Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis

Sections en plastique de maintenir la morphologie des tissus vrai dans des coupes minces de tissus qui peuvent être immunocolorées avec des anticorps secondaires fluorescents, rendant cette méthode plus utile que des sections de paraffine ou congelés pour de nombreux types de tissus. La méthode de coloration, d'inclusion plastique, et le sectionnement est démontré dans cette vidéo.

Bonjour, je m’appelle Sotchi. Je suis chercheur postdoctoral dans le laboratoire du Dr Ken Cho au Département de biologie du développement et cellulaire de l’Université de Californie. Irv I Aujourd’hui, je vais vous montrer la préparation de la section simpl de l’embryon de xénope.

Cette procédure comprend la bisection de la coloration de l’embryon de grenouille au stade gazeux avancé avec un anticorps contre la molécule d’intérêt, l’infiltration dans le plastique et la formation d’une même section de plastique de cinq microns. Cette procédure peut être utilisée pour étudier l’immunofluorescence, l’immunohistochimie ou l’hybridation in situ avec une image à très haute résolution. D’accord, ce sont les petits outils pratiques que j’utilise pour la section plastique d’embryons de plus de 10 embryons.

Il s’agit d’une pince à épiler en métal avec pointe delta et celle-ci, numéro un, peut être utilisée pour orienter l’embryon en plastique. Et deuxièmement, il peut être utilisé avec ce pinceau pour transférer l’embryon du microtome à la surface de montage. Il s’agit d’un isolant en caoutchouc de silicone, que je pose à la surface de la lame et qui fait une prise d’eau où je peux monter les tranches d’embryons sectionnés en plastique.

Maintenant, je montre comment couper en deux l’embryon, l’embryon fixe pour le test comme l’hybridation nstitute ou la détection par immunofluorescence. Et pour couper la moitié de l’embryon, j’utilise cette grille désertique très ultra fine, que vous pouvez acheter en épicerie. Je pense que oui, il y a des embryons fixes fixant la cellule 3,7 % formellement élevée pendant la nuit.

Et c’est la, la façon dont vous le résolvez dépend de l’objectif. Ceci est corrigé du jour au lendemain. Dans le but de l’hybridation par incision, vous pouvez opter pour une fixation nocturne, mais pour la détection par immunofluorescence, qui détecte la protéine à l’intérieur de l’embryon, je n’ai pas recommandé une fixation trop longue.

Et je préfère faire la fixation de la hauteur de forme 3,7 % pendant seulement deux heures pour minimiser l’influence sur la localisation subcellulaire de la protéine et également éviter la surfixation pour permettre la belle pénétration de l’anticorps pendant l’étape de détection. D’accord, maintenant je dissèque cet embryon à travers la paroi anti-explosion en coupant le côté gauche et le côté droit. Alors maintenant, je vois qu’il s’agit d’un embryon de stade 11 où le PO est tout le long du côté dorsal au côté ventral, mais bi un embryon.

Et jetons un coup d’œil à cette pièce de droite. Vous voyez le blast po à la fois dans la face dorsale et la face ventrale, mais la face dorsale est évidente parce que cette invagination va clairement au plus profond de l’embryon, profondément à l’intérieur de l’embryon par rapport à la face ventrale. C’est donc un bon morceau, un bon morceau coupé en deux pour étudier à la fois le côté dorsal et le côté ventral.

À l’intérieur de l’embryon, cet embryon disséqué, je vais utiliser la détection par immunofluorescence de la protéine exprimée à l’intérieur de l’embryon. Et pour l’immunofluorescence ou l’immunohistochimie, vous utilisez un anticorps spécifique à l’anticorps pour la détection. Mais le problème est que les anticorps ne pénètrent pas très bien à l’intérieur de l’embryon.

Donc, si vous utilisez un embryon entier, vous ne pouvez pas le savoir. Vous ne pouvez pas étudier le modèle d’expression de vos protéines au niveau de l’embryon. Mais en utilisant cet embryon pré-coupé en deux, vous pouvez étudier ce qui est le modèle d’expression dans la cellule au plus profond de l’embryon.

Ah, l’embryon taché de taches a déjà été fixé dans du formaldéhyde à 3,7 % déshydraté dans de l’éthanol et infiltré dans le plastique, appelé techno 7, 100. Et ce kit contient trois parties, qui sont cette partie principale liquide et cette poudre, qui s’appelle durcisseur un. Et ce liquide appelé durcisseur deux.

Tout d’abord, je mélange cette partie principale et le durcisseur avec 100 reio pour un, ce qui va vous donner ce mélange d’infiltration. Et c’est ça ça, c’est un liquide, dans lequel je suis infiltré cet embryon. Et c’est encore liquide pour qu’il ne durcisse pas encore.

Et c’est cet échantillon d’embryon qui est laissé dans ce mélange d’infiltration pendant la nuit pour s’assurer que l’échantillon d’embryon est complètement résumé dans ce plastique. Maintenant, je prends celui-ci de l’embryon de l’échantillon avec une pipette de transfert et je le transfère dans un tube à paroi mince de 0,5 MPCL, que j’utilise comme moule d’enrobage. Ensuite, de cet embryon, j’enlève l’excès de liquide.

