Name: Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Apprenez la photoactivation à deux photons dans les embryons vivants de Danio rerio pour le marquage cellulaire précis. Cette méthode permet de suivre le destin des cellules activées aux stades embryonnaires ultérieurs.

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Merci sont dus à Génia Brodsky pour la figure graphiques; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, et Leonid Roitman pour des conseils et une assistance technique avec le uncaging deux photons; Maayan Tahor et Suliman Elsadin d&#39;assistance technique; Uwe Strähle d&#39;avoir bien voulu fournir la ligne de journaliste et de neurogenin1 Amos Gutnick pour les commentaires sur ce manuscrit. La recherche dans le laboratoire Levkowitz est soutenu par la Fondation allemande-israélien (le numéro de subvention 183/2007); Israel Science Foundation (numéro de subvention 928/08) et le Harriet &amp; Marcel Dekker Fondation. GL est un titulaire de la Chaire Développement Tauro carrière en recherche biomédicale.

Nous décrivons un protocole de marquage cellulaire à l'aide de fluorescéine en cage, cependant, d'autres photo-activable colorants et les protéines peuvent être également utilisés. 1. L'injection de fluorescéine Caged <ol><li> Préparer une solution stock de 5% (5mg cage-fluorescéine / KCl 100 uL 0,2 M) de dextrane conjuguées 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyle (DMNB) en cage fluorescéine (10.000 MW dextrane, des polymères anioniques, Invitrogen, sondes moléculaires, Carlsbad, CA , cat. aucune. D-3310). Aliquoter et stocker dans -20 ° C. Notez que DMNB-cage fluorescéine est sensible à la lumière et doit être conservé dans l'obscurité. </li><li> Préparer une cuvette d'injection faite de 1% d'agarose (Sigma, St. Louis, MO, cat. Aucune. A9539) comme décrit dans «Le livre de poisson zèbre» 1. </li><li> Préparer deux litres de milieu de l'E3 en diluant une solution stock de 100 x E3. </li><li> Le soir avant l'injection, préparer des cages d'accouplement qui sépare le mâle (s) de la femelle (s) de la ligne souhaitée transgéniques exprimant un point de repère visible fluorescente (GFP, RFP etc) utilisé pour localiser les cellules cibles pour la photoactivation. </li><li> Préparer aiguilles d'injection capillaire (mince paroi de verre capillaires avec filament, Instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride, cat. Aucune. TW100F-6) en utilisant un extracteur micropipette (Instrument Sutter, Novato, CA, P-97). </li><li> Dégeler une aliquote de 5% en cage fluorescéine sur la glace. </li><li> Diluer le solution à 5% en cage stock de fluorescéine dans KCl 0,2 M à une concentration finale de 1%, et de garder sur la glace. Éviter l'exposition lumineuse. </li><li> L'accouplement de configuration traverse préparé à l'étape 4. </li><li> Ramassez les œufs fécondés dès qu'ils sont pondus. Embryons d'Orient stade unicellulaire dans le moule d'injection d'agarose recouvertes de E3 1. </li><li> En utilisant une pointe microloader (Eppendorf, Hambourg, Allemagne, cat. Aucune. 956,003 5242) remblayer une aiguille d'injection avec ~ 1 pl de 1% en cage solution de fluorescéine. </li><li> Placez chargés aiguille dans un micromanipulateur attaché à une essence microinjecteur (pneumatique picopump, World Precision Instruments, Sarasota, Floride, PV820). </li><li> Réglez le volume d'injection 2-3NL et injecter le cage-fluorescéine directement dans le cytoplasme de la cellule. Injecter un minimum de 50 embryons par expérience. </li><li> Incuber embryons dans l'obscurité à 28,5 ° C à l'E3 à l'étape désirée du développement. Si les embryons âgés de plus de 24 heures après fécondation sont analysés, ajouter phénylthiourée 0,1% (PTU, Sigma, St. Louis, MO, cat. Aucune. 