Name: Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Apprenez l'inclusion plastique et le sectionnement d'embryons de Xenopus laevis pour l'immunofluorescence à haute résolution. Cette méthode préserve la morphologie tissulaire et améliore la qualité des images en microscopie.

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Fixation <ol><li> Transfert des embryons entiers ou disséqués en explants MEMFA ou 3,7% FA + PBS dans un flacon à scintillation en verre de petite taille (chat Fisher # 03-339-25B). Incuber sur le flacon nutator à TA, seulement pour 2 heures, et pas plus que cela. Ne laissez pas l&#39;embryon dans la FA pendant plus de 2 heures. D&#39;incubation plus longue dans FA rendra plus difficile le tissu embryonnaire et entraîner une mauvaise pénétration des anticorps dans le processus de détection. </li><li> Aspirer la plupart des FA et ajouter fixateur de Dent au sommet du flacon (4,5 ml ~). Retourner doucement le flacon pour quelques temps à se laver les embryons dans Dent, échange avec un autre 4,5 ml de produits frais de Dent, et il incuber en -20 º C pendant au moins 48 heures. Nuit n&#39;est PAS suffisant. Cette étape permet les embryons plus perméable à l&#39;anticorps. Les embryons peuvent être conservés dans cet état pendant plusieurs semaines. </li></ol> Immunofluorescence <ol><li> Réhydrater le spécimen. Il Incuber dans une série graduée de méthanol, comme suit: <table style="width: 171px; height: 119px;" border="0" cellpadding="3"><tbody><tr><td> 75% de MeOH / H 2 O </td><td> 10min </td></tr><tr><td> 50% de MeOH / PBS </td><td> 10min </td></tr><tr><td> 25% de MeOH / PBS </td><td> 10min </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 10min </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 10min </td></tr></tbody></table> </li><li> Faire agarose à 1,5% / PBS plaques avec 60mm plats en plastique. Verser PBS sur le dessus de l&#39;agarose après qu&#39;il est devenu solide. </li><li> Hemi-sectionnement de l&#39;embryon: Mettez les embryons dans un agarose à 1,5% / PBS assiette. Prenez un embryon avec une paire de pinces et le couper en deux par le centre de l&#39;embryon à l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir mince. Choisissez celles que vous avez réussi à réduire de moitié avec un plan de coupe droite. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_3/188_figure-01.jpg" alt="Figure 1" width="591" height="193" /> </li><li> Transfert des embryons traversée dans un flacon à scintillation en verre avec PBT. Echange avec 4,5 ml de lait de chèvre 20% de sérum + PBT. Incuber à température ambiante pendant 2 heures sur un nutator (blocage). </li><li> Préparer une dilution appropriée de l&#39;anticorps primaire dans le PBT. 0.5ml de cette échantillons par est nécessaire. Par exemple, j&#39;ai utilisé une dilution 1 / 200 de lapin anti-C-cadhérine pAb pour étudier la localisation subcellulaire de C-cadhérine dans 5mm sections en plastique. </li><li> Aspirer la solution de blocage et ajouter 0,5 ml de l&#39;anticorps dilué primaire. Mettre les flacons en stand-up position sur un porte-tube en polystyrène. Incuber une nuit à 4 ° C sur une nutator. </li><li> Retirez les anticorps dilué primaire (cet anticorps primaires dilués peuvent être sauvegardés et réutilisés dans les 1-2 prochaines semaines). Laver avec 4,5 ml de PBT pour 4 fois (40-60 minutes chacun) à température ambiante. </li><li> Echange avec 0,5 ml de dilution de 1 / 100 de biotine-anticorps secondaire conjugué au PBT. Incuber une nuit à 4 ° C sur une nutator. Couvrir les flacons avec du papier aluminium pour protéger la biotine de la lumière. </li><li> De ce point, des précautions doivent être prises pour protéger l&#39;échantillon de la lumière, c&#39;est à dire, garder les flacons dans une certaine couverture ou du papier aluminium. </li><li> Retirez l&#39;anticorps biotine-secondaire (ce peut être également réutilisés dans les 1-2 prochaines semaines). Laver