Et maintenant, cet embryon, cet embryon est déjà prêt à être encastré dans le plastique durcissant. Pour fabriquer le plastique durcissant, vous mélangez ce mélange d’infiltration avec ce tube durcissant à 15 contre un. Donc, par exemple, si je prends 750 microlitres de ce mélange d’infiltration pour étayer le tube, alors je suis censé ajouter 50 microlitres de ce durcisseur également pour initier la polymérisation du plastique après l’avoir ajouté, oups, fermez le capuchon puis mélangez doucement comme ceci.

Et vous ne devriez pas faire de vortex car l’oxygène est l’inhibiteur de la réaction de polymérisation. Ajoutez environ 250 microlitres de ce mélange à l’embryon. Et cette étape de polymérisation prend près de quatre heures que vous devriez, vous n’avez pas à vous presser du tout.

Après avoir d’abord ajouté ce plastique polymérisant, vous pouvez le faire monter et descendre pour faire flotter l’embryon dans le plastique. Et maintenant, je prends cette pince à épiler en métal pour pousser autour de l’embryon afin de l’orienter de sorte que la surface de coupe de l’embryon arrive au fond de ce moule d’enrobage. Fermez ensuite le capuchon car l’oxygène est un inhibiteur de la réaction de durcissement et laissez-le pendant quatre heures pour permettre la réaction d’isation.

Après cela, il s’agit d’un troupeau HUD déjà en échantillon. Vous mettez une sorte de colle sur cet échantillon pour vous assurer que cette pièce dure en plastique ne va pas sortir de ce moule. C’est le, c’est un autre plastique qui fonctionne comme une colle à cet effet appelée techno 30 40.

Et je mélange cette poudre et ce liquide avec 2, 2, 1 voici 0,6 gramme de cette poudre. Je vais donc ajouter 300 microlitres de ce liquide, puis le mélanger rapidement et ce plastique devient dur assez rapidement. C’est donc une partie, vous devez être un peu dur puis verser ceci sur cet échantillon déjà entendu.

C’est suffisant. Fermez le bouchon. Je ressemble à ça.

Et cela prendra environ 30 à 60 minutes pour devenir difficile. Et c’est celle-là qui est prête à passer à l’action. Tout d’abord, j’ai coupé la pointe du moule avec un couteau en carton, décollé cette partie de cette pointe de ce moule.

Alors maintenant, cet embryon enchâssé est exposé. Et aussi, j’ai coupé ce capuchon parce que je n’en ai pas besoin. Maintenant, je prends cette aiguille tain Roy, je veux dire pas la lame tain Roy, qui est plus dure que la lame de coloration ordinaire utilisée pour la section de parin.

Je le trempe brièvement dans Xin pour le rendre propre. Réglez-le sur le, réglez-le sur le porte-lame et essuyez l’excès de zaine. Et parfois, je nettoie aussi cette zone avec du zaine parce que la propreté de cette zone est absolument importante.

Il est maintenant prêt pour le sectionnement. Avant de commencer la section, j’installe la chambre de montage. Il s’agit donc de verre diapositive.

Et en plus de cela, je mets ce caoutchouc de silicone et je pousse l’agriculteur à pousser tout le long pour qu’il n’y ait pas de fuite. Et mettez-le sur le chauffe-toboggan et versez cette eau médicale propre pour faire notre piscine. Et mettez autant d’eau que possible pour vous faire obtenir jusqu’à ce que vous obteniez la surface de l’eau de surface de l’inondation.

Et c’est important parce que cette surface d’eau de crue donne une répartition égale de la tension superficielle de l’eau, ce qui est important pour que la section s’étende uniformément. Maintenant, je fais des sections, mais avant de faire cela, je porte ce masque parce que chaque morceau de section est si léger, si léger et mon sein, peut s’envoler de la scène. Alors je porte ce masque.

Et maintenant, commencez à sectionner. Une fois que vous avez un certain nombre de morceaux de section sur la scène, vous le prenez avec un pinceau et vous vous déplacez lentement au sommet de cette chambre de montagne et frappez ce pinceau pour faire entrer ces morceaux dans l’eau par gravité. Et dès qu’ils atterrissent sur l’eau, ils s’étendent pour former une pièce circulaire à la surface de l’eau.

Comment est cette lumière après une nuit sèche. Maintenant, ça ressemble à ceci et à cela. Maintenant, l’échantillon est prêt à entrer en contact avec le DPI pour l’ADN nucléaire.

Et puis vous pouvez étudier au microscope. Aujourd’hui, je vous ai montré la préparation de la section plastique en utilisant un embryon de grenouille au stade gazeux avancé. Cette procédure est très utile pour étudier la sous-cellule ou la localisation des protéines, qui ne peuvent pas être étudiées à l’aide de la technique d’encastrement de paren et aussi en général même pour l’hybridation résiduelle.

Cette section en plastique vous donne également pour même pour l’hybridation résiduelle, cette procédure peut vous donner une image de niveau beaucoup plus élevé que paren ou échantillon de section congelée.