22290-9) pour inhiber la pigmentation. </li></ol> 2. Embryon de montage <ol><li> Préparer une nouvelle solution E2 (voir partie des solutions; peuvent être conservés à 4 ° C pendant une semaine). </li><li> Manteau de 60 mm boîte de Pétri avec une couche mince de 1% d'agarose dissous dans le milieu de l'E2. </li><li> Préparer 2% point de basse température de fusion d'agarose (ultra pur agarose LMP, Invitrogen, Carlsbad, CA, n ° 16520100..) Pour l'intégration: dissoudre l'agarose dans l'eau distillée stérile doubler d'ici à chauffage micro-ondes jusqu'à ébullition. Laisser le bouchon du tube ouvert pendant le chauffage. Aliquote de 1 mL dans des microtubes et conserver dans un bloc chauffant à 72 ° C. </li><li> Retirez le chorions des embryons en tirant doucement sur le chorion dehors avec une pince forte (n ° 5). Gardez embryons dans une solution de E2 sur un plat d'agar-couché (voir étape 2). Embryons Dechorionated doivent être manipulés avec polie au feu pipette Pasteur en verre, car ils peuvent coller à Pipettes en polypropylène. Évitez d'exposer l'embryon dechorionized à l'air que ces embryons pourraient être endommagés par la tension de surface liquide. </li><li> Recueillir l'embryon sélectionné dans un petit volume de E2 en utilisant une polie au feu pipette Pasteur en verre, et placer l'embryon sur 60 mm boîte de Petri. Monter une goutte (~ 150 pi) de 2% d'agarose (étape 3) à côté de l'embryon. Mélanger rapidement les deux gouttes d'obtenir un mélange homogène finale ~ 1% d'agarose et en utilisant un microscope à dissection d'orienter l'embryon avec sa face dorsale face à l'objectif. </li><li> Attendez jusqu'à ce que l'agarose est solidifié et ajouter moyenne E2 jusqu'à l'embryon incorporé est immergée dans un liquide. Il est préférable d'obtenir un seul embryon par plat comme il peut être libéré de l'agarose après le processus de photoactivation. </li></ol> 3. Photoactivation <ol><li> Nous utilisons un Zeiss LSM 510 META RNL deux photons microscope équipé d'une large bande accordable (700-1020nm) Mai Tai-HP-laser femtoseconde à partir Spectraphysics. </li><li> Placez l'embryon monté sur un support de plaque sous le microscope. Le point de repère fluorescente dans l'embryon est visualisée à l'aide d'eau immergée 40x/0.8W Achroplan objectif. Pour les étapes suivantes, nous utilisons non descanned détecteur (DDN) avec filtre passe-bande (BP) de 500-550nm. </li><li> Comme condition préalable au processus de photoactivation, obtenir des informations spatiales fluorescent de la région d'intérêt par l'acquisition de séries d'images de la plus ventrale à la partie dorsale du signal détecté fluorescent avec deux photons de longueur d'onde laser de 860nm (pour la détection de la GFP). À cette fin, une résolution suffisante peut être obtenue en utilisant une période de 6 microns entre chaque plan focal acquises. </li><li> Sélectionnez la ciblez-avion pour photoactivation et amener cette région dans le foyer. Selon le but de l'expérimentation, la région d'intérêt peut être soit au sein ou en dehors de la GFP repère visible. Prenez une image unique dans ce plan z. Enregistrer l'image et la garder ouverte dans une fenêtre séparée. </li><li> Régler la longueur d'onde laser à deux photons à 720nm et lorsque le laser est en mode bloqué ouvrir le menu "Modifier l'eau de Javel». Définissez la région d'intérêt (ROI) pour photoactivation en fonction de l'image prise à 860nm (étape 4) en utilisant le menu "Définir la région». Il est crucial de choisir le retour sur investissement de cette image après décalage de la longueur d'onde laser à 720nm comme la dernière action change la positions X, Y du champ observé. </li><li> Ajustez les paramètres suivants pour la photoactivation dans le menu «Modifier l'eau de Javel» (voir étape 9): un pouvoir) laser par rapport; b) le nombre d'itérations; c) la vitesse de balayage. </li><li> "Bleach" de presse dans la fenêtre "Modifier l'eau de Javel» et attendre l'arrêt du laser. </li><li> Revenez à 860nm, acquérir une image plane unique pour évaluer l'intensité de la matière résultant photoactivé et une deuxième série d'acquisition d'image pour évaluer le Z-span (épaisseur) du domaine activé. </li><li> Considérez les paramètres suivants pour la photoactivation: <ol class="lalpha"><li> On doit déterminer empiriquement les conditions optimales pour la photoactivation en faisant varier deux paramètres: l'intensité du laser et la durée de photoactivation. La puissance du laser relative peut être contrôlée par le modulateur acousto-optique (AOM) de transmission. La durée de la photoactivation est une fonction du nombre d'itérations et de la vitesse