Préparation des oligomères β-amyloïde 1-42 Et induction de la plasticité synaptique Dépréciation sur les coupes d'hippocampe
14 juillet 2010
Une caractéristique de la maladie d'Alzheimer est l'élévation de Aß 1-42 Peptide. Ici nous fournissons un protocole pour la préparation de Aß synthétique 1-42 Oligomères, ce qui altère l'hippocampe potentialisation à long terme, une corrélation cellulaires de la mémoire. Cette procédure est utile pour étudier les mécanismes de Aß induite par le dépistage de pathologie et de drogue.
L'amyloïde bêta synthétique 1-42 est mise en suspension dans du HFIP afin de moderniser d'abord le peptide, puis concentrée jusqu'à l'obtention d'un film destiné à la ligamentisation. Le film est remis en suspension dans du DMSO, dilué dans un tampon phosphate et incubé toute la nuit. Enfin, le peptide oligomérique est dilué avec du tampon d'enregistrement et perfusé sur des tranches hippocampiques aiguës, où l'exposition effective de l'amyloïde bêta sur la plasticité synaptique est évaluée.
Bienvenue dans le laboratoire d'Avio Orio à l'Université Columbia à New York. Bonjour, aujourd'hui nous allons vous montrer une procédure que nous avons optimisée pour la préparation de tout le bêta-amyloïde Li Rise, basée sur un protocole initialement proposé par Stein et ses collègues en 2003. Dans ce laboratoire, nous avons utilisé cette procédure pour étudier le dysfonctionnement synaptique induit par l'amyloïde bêta.
Commençons. Laissez le flacon de poudre lyophilisée de bêta-amyloïde atteindre la température ambiante pendant 30 minutes afin d'éviter la condensation lorsqu'il sera ouvert sous la hotte. Ouvrez le flacon et ajoutez du HFIP glacé pour obtenir une concentration finale de bêta-amyloïde de un millimolaire.
Fermez le flacon et faites un vortex pour mélanger ; utilisez une seringue Hamilton pour diviser rapidement la solution en trois parties égales entre des tubes microcentrifugeurs en polypropylène à faible rétention. Fermez les tubes et incubez pendant deux heures à température ambiante afin de permettre au peptide de se mélanger. Ouvrez les tubes et placez-les dans un appareil de concentration sous vide (speed vac) pour concentrer la solution. Faites-les tourner à 800 G sous vide pendant environ 15 minutes.
Veillez à ce que la température ne dépasse pas 25 degrés Celsius afin d'éviter la dégradation des protéines. La centrifugation est terminée lorsqu'un film peptidique sec et clair est visible au fond du tube. Le film peut être difficile à observer : scellez les tubes et conservez les aliquotes inutilisées à moins 80 degrés Celsius pendant un maximum de six mois dans la hotte ; utilisez du DMSO pour resuspendre le film peptidique à une concentration finale de cinq millimolaire, puis soniquez dans un bain d'eau pendant 10 minutes.
Pour garantir une suspension complète du peptide, stockez des aliquotes de 1,6 microlitre de la solution de bêta-amyloïde à cinq millimolaire à moins 20 degrés Celsius. Chaque aliquote ne doit être décongelée qu'une seule fois, la veille de l'expérience : décongelez une aliquote de la solution de bêta-amyloïde à cinq millimolaire et ajoutez 98,4 microlitres de tampon phosphate stérile pour obtenir un volume final de 100 microlitres, vortexez pendant 30 secondes, puis incubez à quatre degrés Celsius pendant 12 heures. Pour permettre le début de la ligamentisation, incubez un lysat hippocampique frais pendant 90 minutes.
Dans le tampon d'enregistrement standard, l'électrode de stimulation est placée sur les collatéraux de Shafer et l'électrode d'enregistrement est placée sur la strate radiale. Une fois qu'une réponse a été obtenue et que la ligne de base est stable pendant 10 minutes, diluez tout ligand bêta-amyloïde à 200 nanomolaire. Le bêta-amyloïde se lie de manière non spécifique au verre dans le tampon d'enregistrement ; utilisez donc du matériel en plastique autant que possible.
Perfuser la solution d'amyloïde bêta sur les tranches pendant 20 minutes. Appliquer la stimulation de tonus X souhaitée. Par exemple, une salve thêta immédiatement après la tétranie, puis revenir à la perfusion avec le tampon d'enregistrement normal.
Surveillez l'enregistrement pendant au moins deux heures après le tetanos afin de confirmer l'induction de la PPL et observer les effets du traitement par le bêta-amyloïde. Nous venons de vous montrer comment préparer l'oligomère de bêta-amyloïde 1 à 42 pour induire une altération de la plasticité synaptique sur des tranches d'hippocampe. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler qu'un séchage excessif du film peptidique peut entraîner une ligandisation incomplète.
Il est également essentiel d'utiliser des plastiques pour les solutions d'amyloïde bêta afin d'éviter la liaison non spécifique des peptides. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.
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Aperçu
Cet article présente un protocole permettant de préparer des oligomères synthétiques d'Aβ 1-42, connus pour altérer la potentialisation à long terme de l'hippocampe, un mécanisme clé lié à la mémoire. La procédure est essentielle pour l'étude de la pathologie induite par l'Aβ et à des fins de criblage de médicaments.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Recherche sur la maladie d'Alzheimer
Contexte
- La maladie d'Alzheimer est caractérisée par des taux élevés du peptide Aβ 1-42.
