Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

L’objectif global de l’expérience suivante est de photo-activer un agent sensible à la lumière donné, tel qu’un colorant fluorescent en cage chimique, dans un embryon de poisson-zèbre vivant à une résolution de cellule unique. Ceci est réalisé en injectant un agent sensible à la lumière dans des embryons à un stade cellulaire exprimant un repère génétique vivant pour localiser et cibler avec précision toutes les cellules d’intérêt. Dans un deuxième temps, les embryons sont cultivés et montés dans un aéros à faible point de fusion, qui immobilise l’embryon vivant.

Ensuite, la microscopie à deux photons est utilisée afin de localiser un point de repère transgénique visible en fluorescence. L’agent sensible à la lumière est ensuite activé dans un plan focal souhaité et l’étendue de la photoactivation est surveillée. Le devenir des cellules marquées qui en résultent peut ensuite être retracé à des stades embryonnaires ultérieurs.

Cette procédure peut être utilisée pour l’activation d’une variété de composés à une résolution de cellule unique dans des échantillons vivants. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la microscopie confocale ou la lampe flash, est qu’elle permet la photoactivation de tissus relativement profonds au niveau axial de quelques microns avec une phototoxicité relativement faible. Mais la méthode présentée ici est utilisée pour le traçage du bord seline et elle peut être appliquée pour la photoactivation d’une variété de composants, ce qui permet un contrôle ciblé des processus développementaux et physiologiques.

Dans cette expérience, la lignée transgénique exprime la GFP sous le contrôle d’un promoteur neurogène N décongeler une aliquote de 5 % de fluorescéine en cage conjuguée de dextran dans 0,2 molaire de chlorure de potassium sur glace diluer la fluorescéine en cage dans 0,2 molaire de chlorure de potassium à une concentration finale de 1 % Conserver la fluorescéine sur la glace et la protéger de la lumière. Laissez les croisements de poissons-zèbres s’accoupler, récupérez les œufs fécondés dès qu’ils sont pondus et rincez-les comme décrit dans le texte. À l’aide d’une pipette en plastique, transférez les embryons d’un stade cellulaire dans une plaque d’injection de 1 % aros qui a été recouverte d’un milieu frais E three sous un microscope de dissection.

Utilisez la pipette pour orienter les embryons dans les auges d’injection. Cassez l’extrémité d’une aiguille d’injection capillaire qui a été tirée en un long cône. Utilisez une pointe de micro-chargeur pour remplir l’aiguille avec environ un microlitre de fluorescéine en cage à 1 %.

Placez l’aiguille chargée dans un manipulateur micrométrique fixé à un micro-injecteur pneumatique. Injectez dans chaque embryon deux à trois nanolitres de fluorescéine en cage directement dans le cytoplasme de la cellule. Injecter au moins 50 embryons par expérience.

Transférez les embryons injectés dans une boîte de Pétri contenant du milieu frais E trois incuber dans l’obscurité à 28,5 degrés Celsius jusqu’au stade de développement souhaité pour inhiber la pigmentation à 0,1 %Phényle threa aux embryons à 24 heures pour préparer le montage des embryons. Enduire des boîtes de Pétri de 15 à 2060 millimètres d’une fine couche de 1 % d’Aros dissous dans un milieu frais E deux lorsque l’aros s’est solidifié. Remplissez le plat de milieu E two sous un microscope à dissection.

Utilisez des pinces tranchantes pour enrober les embryons injectés sur des plaques revêtues. Évitez d’exposer les embryons à l’air. Conservez une aliquote de 2 % de points de fusion bas dans l’eau.

Dans un bloc de chaleur à 72 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette polie au feu, transférez un embryon enrobé dans environ 150 microlitres de milieu à une boîte de Pétri de 60 millimètres. Placez un volume similaire de 2 % d’aros à côté de l’embryon et mélangez rapidement les deux gouttelettes pour obtenir une gouttelette homogène de 1 % d’Agros.

Orientez l’embryon avec sa face dorsale face à la lentille de l’objectif. Laissez l’aros se solidifier, immergez l’embryon encastré dans le milieu E deux. Placez l’embryon fraîchement monté sur un support de plaque sous un microscope à deux photons équipé d’un laser à large bande.

Avant de commencer le processus de photoactivation, acquérez une série d’images du bord le plus ventral au bord dorsal du tissu exprimant à 860 nanomètres et dans l’espace. Les images sont distantes de six microns sur le plan Z. Sélectionnez le plan Z cible pour l’activation de la photo et faites-le apparaître en utilisant GFP comme point de repère.

