Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Nous décrivons ici un protocole de base pour l'image et de quantifier le timing mitotique des mammifères vivent cellules de culture tissulaire après transfection de siRNA.

Les changements dans l’organisation cellulaire et la dynamique des chromosomes qui se produisent pendant la mitose sont étroitement coordonnés pour assurer une transmission précise du contenu génomique et cellulaire. Dans cet article vidéo, une méthode de suivi des événements caractéristiques de la mitose est présentée. Le mouvement des chromosomes est surveillé sur une base cellulaire individuelle à l’aide de lignées cellulaires exprimant des protéines marquées par fluorescence.

La transfection avec l’ARNi est dirigée contre les protéines mitotiques, entraîne des changements du cycle cellulaire qui peuvent être visualisés par l’imagerie en accéléré et quantifiés par l’analyse d’image. Bonjour, je m’appelle Douglas Mackey et je travaille dans le laboratoire de Katie Oman à l’Institut du cancer Huntsman de l’Université de l’Utah. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’imagerie de cellules vivantes au fur et à mesure de leur progression dans la mitose après une transfection SIA.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les effets que la perturbation des protéines d’intérêt peut avoir sur le moment de la progression mitotique. Alors commençons. Préparez un verre de couverture à deux chambres à quatre murs en ajoutant 0,5 millilitre de fibronectine à chacun.

Bien incuber 10 à 15 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, préparez les complexes d’ARNi et d’ARNi max des lèvres pour la transfection inverse. Selon les instructions du fabricant pour chaque chambre, utilisez bien la quantité recommandée pour un puits d’une boîte de 24 puits.

Après 15 minutes, retirez la fibronectine des puits du verre de couverture chambré. Ajoutez ensuite 100 microlitres de complexes d’ARNi dans chaque puits aliquote 20 000 cellules de 500 microlitres dans chacune. Bien placez les cellules dans l’incubateur pendant 24 heures.

Le lendemain, remplacez le mélange de transfection par un millilitre de milieu de culture cellulaire ordinaire, puis incubez les cellules 24 heures supplémentaires avant l’acquisition de l’image. La configuration d’acquisition d’images se compose d’un incubateur de cellules personnalisé qui s’adapte à la platine d’un microscope inversé, qui est contrôlé par un logiciel d’acquisition d’images. Pour préparer l’acquisition d’images, assurez-vous que l’incubateur est prévenu et équilibré.

Ensuite, ouvrez le couvercle de l’incubateur et placez les cellules avec le couvercle de la chambre dans l’adaptateur. Utilisez une petite quantité de pâte à modeler pour le maintenir en place. Fermez le couvercle et positionnez l’ensemble de l’incubateur sur la platine du microscope en vous assurant que l’incubateur est fermement en place.

Ensuite, à l’aide de metamorph, configurez l’expérience en sélectionnant l’acquisition multidimensionnelle des applications dans la barre de menu du logiciel. Cela fera apparaître une fenêtre dans laquelle les paramètres d’imagerie peuvent être sélectionnés. Indiquez l’emplacement d’enregistrement des fichiers de données.

Sélectionnez ensuite les longueurs d’onde fond clair et m cerise à l’aide des quatre objectifs de contraste de phase sec TX, faites la mise au point sur un champ de cellules à l’aide du logiciel, ajustez la fonction de mise au point automatique pour le canal Brightfield uniquement. Cela permettra au logiciel de faire la mise au point automatique à chaque position de l’étape avant chaque acquisition. Pour la première longueur d’onde, capturez une image À l’aide d’une exposition de 50 millisecondes, ajustez le temps d’exposition au minimum requis pour voir une bonne image.

Il est essentiel de limiter l’exposition à la lumière pour assurer une viabilité cellulaire soutenue. En règle générale, la meilleure façon d’y parvenir est d’utiliser un filtre à densité neutre et un temps d’exposition de l’appareil photo plus long. Plutôt qu’en augmentant la force de l’éclairage.

Répétez cette procédure pour toutes les longueurs d’onde supplémentaires. Réglez ensuite le temps d’exposition pour chaque canal. Ensuite, désignez un intervalle de temps de 15 minutes pendant huit heures à 15 positions de scène.

Si une meilleure résolution temporelle est souhaitée, raccourcissez l’intervalle de temps entre les acquisitions. N’oubliez pas que plus vous utilisez de positions de scène, plus il faudra de temps pour les acquérir. À chaque intervalle de temps, sélectionnez et marquez un nombre approprié de positions d’étape pour échantillonner correctement la population cellulaire.

Metamor enregistrera les positions et retournera à l’endroit désigné pour chaque acquisition. Après l’exposition de la longueur d’onde en accéléré, les informations de temps et de position de la scène ont été désignées. Sélectionnez le bouton d’aperçu à l’écran pour confirmer que le logiciel contrôle correctement l’équipement.

Après vous être assuré que le système fonctionne, sélectionnez le bouton d’acquisition à l’écran pour commencer l’acquisition. Observez l’automatisation tout au long d’au moins un tour complet d’acquisition pour vous assurer que tout fonctionne correctement. Ensuite, asseyez-vous et laissez l’ordinateur et le microscope faire le travail.

Pour examiner les données, sélectionnez Applications, Examinez les données multidimensionnelles dans la barre de menus, sélectionnez la vue Emplacement du fichier, puis sélectionnez une position de scène. Cliquez sur charger les images pour examiner la pile d’images à partir de cette position. Une fois les images chargées, utilisez la souris pour avancer dans les données image par image.

Ici, des films sont générés à partir de cellules mitotiques à l’aide de métamorphe. Pour faire un film dans Metamorph, sélectionnez pile pour faire un film. Dans la barre des menus, sélectionnez les images à utiliser pour la vitesse et le type de fichier de la vidéo.

Sélectionnez ensuite Enregistrer pour faire un montage. Tout d’abord, enregistrez les données sous forme de fichier point STK dans metamorph. Ouvrez ensuite l’image J Ouvrez le fichier point s stk dans l’image J et recadrez une région d’intérêt en marquant la région et en sélectionnant le recadrage de l’image dans la barre de menus.

Sélectionnez ensuite les piles d’images. Spécifiez les images à inclure dans la taille et la forme du montage. Et si vous souhaitez qu’il y ait entre les bordures du cadre.

Appuyez ensuite sur OK. Enregistrez le montage sous forme de fichier dot tiff. Enfin, calculez le temps à chaque étape de la mitose en désignant le cadre dans lequel le premier signe de condensation de l’ADN ou d’arrondi cellulaire est évident car T est égal à zéro prophase.

La prométaphase se termine lorsque les chromosomes sont alignés à l’équateur, la métaphase se poursuit ensuite jusqu’à ce que l’ADN commence à ségréguer la télophase de l’anaphase. Et enfin, la cytokinèse suit et les cellules commencent à s’aplatir. Imagerie en accéléré des cellules hilaires exprimant son calcul.

H deux BCFP est représenté. Ces cellules ont été transfectées avec l’ARNr de contrôle et progressent normalement tout au long du cycle cellulaire. En comparaison, les cellules qui ont été transfectées avec des siRNA dirigés contre la poring nucléaire NUP 1 53 déplacent des altérations sévères de la progression du MIT.

Nous venons de vous montrer comment configurer, exécuter et analyser une expérience d’imagerie time-lapse pour déterminer le moment de la progression mitotique des cellules après une transfection. Lors de cette procédure, il est important d’être aussi doux que possible avec les cellules en maintenant la température et les concentrations de CO2 appropriées et en limitant la quantité de lumière à laquelle les cellules sont exposées. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.