de balayage. </li><li> Déterminer la gamme linéaire de l'intensité de fluorescence afin d'éviter la saturation de la fluorescence Uncaged. </li><li> Il existe une corrélation linéaire entre l'intensité obtenue par fluorescence des molécules Uncaged et la durée de l'axe z du clone photoactivé 2. </li></ol></li></ol> 4. Détection de la fluorescéine Uncaged <ol><li> Après photoactivation, élever les embryons dans l'obscurité à 28,5 ° C dans un milieu contenant 0,1% E2 PTU pour prévenir l'apparition de la pigmentation de la peau. </li><li> Au stade de développement désiré, retirer l'embryon de l'agarose sous un microscope à dissection. Utiliser un objet pointu scalpel, de créer un "V" incision en forme de l'agarose à proximité de l'embryon afin que le "V" est dirigé vers la tête de l'embryon. Placez une pince fermée au point de le "V" près de la tête de l'embryon et poussez doucement la pince ouverte séparant l'agarose sur toute la longueur de l'embryon et de libérer l'embryon dans le milieu. </li><li> Recueillir les embryons avec une pipette Pasteur polie au feu et de fixer avec du paraformaldéhyde (PFA; 4% en 1 x PBS, pH 7,2) soit pour 3 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Retirer la solution de fixation et rincer 2-3 fois en PBST pendant au moins 5 minutes à température ambiante. </li><li> Lavez embryons avec du méthanol à 100% pendant 10 min, de reconstituer avec du méthanol frais et incuber à -20 ° C pendant au moins 2 heures. </li><li> Réhydrater embryons par des incubations successives (5 mn chacune) dans une série de méthanol dilué dans PBSTr: 80%, 60%, 40% et 20%. Lavez 2 x 10 minutes dans PBSTr. </li><li> Incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans 500 uL de solution de blocage. </li><li> Ajouter une phosphatase anti-fluorescéine-alcaline (AP) des fragments Fab (Roche, Palo Alto, Californie, cat. Aucune. 11426338910), dilué à 1:500 dans une solution de blocage et incuber une nuit à 4 ° C (microtubes place sur les côtés) . </li><li> Laver 5 x 15 minutes dans du PBST. </li><li> Laver pendant 5 minutes dans 0,2 M de NaCl dans la TNT. </li><li> Laver pendant 5 minutes dans 0,4 M de NaCl dans la TNT. </li><li> Equilibrer 3 x 5 minutes dans une solution Prestain fraîchement préparés. </li><li> Dissoudre un comprimé de Fast Red (Roche, Palo Alto, Californie, cat. Aucune. 11496549001) dans 2 ml Prestain solution. Il est recommandé de filtrer la solution en utilisant du papier Whatman n ° 2 à omettre non dissous particules. Alternativement, ralentit solution et utiliser le liquide clair surnageant. </li><li> Ajouter 500 ul solution Fast Red à chaque tube, incuber dans l'obscurité à température ambiante, et le développement moniteur couleur désirée jusqu'à ce que le signal sur bruit est atteint (20 minutes à plusieurs heures). Si de fond se développe, le transfert à 4 ° C. Après une heure d'incubation, de reconstituer avec une solution nouvelle coloration Fast Red. </li><li> Arrêter la réaction de coloration par 3 x 5 minutes lavages en PBST. </li><li> Fix pendant 20 minutes dans 4% PFA à température ambiante. </li><li> Lavez 2 x 5 minutes dans du PBST. </li><li> Embryons clair à travers une série de 25%, 50% et 75% de glycérol dans du PBS jusqu'au embryons sont déposés au fond du tube. Les embryons peuvent être conservés à 4 ° C pendant quelques jours. </li></ol> 5. Visualisation fluorescent de l'Espace Uncaged <ol><li> Préparer une lame de microscope pour le montage: en utilisant une seringue de 1 mL appliquer quatre taches de graisse silicone transparent sur la diapositive, placé à une distance de ~ 15mm de l'autre. Mont de l'embryon au Center dans ~ 200 ul de glycérol 75% et placer une lamelle (n ° 0; 18x18mm) sur le dessus et doucement pousser contre le silicone jusqu'à ce que la solution de glycérol occupe la surface entre les diapositives. </li><li> Placez l'embryon monté sur la scène et de le mettre en mise au point avec un objectif 40x. Acquérir une confocale Z-série d'images en utilisant 488nm Argon et 543nm lasers HeNe comme source d'excitation. </li><li> La durée de l'axe z du domaine photoactivatated peuvent être analysés en utilisant la reconstruction 3D de l'embryon Uncaged aide d'un logiciel