Localisez la région qui vous intéresse. Prenez une seule image à 860 nanomètres et gardez-la ouverte dans une fenêtre séparée pour un bon alignement. Il est crucial que le laser à 720 nanomètres soit dans un état de verrouillage avant d’ouvrir le menu d’édition de l’eau de Javel.

Utilisez l’image prise à 860 nanomètres pour définir la région d’intérêt ou le retour d’intérêt pour l’activation de la photo. Dans la fenêtre d’édition de l’eau de Javel, ajustez la puissance relative du laser, le nombre d’itérations et la vitesse de balayage. Pour l’activation photo, appuyez sur l’eau de Javel lorsque le laser s’est arrêté, revenez à 860 nanomètres et acquérez une image à plan unique pour évaluer l’intensité du matériau photoactivé résultant.

Collectez une pile d’images pour évaluer le zsan ou l’épaisseur du domaine activé. De cette façon, il est possible de déterminer empiriquement l’intensité laser et la durée d’exposition. Pour une activation photographique optimale de chaque clone ou photo croisée, activez tous les embryons restants pour l’expérience.

Dans ces conditions, soulevez les embryons photoactivés montés dans l’obscurité à 28,5 degrés Celsius dans un milieu E deux contenant 0,1 % de phénylthio urée jusqu’à ce qu’ils aient atteint le stade de développement souhaité. Sous un microscope à dissection, utilisez un scalpel pointu pour faire une encoche en forme de V dans l’aros près de l’embryon monté, le bas de l’encoche pointant vers la tête de l’embryon. Placez un ensemble de pinces fermées à la pointe de l’encoche.

Ouvrez doucement la pince en séparant les aros sur toute la longueur de l’embryon et en libérant l’embryon dans le milieu. Après avoir libéré chaque embryon, utilisez une pipette de pâturage polie au feu pour le recueillir dans un microtube à centrifuger. Dans une hotte chimique, fixez les embryons avec 4 % de formaldéhyde pendant trois heures.

À température ambiante, procéder à la déshydratation, à la coloration par réhydratation à la phosphatase alcaline, conjuguée, anti-fluorescéine et à tous les lavages associés comme décrit dans le texte d’accompagnement. Ajoutez 500 microlitres de solution rouge rapide filtrée aux embryons. Incuber dans l’obscurité à température ambiante et se réapprovisionner avec une nouvelle solution de coloration rouge rapide toutes les heures jusqu’à ce que le rapport signal/bruit de fond souhaité soit atteint.

Arrêtez la réaction de coloration avec trois lavages en PBST de cinq minutes chacun. Dans la hotte, fixez la tache dans du formaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes. Lavez deux fois au PBST pendant cinq minutes chacune.

Lavez les embryons clairs à travers une série de gradients de glycérol de 25 %, 50 % et 75 % dans du PBS jusqu’à ce que chaque embryon soit installé au fond du tube. Conservez les embryons à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être visualisés au microscope. Pour monter les embryons à des fins de visualisation, utilisez une seringue d’un millilitre pour appliquer quatre points de 20 microlitres de graisse silicone transparente sur une lame de microscope aux coins d’une forme carrée de 15 millimètres.

Placez un embryon dans environ 200 microlitres de glycérol à 75 % entre les gouttes de graisse. Placez une lamelle sur l’embryon. Poussez doucement la glissière du couvercle vers le bas jusqu’à ce que la solution de glycérol se remplisse.

L’espace entre les gouttes d’embryons montés sur la graisse peut être stocké pendant quelques jours à quatre degrés Celsius avant d’être visualisé par microscopie confocale. Cette image montre un embryon de poisson-zèbre vivant exprimant la GFP sous le contrôle du neurogène. Dans un promoteur qui a été injecté avec un colorant traceur de fluorescéine en cage au stade d’une cellule en utilisant la méthode précédente au stade de trois à cinq acariens.

Une zone discrète des quatre cerveaux primordiaux a été photo-activée par un laser à deux photons et le colorant traceur de fluorescéine non caged a pu être détecté. Après la procédure de photo-activation, l’embryon a été incubé à 28,5 degrés Celsius, et les cellules cérébrales contenant la fluorescéine non en cage ont été tracées par immunocoloration anti-fluorescéine en rouge 24 heures après la fécondation. Une fois maîtrisée, la procédure d’activation photo peut être effectuée en quelques heures seulement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de contrôler les paramètres optimaux, permettant une activation photo précise à une résolution de cellule unique.