avec ou 4,5 ml de PBT pour 4 fois (40-60 minutes chacun) à température ambiante. </li><li> Echange avec 0.5ml de 1 / 200 de dilution du marqués à la fluorescence (FITC, au Texas, rouge, etc) streptavidine en PBT. Incuber une nuit à 4 ° C sur une nutator. </li><li> Retirez la streptavidine (ce qui peut être réutilisé, aussi). Laver avec 4,5 ml de PBT pour 3 fois (15 - 30 minutes chacun) à température ambiante. </li><li> Fixer les embryons dans 4,5 ml de 3,7% FA + PBS pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Laver avec 4,5 ml de PBS à deux reprises. </li><li> Déshydrater l&#39;échantillon. Il Incuber dans une série graduée d&#39;éthanol, comme suit: <table style="width: 172px; height: 80px;" border="0"><tbody><tr><td> 30% EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 50% EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 75% EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 100% EtOH </td><td> 10 min </td></tr></tbody></table> </li><li> Le spécimen peut être stockée dans EtOH 100% à 4 º C avec une housse pour le protéger de la lumière. </li></ol> L&#39;infiltration <ol><li> Faire mélangez Technovit infiltrations 7100. J&#39;ai l&#39;habitude de prendre 15ml de liquide de base dans un tube 50ml conique, ajouter 150 mg de durcisseur I et le mélanger en basculant sur un nutator pendant 15 minutes. Ce mélange infiltration peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à un mois. </li><li> Infiltrez le spécimen avec le mélange de l&#39;infiltration en échangeant avec une série graduée de l&#39;infiltration Technovit mix / EtOH combo, comme suit: <ol><li> 50% Technovit / EtOH - 1 heure </li><li> 100 Technovit% - 1 heure </li><li> 100% Technovit - nuit </li></ol></li><li> Le specimen peut être stocké dans le mélange infiltration de 100% jusqu&#39;à un mois à 4 º C. Mettez un couvercle sur les échantillons afin de les protéger de la lumière. </li></ol> Embedding <ol><li> Faire mélangez Technovit intégration 7100: Prendre 0,75 ml du mélange d&#39;infiltration dans un tube de 1,5 ml et ajouter 50 ml de durcisseur II. Mélangez-le par les temps le tube retournant plusieurs. </li><li> Avec une pipette de transfert en plastique, prenez un échantillon infiltré durant la nuit dans le tube mince mur de 0.5ml PCR. Retirez la plupart du surnageant. </li><li> Ajouter 0,25 ml du mélange intégration faite à l&#39;étape n ° 1 du présent article, «Intégration», pour l&#39;échantillon. Orienter l&#39;embryon traversée de faire le plan de dissection face vers le bas du tube, en poussant délicatement avec une aiguille à pointe de dissection ternes (bois poignée d&#39;aiguilles de dissection). </li><li> Fermer le capuchon et incuber le tube dans un endroit sombre pendant environ quatre heures pour permettre le plastique polymériser. </li><li> Faire Technovit 3040 mix. Prendre 1 gramme de la poudre dans un plat de pesage, et ajouter 0,5 ml de liquide. Immédiatement, mélanger la poudre et liquide en utilisant un bluetip. Verser sur le dessus du spacimen durci. Ce jaune Technovit 3040 permettra d&#39;éviter l&#39;ensemble du bloc en plastique de sortir du tube. </li></ol> Sectionnement <ol><li> Essuyez Histoknife H avec du xylène (EtOH n&#39;est souvent pas assez bon) et le mettre sur votre microtome. Angle de la lame à 45 ° environ. Essuyez la zone de scène en face de la lame avec le xylène, aussi, parce que la pureté de cette région est essentielle à la qualité des tranches sectionné. </li><li> Couper le côté du tube et le zeste de l&#39;extrémité hors aide d&#39;un couteau en carton. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_5/188_figure-02.jpg" alt="Figure 2" width="818" height="243" /> </li><li> Réglez le spécimen dans le porte-mandrin du microtome. </li><li> Joindre un &quot;press-to-joint&quot; isolant de silicium sur une lame de verre pour faire une chambre de montage pour les tranches de section. Pressez fermement l&#39;isolant à la diapositive sur paillasse propre et regarder de l&#39;autre côté pour s&#39;assurer que l&#39;isolant est totalement attachée sans bulles d&#39;air. Verser propre et chaleureux dH 2 O (~ 40 ° C) à la piscine sur la diapositive à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur, jusqu&#39;au niveau où il peut être vu que la surface de l&#39;eau devient plat, et non pas concave ou convexe en forme. </li><li> Commencez à faire des tranches article. Pour les études d&#39;immunofluorescence, je fais 5 tranches mm de section. Pour des échantillons de l&#39;hybridation in situ, l&#39;épaisseur des tranches peut être ajusté dans la gamme de ~ 3 - 8 mm, selon le but et les intensités des signaux. </li><li> Effectuer les tranches de section de la scène en face de la lame à la chambre de montage avec de l&#39;eau, en utilisant un petit pinceau. Tenir le pinceau avec une tranche sur le dessus de la piscine d&#39;eau et déposez les tranches vers l&#39;eau en le frappant avec une aiguille à pointe ternes dissection. La tranche se lancera dans une forme circulaire dès qu&#39;il frappe la surface de l&#39;eau. </li><li> Quand la plupart de la surface de l&#39;eau de la chambre de montage est rempli avec des tranches de section, sucer presque la moitié de l&#39;eau à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur. Incuber la lame sur une nuit chaude diapositive à rendre l&#39;échantillon complètement sec. </li><li> Contre-tache avec 1ml de DAPI (0.1mg/ml dans TE) pour cinq minutes. Aspirer DAPI et sec de l&#39;échantillon. </li><li> Retirez l&#39;isolation en caoutchouc de silicone de la diapositive. Maintenant les photos peuvent être prises de l&#39;échantillon. Conserver l&#39;échantillon à 4 ° C, protégé de la lumière. </li></ol>

L&#39;anticorps primaire contre votre antigène ou épitope balises: Faire une dilution appropriée de PBT. La biotine conjugué anticorps secondaire: différents fournisseurs vendent biotine-anticorps conjugués.

plastique embedding et le sectionnement des embryons de xenopus laevis

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Sections en plastique de maintenir la morphologie des tissus vrai dans des coupes minces de tissus qui peuvent être immunocolorées avec des anticorps secondaires fluorescents, rendant cette méthode plus utile que des sections de paraffine ou congelés pour de nombreux types de tissus. La méthode de coloration, d&#39;inclusion plastique, et le sectionnement est démontré dans cette vidéo.

Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis

Bonjour, je m'appelle Sochi Ota. Je suis chercheuse postdoctorale dans le laboratoire du Dr Ken Cho au Département de biologie du développement et cellulaire de l'Université de Californie, campus d'Irvine. Aujourd'hui, je vais vous montrer la préparation d'une coupe simple d'embryon de Xenopus.Cette procédure comprend la bissection d'embryons de grenouille au stade tardif de développement gazeux, la coloration avec un anticorps dirigé contre la molécule d'intérêt, l'infiltration dans la plastique et la réalisation d'une coupe en plastique de cinq micromètres d'épaisseur. Cette procédure peut être utilisée pour étudier l'immunofluorescence, l'immunohistochimie ou l'hybridation in situ avec une image de très haute résolution. Voici les petits outils pratiques que j'utilise pour la sectionnement plastique d'embryons, pour plus de 10 embryons.Il s'agit d'une pince métallique à embout delta et celle-ci, numéro un, peut servir à orienter l'embryon dans le plastique. Et numéro deux, elle peut être utilisée conjointement avec ce pinceau pour transférer l'embryon du microtome vers la surface de montage. Ceci est un isolant en caoutchouc de silicone, que je place à la surface de la lame et qui forme un réservoir d'eau dans lequel je peux monter les tranches d'embryons inclus dans du plastique.Maintenant, je montre comment bissecter l'embryon, un embryon fixé destiné à un essai comme l'hybridation in situ ou la détection