d'analyse d'image. </li></ol> 6. Solutions <table border="1"><tbody><tr><td> 100 x E3 </td><td> 174mm de NaCl, KCl 21mm, 12mm MgSO 4, 18mm Ca (NO3), 15mm HEPES, pH = 7,4. Stériliser par filtration et stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> 20 x E2 </td><td> 0,3 M de NaCl, 10 mM KCl, 20 mM CaCl 2 * 2HOH, 20mm MgSO 4 * 7HOH, 3mm KH 2 PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 * 2HOH, filtrat et stocker à la température ambiante </td></tr><tr><td> 1 x E2 </td><td> Diluer 20 x E2 dans l'eau bidistillée et ajouter fraîchement NaHCO 3 (à la concentration finale de 0,7 mm), pénicilline et streptomycine (solution diluée streptocoque stylo pour une concentration finale de 1 x qui contient 100U de pénicilline et la streptomycine 100mg par ml (Invitrogen , Carlsbad, CA, cat. aucune. 15140-122)) </td></tr><tr><td> PBST </td><td> 0,1% de Tween-20 dans du PBS </td></tr><tr><td> PBSTr </td><td> Triton de 0,3% en PBS </td></tr><tr><td> Solution de blocage </td><td> 10% de BSA, Triton 0,3%, 1% de DMSO dans du PBS </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 100 mM Tris-HCl pH-7.5, 150 mM NaCl, 0,5% Tween-20 dans de l'eau bidistillée </td></tr><tr><td> Solution Prestain </td><td> 100 mM Tris-HCl pH-8.2, 0,4 M de NaCl, 0,1% Tween-20 dans de l'eau bidistillée </td></tr></tbody></table> 7. Les résultats représentatifs Un exemple de l'utilisation de la microscopie à deux photons pour photoactiver agents dans un embryon de poisson zèbre vivant est présenté. En utilisant une approche similaire que nous avons déjà tracé la lignée de la photoactivé étiquetés progéniteurs neuronaux dans le cerveau de poisson zèbre 2,3. La figure 1 montre photoactivation d'un colorant fluorescéine cage conjugués dans la plaque neurale antérieure de l'embryon de poisson zèbre portant un neurog1:: gfp journaliste transgène, qui a servi de point de repère direct intrinsèque. Les embryons ont été injectés avec de la fluorescéine en cage au stade une cellule et embarqué dans l'agarose au stade du bouton. A 3 - 5-somite scène les coordonnées spatiales ont été mesurés dans le neurog1:: gfp transgéniques embryon afin de déterminer la région d'intérêt (ROI) pour uncaging (figure 1A, A '). Nous Uncaged le traceur lignée fluorescéine dans un domaine spécifique de la plaque neurale (figure 1B, B '). Par la suite, le sort de ce sous-domaine donné progénitrices neurales étiqueté a été déterminée à prim5 (24 heures après fécondation) étape par immunomarquage de l'Uncaged fluorescéine (figure 1C, C '). L'étendue de deux photons laser uncaging, c'est à dire l'intensité de la fluorescence Uncaged et l'épaisseur du domaine photoactivé (z-span), peut être contrôlée en ajustant deux paramètres: l'intensité du laser et la durée. Ce dernier peut être contrôlé par un ajustement du nombre d'itération et la vitesse de balayage (voir partie 3, étape 9; Russek-Blum, 2009). Dans l'exemple montré dans la figure 1, nous avons utilisé la puissance du laser relative de transmission OMA 12%, 20 itérations et vitesse de balayage de 25,6 msec / pixel. En utilisant ces paramètres, nous étiquetés contenant un ROI de 90 à 10 cellules et un photoactivé z de vie de 30 um (~ 1-2 rangées de cellules). <img src="/files/ftp_upload/1902/1902fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Un résultat Représentant de photoactivation de fluorescéine en cage dans embryons de poissons zèbres en direct en utilisant microscopie à deux photons. Illustration schématique (AC) et des images représentatives (A'-C ') du processus de photoactivation. En direct d'embryons de poisson zèbre (A, A ') exprimer la GFP sous le contrôle de Neurogenin-1 promoteur (neurog1:: GFP) qui a été injecté avec cage fluorescéine traceur au stade 1 cellule. Au 3-5 - stade de somites, une zone discrète de l'ébauche du prosencéphale (diencéphale) a été photoactivé et le Uncaged fluorescéine colorant traceur a pu être détecté (B, B '). Suite à la procédure de photoactivation, l'embryon a été incubé à 28,5 ° C et les cellules du cerveau contenant la fluorescéine ont été tracées par Uncaged anti-fluorescéine immunomarquage moins 24 heures après fécondation (HPF, C, C '). Dien, diencéphale;. Tel, télencéphale..