- Les oligomères d'Aβ 1-42 sont impliqués dans le dysfonctionnement synaptique.
- La potentialisation à long terme (LTP) est un corrélat cellulaire de la mémoire.
- Comprendre les effets de l'Aβ peut contribuer au développement de médicaments.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour la synthèse d'oligomères d'Aβ 1-42.
- Étudier les mécanismes de l'altération synaptique induite par l'Aβ.
- Faciliter le criblage de médicaments à potentiel thérapeutique contre la maladie d'Alzheimer.
Méthodes utilisées
- Résuspension de bêta-amyloïde synthétique dans le HFIP.
- Concentration du peptide en un film destiné à la ligamentisation.
- Résuspension dans le DMSO et incubation dans un tampon phosphate.
- Évaluation de l'exposition au bêta-amyloïde sur des tranches hippocampiques aiguës.
Résultats principaux
- Les oligomères d'Aβ 1-42 préparés altèrent efficacement la plasticité synaptique.
- Le protocole permet d'obtenir des résultats reproductibles dans l'étude du dysfonctionnement synaptique.
- Les résultats contribuent à la compréhension du rôle de l'Aβ dans la pathologie d'Alzheimer.
- Applications potentielles dans le criblage de médicaments destinés au traitement d'Alzheimer.
Conclusions
- Le protocole de synthèse des oligomères d'Aβ 1-42 est efficace et fiable.
- La présente étude améliore la compréhension de l'impact de l'Aβ sur les processus liés à la mémoire.
- Les recherches futures pourront s'appuyer sur ces résultats pour explorer des options thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'altération de la plasticité synaptique hippocampique induite par l'oligomère de β-amyloïde1-42 constitue un modèle solide et pertinent pour la recherche sur les premiers stades de la maladie d'Alzheimer. Ce paradigme permet une réduction mécanistique des risques et confère une confiance prédictive dans la validation des cibles et le criblage de composés en cas de dysfonction synaptique. L'approche facilite le tri du portefeuille en clarifiant la pertinence translationnelle des interventions candidates ciblant les pathologies induites par l'amyloïde.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet d'étudier la dysfonction synaptique induite par les amyloïdes dans un système ex vivo contrôlé.
- Permet une validation fonctionnelle de cibles en quantifiant l'altération du potentiel de longue durée après exposition aux oligomères de β-amyloïde.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques associés aux hypothèses sur la maladie d'Alzheimer au niveau synaptique.
- Offre une plateforme permettant d'évaluer avec une prédiction fiable les composés en phase précoce de développement.
Développement de tests et criblage
- Établit un test reproductible permettant de quantifier l'altération de la plasticité synaptique dans des tranches d'hippocampe.
- Standardise la préparation et l'application de l'oligomère β-amyloïde afin d'obtenir des résultats de test cohérents.
- Permet une évaluation fiable de composés candidats quant à leur capacité à atténuer la perturbation du potentiel de longue durée (LTP).
- Facilite l'extensibilité et la réutilisation de la plateforme pour des initiatives de criblage à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les mécanismes pertinents pour la maladie impliqués dans les premières phases de la pathologie d'Alzheimer.
- Assure une continuité allant de l'interaction avec la cible moléculaire aux effets fonctionnels sur les synapses.
- Éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque en reliant les effets du composé à des biomarqueurs translationnels de la santé synaptique.
- Facilite le choix et la validation de modèles précliniques pour des études in vivo ultérieures.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode fait le lien entre la phase de découverte précoce et la validation préclinique en permettant le test d'hypothèses, la réduction des risques associés à la cible et l'évaluation quantitative de la fonction synaptique en réponse à une exposition aux amyloïdes.
- Biologie de la découverte : Permet le test d'une hypothèse nulle concernant l'altération synaptique induite par les amyloïdes et la clarification des voies impliquées.
- Écrantage : Fournit un test normalisé et reproductible pour l'évaluation de composés contre la perturbation du potentiel de longue durée (LTP).
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de la plasticité synaptique permettant des comparaisons statistiques solides entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les résultats ex vivo à des biomarqueurs pertinents pour la maladie et à des critères précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Propose un flux de travail réutilisable pour la validation continue de cibles et les campagnes d'écrantage dans les portefeuilles de neurodégénérescence.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles de la maladie d'Alzheimer.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et la scalabilité des tests d'altération synaptique.
- Valeur stratégique : Permet une meilleure prise de décision « aller/ne pas aller » et une utilisation plus efficace des capitaux en se concentrant sur des résultats fonctionnels pertinents pour la maladie.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et un développement ajustés au risque des actifs contre la neurodégénérescence.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des peptides, la préparation de tranches hippocampiques et l’enregistrement électrophysiologique.
- Exige un accès à des instruments spécialisés pour la mesure de la PPL et à des systèmes de perfusion contrôlés.
- Implique une standardisation rigoureuse entre équipes pour la préparation des peptides et les protocoles de dosage.
- Peut nécessiter des adaptations selon les différents systèmes modèles ou classes de composés, en fonction de leurs propriétés de solubilité et de liaison.
- Les limites pratiques incluent la variabilité de l’agrégation des peptides et leur sensibilité aux conditions expérimentales.
