Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

L'objectif général de l'expérience suivante est d'activer par photoactivation un agent sensible à la lumière donné, tel qu'un colorant fluorescent chimiquement piégé, dans un embryon de poisson-zèbre vivant, avec une résolution au niveau de la cellule unique. Cela est réalisé en injectant un agent sensible à la lumière dans des embryons au stade une cellule exprimant un marqueur génétique vivant permettant de localiser et de cibler précisément les cellules d'intérêt. Dans un deuxième temps, les embryons sont cultivés puis montés dans un agarose à bas point de fusion, ce qui immobilise l'embryon vivant.

Ensuite, la microscopie à deux photons est utilisée afin de localiser un repère transgénique fluorescent visible. L'agent sensible à la lumière est alors activé dans un plan focal souhaité et l'ampleur de l'activation photochimique est surveillée. Le destin des cellules marquées résultantes peut ensuite être suivi lors de stades embryonnaires ultérieurs.

Cette procédure peut être utilisée pour l'activation d'une variété de composés à une résolution de cellule unique chez des spécimens vivants. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la microscopie confocale ou la lampe flash, est qu'elle permet l'activation photo-induite de tissus relativement profonds à un niveau axial de quelques micromètres avec une phototoxicité relativement faible. Toutefois, la méthode présentée ici est utilisée pour le traçage de bords précis et peut être appliquée à l'activation photo-induite d'une variété de composants, permettant ainsi un contrôle ciblé des processus développementaux et physiologiques. La veille de l'injection, préparez des aquariums d'accouplement en séparant les zebrafish mâles et femelles d'une lignée transgénique exprimant un repère fluorescent visible.

Dans cette expérience, la lignée transgénique exprime la GFP sous le contrôle du promoteur neurogénique N one. Décongeler un aliquot de fluorescéine piégée conjuguée à 5 % de dextrane dans du chlorure de potassium 0,2 molaire sur de la glace. Diluer la fluorescéine piégée dans du chlorure de potassium 0,2 molaire jusqu'à une concentration finale de 1 %. Garder la fluorescéine sur de la glace et la protéger de la lumière. Laisser les croisements de poissons zèbres s'accoupler, recueillir les œufs fertilisés dès qu'ils sont pondus et les rincer comme décrit dans le texte. Utiliser une pipette en plastique pour transférer des embryons au stade une cellule vers une plaque d'injection contenant 1 % d'aros, recouverte de milieu E trois frais, sous un microscope stéréoscopique.

Utilisez la pipette pour orienter les embryons dans les sillons d'injection. Cassez la pointe d'une aiguille capillaire d'injection qui a été étirée en une longue pointe fine. Utilisez une micropipette de chargement pour remplir la seringue par l'arrière avec environ un microlitre de fluorescéine piégée à 1 %.

Placer l'aiguille chargée dans un micromanipulateur fixé à un micro-injecteur pneumatique. Injecter chaque embryon avec deux à trois nanolitres de fluorescéine piégée directement dans le cytoplasme de la cellule. Injecter au moins 50 embryons par expérience.

Transférez les embryons injectés dans une boîte de Pétri contenant du milieu E3 frais, puis incubez-les à l’obscurité à 28,5 degrés Celsius jusqu’au stade de développement souhaité. Inhibez la pigmentation en ajoutant 0,1 % de phénylthréa aux embryons à 24 heures pour préparer le montage des embryons. Enduisez 15 à 20 boîtes de Pétri de 60 millimètres d’une fine couche de 1 % d’agarose dissoute dans du milieu E2 frais ; une fois l’agarose solidifiée, remplissez la boîte avec du milieu E2 sous un microscope stéréoscopique.

Utilisez des pinces fines pour déposer les embryons injectés sur des plaques revêtues. Évitez d'exposer les embryons à l'air. Conservez une aliquote d'agarose à 2 % à point de fusion bas dans l'eau.

Dans un bloc chauffant à 72 degrés Celsius. Utilisez une pipette pasteur polie à la flamme pour transférer un embryon enrobé dans environ 150 microlitres de milieu vers une boîte de Pétri de 60 millimètres. Placez un volume similaire d'Agros à 2 % à côté de l'embryon et mélangez rapidement les deux gouttes ensemble afin d'obtenir une goutte homogène d'Agros à 1 %.

Positionnez l'embryon de manière à ce que son côté dorsal soit orienté vers l'objectif. Laissez l'agarose durcir, puis immergez l'embryon inclus dans du milieu E2. Placez l'embryon fraîchement monté sur un support de platine sous un microscope à deux photons équipé d'un laser à table tournante large bande.