<ol><li>Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. (1995).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Russek-Blum, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neuronal+cluster+size+is+determined+during+early+forebrain+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning.</a> Development. 135, 3401-3413 (2008).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Staudt, N., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prethalamus+Is+Established+during+Gastrulation+and+Influences+Diencephalic+Regionalization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization.</a> PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Bulina, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore-assisted+light+inactivation+%28CALI%29+using+the+phototoxic+fluorescent+protein+KillerRed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed.</a> Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).</li>
<li>Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+chemistry+with+caged+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Controlling cell chemistry with caged compounds.</a> Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).</li>
<li>Wieboldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+precursors+of+glutamate%3A+synthesis%2C+photochemical+properties%2C+and+activation+of+glutamate+receptors+on+a+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).</li>
<li>Marque, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+caged+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Using caged neurotransmitters.</a> Nature. 337, 583-584 (1989).</li>
<li>Zucker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorelease+techniques+for+raising+or+lowering+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2.</a> Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).</li>
<li>Neveu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caged+retinoic+acid+for+one-+and+two-photon+excitation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).</li>
<li>Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-controlled+gene+silencing+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos.</a> Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).</li>
<li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA%2FDNA+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nat Genet. 28, 317-325 (2001).</li>
</ol>

Photo-activable composés sont des molécules dont la fonction est masqué jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient éclairés par une longueur d&#39;onde spécifique (généralement UV), induisant une réaction photochimique qui convertit les molécules dans un état biologiquement ou chimiquement active. Ces sondes fournissent des outils très puissants dans la recherche en biologie cellulaire, puisque l&#39;activation peut être contrôlée avec précision temporellement et spatialement en limitant leur exposition à la lumière. <p class...