par immunofluorescence. Pour couper l'embryon en deux, j'utilise cette grille de désert très ultra-fine, que l'on peut acheter en épicerie. Je pense oui, les embryons sont fixés dans 3,7 % de formaldéhyde pendant toute la nuit.Et cela dépend de l'objectif recherché. Cette fixation est effectuée toute la nuit. Pour l'hybridation par incision, une fixation prolongée pendant la nuit est possible, mais pour la détection en immunofluorescence, qui permet de détecter la protéine à l'intérieur de l'embryon, je ne recommande pas une fixation trop longue.Et je préfère effectuer la fixation à 3,7 % en hauteur pendant seulement deux heures afin de minimiser l'influence sur la localisation subcellulaire des protéines et d'éviter une sur-fixation qui permettrait une bonne pénétration de l'anticorps lors de l'étape de détection. Très bien, maintenant je dissèque cet embryon en coupant le mur de la blastula du côté gauche et du côté droit. J'observe maintenant un embryon au stade 11, où l'organe prothoracique s'étend entièrement du côté dorsal au côté ventral, mais un embryon bi.Examinons maintenant ce morceau situé du côté droit. On observe la blastopore à la fois du côté dorsal et du côté ventral, mais le côté dorsal est plus évident, car cette invagination pénètre clairement plus profondément à l'intérieur de l'embryon par rapport au côté ventral. Ce morceau, bien sectionné, est donc approprié pour étudier à la fois le côté dorsal et le côté ventral.À l'intérieur de l'embryon, dans cet embryon disséqué, je vais utiliser une détection par immunofluorescence de la protéine exprimée à l'intérieur de l'embryon. Pour l'immunofluorescence ou l'immunohistochimie, on utilise un anticorps spécifique en vue de la détection. Mais le problème est que l'anticorps pénètre mal à l'intérieur de l'embryon.Ainsi, si vous utilisez un embryon entier en montage complet, vous ne pouvez pas savoir. Vous ne pouvez pas étudier le profil d'expression de vos protéines au niveau de l'embryon. Mais en utilisant cet embryon préalablement divisé en deux, vous pouvez étudier quel est le profil d'expression dans les cellules situées en profondeur à l'intérieur de l'embryon.Ah, l'embryon coloré a déjà été fixé dans du formaldéhyde à 3,7 %, déshydraté dans de l'éthanol et infiltré dans le plastique, appelé Technovit 7100. Ce kit contient trois composants : cette partie principale liquide, cette poudre appelée durcisseur un, et ce liquide appelé durcisseur deux.Je mélange d'abord cette partie principale et le durcisseur dans un rapport de 100 à 1, ce qui donne le mélange d'infiltration. C'est un liquide dans lequel j'infiltre l'embryon. Ce mélange est encore liquide, il ne va donc pas encore durcir.Et ces échantillons d'embryons sont laissés toute la nuit dans ce mélange d'infiltration afin de s'assurer qu'ils sont entièrement imprégnés dans le plastique. Ensuite, je prélève un de ces échantillons d'embryon à l'aide d'une pipette de transfert et le transfère dans un tube PCR de 0,5 mL à paroi fine, que j'utilise comme moule d'encapsulation. Puis, j'élimine le liquide excédentaire de cet embryon.Et maintenant, cet embryon est déjà prêt à être inclus dans la plastification durcissante. Pour préparer le plastique durcissant, vous mélangez ce mélange d'infiltration avec ce durcisseur en tube dans un rapport de 15 à 1. Par exemple, si je prends 750 microlitres de ce mélange d'infiltration dans un tube, je dois alors ajouter 50 microlitres de ce durcisseur afin d'initier la polymérisation du plastique après l'avoir ajouté, oups, refermer le bouchon, puis mélanger délicatement comme ceci.Et vous ne devez pas faire de vortex car l'oxygène est un inhibiteur de la réaction de polymérisation. Ajoutez environ 250 µL de ce mélange à l'embryon. Cette étape de polymérisation dure presque quatre heures ; vous n'avez donc absolument pas besoin de vous presser.Après avoir ajouté ce plastique polymérisant en premier, vous pouvez le faire