Avant de commencer le processus d'activation photochimique, acquérez une série d'images allant du bord le plus ventral au bord le plus dorsal du tissu exprimant, à 860 nanomètres et dans l'espace. Les images sont espacées de six micromètres sur le plan Z. Sélectionnez le plan Z cible pour l'activation photochimique et mettez-le au point en utilisant la GFP comme repère.

Localisez la région d’intérêt. Prenez une image unique à 860 nanomètres et conservez-la ouverte dans une fenêtre séparée pour un alignement correct. Il est essentiel que le laser à 720 nanomètres soit en état de verrouillage de mode avant d’ouvrir le menu d’édition de la photobléachage.

Utilisez l'image prise à 860 nanomètres pour définir la région d'intérêt ou ROI pour l'activation photo-induite. Dans la fenêtre d'édition du blanchiment, ajustez la puissance relative du laser, le nombre d'itérations et la vitesse de balayage. Pour l'activation photo-induite, appuyez sur blanchiment lorsque le laser s'est arrêté, revenez à 860 nanomètres et acquérez une image en un seul plan afin d'évaluer l'intensité du matériau activé par la lumière résultant.

Acquérir une pile d'images pour évaluer le zsan ou l'épaisseur du domaine activé. De cette manière, il est possible de déterminer empiriquement l'intensité du laser et la durée d'exposition. Pour une photoactivation optimale de chaque clone ou d'une photo croisée, activer tous les embryons restants pour l'expérience.

Avec ces conditions, élever les embryons photo-activés montés à l'obscurité à 28,5 degrés Celsius dans un milieu E2 contenant 0,1 % de phénylthiourée jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade de développement souhaité. Sous un microscope stéréo, utiliser un scalpel pointu pour réaliser une entaille en forme de V dans l'aro près de l'embryon monté, le bas de l'entaille étant orienté vers la tête de l'embryon. Placer une paire de forceps fermée au niveau de l'extrémité de l'entaille.

Ouvrez délicatement la pince en séparant les aros sur toute la longueur de l'embryon afin de libérer l'embryon dans le milieu. Après avoir libéré chaque embryon, utilisez une pipette Pasteur à embout flammé pour le recueillir dans un tube micro-centrifuge. Dans une hotte chimique, fixez les embryons avec du formaldéhyde à 4 % pendant trois heures.

À température ambiante, procédez à la déshydratation, puis à la réhydratation et à la coloration à la phosphatase alcaline conjuguée anti-fluorescéine, ainsi qu'à tous les lavages associés, comme décrit dans le texte accompagnant. Ajoutez 500 microlitres de solution filtrée de rouge rapide aux embryons. Incubez à l'abri de la lumière à température ambiante, en renouvelant la solution de coloration au rouge rapide toutes les heures jusqu'à l'obtention du rapport signal sur fond souhaité.

Arrêter la réaction de coloration par trois lavages dans du PBST de cinq minutes chacun. Dans la hotte, fixer la coloration dans du formaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes. Laver deux fois dans du PBST pendant cinq minutes chacun.

Laver les embryons clairs à travers une série de gradients de glycérol à 25 %, 50 % et 75 % dans du PBS jusqu'à ce que chaque embryon sédimente au fond du tube. Conserver les embryons à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être visualisés au microscope. Pour monter les embryons en vue de leur observation, utiliser une seringue d'un millilitre pour appliquer quatre gouttes de 20 microlitres de graisse silicone claire sur une lame de microscope, aux coins d'un carré de 15 millimètres de côté.

Placer un embryon dans environ 200 microlitres de glycérol à 75 % entre les gouttes de graisse. Poser une lame couvre-objet sur l'embryon. Appuyer doucement la lame couvre-objet vers le bas jusqu'à ce que la solution de glycérol remplisse l'espace.

L'espace entre les gouttes de paraffine contenant les embryons peut être conservé quelques jours à quatre degrés Celsius avant d'être visualisé par microscopie confocale. Cette image montre un embryon de poisson zèbre vivant exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur de neurogen. Un promoteur dans lequel un traceur marqué à la fluorescéine photoactivable a été injecté au stade une cellule selon la méthode décrite précédemment, observé au stade trois à cinq somites.

Une zone discrète des quatre cerveaux primordiaux a été photoactivée par un laser à deux photons, et le colorant traceur fluorescéine libéré a pu être détecté. Après la procédure de photoactivation, l'embryon a été incubé à 28,5 degrés Celsius, et les cellules cérébrales contenant la fluorescéine libérée ont été mises en évidence par immunomarquage anti-fluorescéine en rouge à 24 heures post-fécondation. Remarquez le faible nombre de cellules marquées. Une fois maîtrisée, la procédure de photoactivation peut être réalisée en quelques heures seulement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de garder à l'esprit le contrôle des paramètres optimaux, permettant une photoactivation précise avec une résolution au niveau de la cellule unique.