des cellules épithéliales mammaires après la diminution transitoire des TIP60

Nous présentons un protocole pour la synchronisation de la thymidine double de cellules HeLa suivie d’analyse à l’aide de la microscopie confocale haute résolution. Cette méthode est essentielle pour obtenir le grand nombre de cellules qui procèdent de façon synchrone de la phase S de mitose, permettant des études sur les rôles mitotiques de protéines multifonctionnelles qui possèdent également des fonctions de l’interphase.

Combinant la synchronisation cellulaire mitotique et microscopie confocale haute résolution pour étudier le rôle des protéines multifonctionnelles Cycle cellulaire au cours de la mitose

Imagerie de cellules vivantes fournit une foule de renseignements sur des cellules individuelles ou des populations entières qui est inaccessible par cellule fixe d’images seul. Ici, les protocoles d’imagerie de cellules vivantes pour évaluer les décisions de sort de cellule après un traitement par le paclitaxel drogue anti mitotique sont décrits.

À long terme vivre-cellule d’imagerie afin d’évaluer le sort de la cellule en réponse au Paclitaxel

Les divisions cellulaires peuvent être visualisées en temps réel à l'aide de protéines étiquetées fluorescentes et de microscopie en accéléré. En utilisant le protocole présenté ici, les utilisateurs peuvent analyser la dynamique de synchronisation de division cellulaire, l'assemblage mitotique de fuseau, et le congrès et la ségrégation de chromosome. Les défauts dans ces événements suivant l'interférence d'ARN (RNAi)-négocié le gène knockdown peuvent être évalués et quantifiés.

Utilisation des cellules Drosophila S2 pour l'imagerie en direct de la division cellulaire

Ici nous présentons un protocole pour évaluer la dynamique de la formation de fuseau et de la progression mitotique. Notre application de l'imagerie en time-lapse permet à l'utilisateur d'identifier les cellules à divers stades de la mitose, de suivre et d'identifier les défauts mitotiques, et d'analyser la dynamique du fuseau et le destin des cellules mitotiques lors de l'exposition à des médicaments anti-mitotiques.

Imagerie cellulaire en direct pour évaluer la dynamique du moment de la métaphase et le destin cellulaire à la suite de perturbations mitotiques spindle

Nous présentons une méthode pour l’acquisition des cours de temps de rapporteur de fluorescence à partir de cellules simples utilisant des réseaux micropatterned. Le protocole décrit la préparation de réseaux unicellulaires, la mise en place et le fonctionnement de la microscopie time-lapse à balayage de cellules vivantes et un outil d’analyse d’image open source pour la présélection automatisée, le contrôle visuel et le suivi des cours de temps de fluorescence intégrés aux cellules par site...

Imagerie à cellules vivantes de réseaux unicellulaires (LISCA) - une technique polyvalente pour quantifier la cinétique cellulaire

Ce protocole illustre un système de dimérisation des protéines induit chimiquement pour créer des condensats sur la chromatine.  La formation d’un corps nucléaire de leucémie promyélocytaire (LEMP) sur des télomères avec des dimériseurs chimiques est démontrée. La croissance, la dissolution, la localisation et la composition des gouttelettes sont surveillées par imagerie cellulaire vivante, immunofluorescence (IF) et hybridation in situ par fluorescence (FISH).

Condensats de protéines induits par dimérisation chimique sur les télomères

Ce protocole présente un nouveau système de gène rapporteur et la configuration expérimentale pour détecter la transcription aux ruptures double brin de l’ADN avec une sensibilité à une seule molécule.

Imagerie par cellules vivantes de l’activité transcriptionnelle lors de ruptures double brin d’ADN

La microscopie time-lapse est un outil précieux pour étudier la méiose chez la levure bourgeonnante. Ce protocole décrit une méthode qui combine la synchronisation du cycle cellulaire, la microscopie accélérée et l’épuisement conditionnel d’une protéine cible pour démontrer comment étudier la fonction d’une protéine spécifique pendant la ségrégation chromosomique méiotique.

Utilisation de la microscopie accélérée et de l’épuisement nucléaire spécifique au stade des protéines pour étudier la méiose chez S. cerevisiae

Découvrez l'imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA dans des cellules de mammifères vivantes. Cette méthode permet de quantifier la dynamique des chromosomes et la progression mitotique en temps réel.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

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