<table><tbody><tr><td>Dextran conjugué à la fluorescéine piégée par le 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyle (DMNB) (dextran de 10 000 Da, anionique)</td><td>Invitrogen</td><td>D-3310</td><td>probes moléculaires</td></tr><tr><td>Agarose pour bac d'injection et plaques revêtues</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre à paroi mince avec filament</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-6</td><td></td></tr><tr><td>Tireuse de micropipettes</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Embouts Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Microbombe pneumatique</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Phénylthiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22290-9</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion pour le montage des embryons</td><td>Agarose UHP à bas point de fusion</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>Fragments Fab anti-fluorescéine conjugués à la phosphatase alcaline (AP)</td><td>Roche Group</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>Rouge rapide</td><td>Roche Group</td><td>11496549001</td><td></td></tr></tbody></table>

deux-photon-based photoactivation dans live embryons de poissons zèbres

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation de composés cibles dans un organisme vivant a prouvé une approche intéressante pour étudier divers processus biologiques tels que le développement embryonnaire, la signalisation cellulaire et la physiologie adulte. À cet égard, l&#39;utilisation de multi-microscopie biphotonique permet photoactivation quantitative d&#39;un agent donné réactive la lumière dans les tissus profonds, à une résolution seule cellule. Comme embryons de poissons zèbres sont optiquement transparents, leur développement peut être contrôlé in vivo. Ces traits font le poisson zèbre, un organisme modèle parfait pour contrôler l&#39;activité d&#39;une variété d&#39;agents chimiques et des protéines par la lumière concentrée. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de la microscopie à deux photons pour induire l&#39;activation de la cage chimiquement la fluorescéine, qui à son tour nous permet de suivre le destin des cellules dans des embryons de poisson zèbre en direct. Nous utilisons des embryons exprimant un point de repère direct génétique (GFP) pour localiser et cibler précisément les cellules d&#39;intérêt. Cette procédure peut être également utilisé pour l&#39;activation induite précise la lumière des protéines, des hormones, des petites molécules et autres composés en cage.

Microscopie multiphotonique permet de contrôler les photons de basse énergie avec une pénétration profonde et optiques phototoxicité réduite. Nous décrivons l&#39;utilisation de cette technologie pour l&#39;étiquetage de cellules vivantes dans des embryons de poissons zèbres. Ce protocole peut être facilement adapté à la photo-induction de diverses molécules lumière réactive.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

La photoactivation de composés cibles dans un organisme vivant s'est avérée être une approche précieuse pour étudier divers processus biologiques tels que le développement embryonnaire...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'activer par photoactivation un agent sensible à la lumière donné, tel qu'un colorant fluorescent chimiquement piégé, dans un embryon de poisson-zèbre vivant, avec une résolution au niveau de la cellule unique. Cela est réalisé en injectant un agent sensible à la lumière dans des embryons au stade une cellule exprimant un marqueur génétique vivant permettant de localiser et de cibler précisément les cellules d'intérêt. Dans un deuxième temps, les embryons sont cultivés puis montés dans un agarose à bas point de fusion, ce qui immobilise l'embryon vivant.Ensuite, la microscopie à deux photons est utilisée afin de localiser un repère transgénique fluorescent visible. L'agent sensible à la lumière est alors activé dans un plan focal souhaité et l'ampleur de l'activation photochimique est surveillée. Le destin des cellules marquées résultantes peut ensuite être suivi lors de stades embryonnaires ultérieurs.Cette procédure peut être utilisée pour l'activation d'une variété de composés à une résolution de cellule unique chez des spécimens vivants. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la m

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous décrivons ici une méthode pour le montage embryons de poissons zèbres à long terme d'imagerie, l'imagerie à deux photons et les tissus des dommages-techniques, et time-lapse imagerie confocale.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Une méthode est décrite pour photoactiver cellules individuelles contenant une protéine fluorescente utilisant cage absorption à deux photons à partir d'un Ti: saphir oscillateur laser femtoseconde. Pour mapper le destin de la cellule photoactivé, l'immunohistochimie est utilisée. Cette technique peut être appliquée à n'importe quel type de cellule.

Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

Ici, nous présentons une méthode permettant la commutation photoactivée de protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFP) dans l’embryon vivant de poisson zèbre, ainsi que le suivi ultérieur de la protéine photoconvertie à des points temporels spécifiques au cours du développement. Cette méthodologie permet de surveiller les événements de biologie cellulaire sous-jacents à différents processus développementaux dans un organisme vertébré vivant.

Suivi cellule à l&#39;aide protéines photoconvertible cours de développement poisson zèbre

L’imagerie du comportement dynamique des organites et d’autres structures subcellulaires in vivo peut faire la lumière sur leur fonction dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous présentons des méthodes de marquage génétique de deux organites, les centrosomes et les mitochondries, et d’imagerie de leur dynamique dans des embryons de poisson-zèbre vivants à l’aide de la microscopie à grand champ et confocale.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

La mitose est essentielle à tout organisme vivant et les défauts entraînent souvent le cancer et des troubles du développement. En utilisant ce protocole d’imagerie et le poisson-zèbre comme système modèle, les chercheurs peuvent visualiser la mitose dans un organisme vertébré vivant et la multitude de défauts qui se produisent lorsque les processus mitotiques sont défectueux.

Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

Une combinaison des techniques optiques avancées de lecture avec excitation de fluorescence multi-photons longue longueur d’onde de laser a été mis en œuvre pour capturer l’imagerie haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de la migration de la crête neurale en Tg (sox10:EGFP) et les embryons de poissons zèbres Tg (foxd3:GFP).

Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre

Nous présentons ici un protocole pour montrer comment cellule photoconversion est réalisée grâce à l’exposition aux UV dans des zones spécifiques exprimant la protéine fluorescente, Eos, chez les individus vivants.

Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie

Ce protocole décrit une méthode pour la photoconversion de la protéine fluorescente de Kaede dans les cellules du vivant endocardiques embryon de poisson zèbre qui permet le suivi des cellules endocardiaques pendant le canal atrio-ventriculaire et le développement de valve auriculo-ventriculaire cardiaque .

Mouvements de tissu endocardique suivant via Photoconversion de cellules dans l’embryon de poisson zèbre

Ce protocole décrit une approche pour l’étiquetage in toto et l’imagerie multidimensionnelle du développement oculaire précoce du poisson-zèbre. Nous décrivons l’étiquetage, l’intégration et l’imagerie quadridimensionnelle (4D) à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les considérations relatives à l’optimisation de l’acquisition d’ensembles de données pour disséquer les mécanismes de morphogenèse optique en coupe.

Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

La manipulation optogénétique des voies de signalisation peut être une stratégie puissante pour étudier comment la signalisation est décodée dans le développement, la régénération, l’homéostasie et la maladie. Ce protocole fournit des directives pratiques pour l’utilisation d’activateurs de signalisation nodaux et de protéines morphogéniques osseuses (BMP) basés sur le domaine de détection lumière-oxygène-tension dans l’embryon précoce du poisson-zèbre.

Activation de la signalisation optogénétique chez les embryons de poisson-zèbre

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour examiner l’activité neuronale dans les régions cérébrales du poisson-zèbre transgénique qui expriment des indicateurs calciques GCaMP à l’aide de la microscopie confocale.

In vivo Imagerie confocale par fluorescence de l’activité neuronale induite par la stimulation sensorielle chez des larves de poisson-zèbre partiellement restreintes

Apprenez la photoactivation à deux photons dans les embryons vivants de Danio rerio pour le marquage cellulaire précis. Cette méthode permet de suivre le destin des cellules activées aux stades embryonnaires ultérieurs.

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