remonter et redescendre afin de faire flotter l'embryon dans le plastique. Ensuite, je prends cette pince en métal émoussé pour déplacer l'embryon et l'orienter de sorte que la surface de coupe de l'embryon se retrouve au fond de ce moule d'inclusion. Puis, fermez le capuchon, car l'oxygène est un inhibiteur de la réaction de durcissement, et laissez reposer pendant quatre heures pour permettre la réaction de polymérisation.Après cela, ceci est un HUD déjà moulé dans l'échantillon. Vous appliquez un type de colle sur cet échantillon afin de vous assurer que cette partie rigide en plastique ne sortira pas de ce moule. Ceci est un autre plastique qui sert de colle à cette fin, appelé techno 30 40.Et je mélange cette poudre et ce liquide avec un ratio de 2, 2, 1 ; ici, il y a 0,6 gramme de cette poudre. Je vais donc ajouter 300 microlitres de ce liquide, puis le mélanger rapidement, car cette matière plastique durcit assez vite. Cette étape nécessite une certaine fermeté, puis il faut verser ce mélange sur l'échantillon déjà durci.Cela suffit. Fermez le bouchon. J'ai l'air de cela.Et cela prendra environ 30 à 60 minutes pour durcir. Et ceci est celui qui est prêt à être utilisé. Tout d'abord, je coupe l'extrémité du moule avec un couteau à carton, puis j'enlève cette partie d'extrémité de ce moule.Les embryons inclus sont désormais exposés. J'ai également retiré ce capuchon car je n'en ai pas besoin. J'utilise maintenant cette lame Tain Roy, je veux dire pas l'aiguille, la lame Tain Roy, qui est plus dure que la lame habituelle utilisée pour la sectionnement en paraffine.Je trempe brièvement ceci dans du Xin pour le nettoyer. Placez-le dans le porte-lame et essuyez l'excès de zaine. Parfois, je nettoie également cette zone avec du zaine, car la propreté de cette zone est absolument essentielle.Il est maintenant prêt à être inclus. Avant de commencer l'inclusion, j'ai mis en place la chambre d'encollage. Voici donc une lame porteuse.Et par-dessus cela, j'ajoute ce caoutchouc de silicone et je pousse fermement tout autour afin qu'il n'y ait aucune fuite. Placez ceci sur le réchauffeur de lame et versez de l'eau médicinale propre pour former notre bassin. Ajoutez autant d'eau que nécessaire jusqu'à ce que vous obteniez une surface d'eau en crue.Et ceci est important parce que cette surface d'eau de flottaison assure une répartition uniforme de la tension superficielle de l'eau, ce qui est essentiel pour que le lambeau s'étende de manière égale. Maintenant, je réalise les coupes, mais auparavant, je porte ce masque parce que chaque lambeau est si léger, si léger que mon souffle pourrait le faire s'envoler du plateau. C'est pourquoi je porte ce masque.Et maintenant, commencez la sectionnement. Une fois que vous avez un certain nombre de morceaux de section sur la platine, prenez-les avec un pinceau et déplacez-les lentement au-dessus de cette chambre en forme de montagne, puis tapez doucement le pinceau afin que les morceaux tombent dans l'eau par gravité. Dès qu'ils atterrissent sur l'eau, ils s'étendent pour former un morceau circulaire à la surface de l'eau.Comment est cette lumière après le séchage nocturne. Maintenant, elle ressemble à cela et cela. Maintenant, l'échantillon est prêt à être mis en contact avec le DPI pour l'ADN nucléaire.Ensuite, vous pouvez étudier au microscope. Aujourd'hui, je vous ai montré la préparation de coupes plastiques à partir d'embryons de grenouille au stade gaz final. Cette procédure est très utile pour l'étude des structures subcellulaires ou de la localisation des protéines, qui ne peuvent pas être analysées par la technique d'inclusion en paraffine, ainsi que, de manière générale, pour l'hybridation in situ.Cette section plastique vous permet également, même en cas d'hybridation résiduelle, d'obtenir un niveau de signal bien plus élevé que celui des échantillons en section paraffinée ou congelée.

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